Orientador: Ione Salgado / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campoinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T04:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_HalleyCaixetade_D.pdf: 3949471 bytes, checksum: cf24197fabcb7bb0a920baa1ef786e63 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O controle da homeostase do óxido nítrico (NO), determinada pelo balanço entre os processos de síntese e degradação, é essencial para suas funções sinalizadoras. O presente estudo teve como objetivo geral buscar um melhor entendimento da homeostase do NO em plantas, enfocando a importância dessa molécula na bioenergética mitocondrial e na resposta de defesa vegetal ao ataque de patógenos. Inicialmente, foi realizada a caracterização de uma atividade de degradação de NO por mitocôndrias isoladas de tubérculos de batata, observando-se um consumo mitocondrial dependente de sua reação com o ânion superóxido, estimulado na presença de NAD(P)H. Ensaios com diferentes substratos e inibidores respiratórios evidenciaram as NAD(P)H desidrogenases externas, além do complexo III, como os principais sítios de geração de ânion superóxido para o consumo de NO. Por outro lado, numa análise comparativa com mitocôndrias isoladas de fígado de rato, uma atividade NAD(P)H oxidase mitocondrial não associada à cadeia respiratória foi detectada como uma fonte de superóxido, em adição ao vazamento de elétrons nos complexos I e III, para o consumo de NO. Em ambos os casos, a existência de mecanismos mitocondriais de degradação de NO mostrou-se importante para o controle de seus efeitos inibitórios sobre a atividade respiratória. Adicionalmente, a importância da síntese de NO para a defesa vegetal foi analisada utilizando-se como modelo a interação Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae. Trabalhos anteriores já haviam demonstrado que o mutante de A. thaliana duplo-deficiente para a nitrato redutase (nia1 nia2) apresenta reduzida produção de NO e susceptibilidade à P. syringae, o que poderia resultar de sua prejudicada assimilação de nitrogênio. No presente estudo, plantas nia1 nia2 foram cultivadas com glutamina ou arginina para aumentar os níveis foliares de aminoácidos. Entretanto, esse mutante continuou a desenvolver uma baixa emissão de NO e permaneceu susceptível à infecção bacteriana, indicando que a susceptibilidade não resulta do reduzido conteúdo de aminoácidos. Por outro lado, a fumigação com baixas concentrações do gás NO de plantas nia1 nia2 com os níveis de aminoácidos recuperados restabeleceu a resposta de resistência. Coerentemente, uma análise do perfil transcriptômico utilizando microarranjos de DNA mostrou que o tratamento com NO induziu diversos genes relacionados à defesa em folhas nia1 nia2 infectadas, como aqueles relacionados às vias de sinalização do ácido salicílico e do cálcio, as proteínas relacionadas à patogênese, a reorganização da parede celular e a síntese de compostos com atividade antimicrobiana. Ainda, essa análise indicou novos genes como potenciais alvos do NO, sugerindo aspectos até então desconhecidos do papel dessa molécula sinalizadora na interação fitopatogênica e na fisiologia vegetal. Em especial, destacou-se o possível envolvimento do NO na alteração de transcritos relacionados à sinalização hormonal de forma a permitir um controle atenuador de mecanismos da resposta de defesa. / Abstract: The control of nitric oxide (NO) homeostasis, determined by a balance between the rate of synthesis and degradation, is essential for its signaling functions. The present study aimed a better understanding of NO homeostasis in plants, focusing on the importance of this molecule in mitochondrial bioenergetics and in plant defense response to pathogen attack. Initially, we carried out a characterization of an NO degradation activity by mitochondria isolated from potato tubers, observing a superoxide-dependent NO consumption, that was stimulated in the presence of NAD(P)H. Assays with different respiratory substrates and inhibitors evidenced the external NAD(P)H dehydrogenases, in addition to complex III, as the main sites of superoxide anion generation for NO consumption. On the other hand, in a comparative analysis with mitochondria isolated from rat liver, a mitochondrial NAD(P)H oxidase activity, non-associated to the respiratory chain, emerged as a superoxide source, in addition to the electron leakage from complexes I and III, for NO consumption. In both cases, the existence of mitochondrial mechanisms of NO degradation was important for the control of its inhibitory effects on respiratory activity. Additionally, the importance of NO synthesis for plant defense was analyzed using the interaction Arabidopsis thaliana- Pseudomonas syringae as a model. Previous works have shown that the nitrate reductase double-deficient mutant of A. thaliana (nia1 nia2) presents reduced NO production and susceptibility to P. syringae, that could result from its impaired nitrogen assimilation. Here, nia1 nia2 plants were cultivated with glutamine or arginine to increase the leaf amino acid content. Despite this, this mutant continued to develop a low NO emission and remained susceptible to bacterial infection, indicating that the susceptibility does not result from reduced amino acid levels. On the other hand, the fumigation of amino acid-recovered nia1 nia2 plants with low concentrations of NO gas reestablished the resistance response. Accordingly, a transcriptomic analysis using DNA microarrays showed that NO treatment induced diverse defense-related genes in infected nia1 nia2 leaves, as those associated to salicylic acid and calcium signaling pathways, pathogenesis-related proteins, cell wall reorganization and synthesis of antimicrobial compounds. Additionally, this analysis indicated new genes as potential targets of NO action, suggesting previously unknown aspects about the role of this signaling molecule in phytopathogenic interactions. In special, we can highlight the possible involvement of NO in the modulation of transcripts related to hormonal signaling in order to allow an attenuating control of certain mechanisms of the defense response. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Marcelo Rocha Marques / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba. / Made available in DSpace on 2018-08-20T06:47:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camargo_Glauciade1985-_M.pdf: 1041410 bytes, checksum: aba09e2e49414c9f9f0be4938f591a70 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A periodontite crônica é uma doença inflamatória que leva à perda de inserção de elementos dentários, e é desencadeada e mantida por um biofilme subgengival periodontopatogênico. A presença de alguns tipos de lipopolissacarídeos (LPS), derivados de bactérias no sítio periodontal doente, pode iniciar uma sinalização por meio das células do tecido gengival, que culminará com um microambiente com diferentes células do sistema imune e com uma alteração no padrão de expressão de citocinas inflamatórias. Já foi evidenciado que no tecido gengival de pacientes com periodontite crônica, genes que codificam receptores celulares para o LPS, podem sofrer alterações epigenéticas. O objetivo deste estudo foi avaliar se a periodontite crônica e o LPS bacteriano derivado de P. gingivalis podem modular a expressão gênica de alguns fatores reguladores de eventos epigenéticos. Biópsias de tecido gengival inflamado e sem inflamação foram coleados de pacientes com periodontite crônica e de pacientes saudáveis respectivamente, o RNA total foi extraído e a expressão dos genes DNMT1 (DNA metiltransferase 1), DNAMT3a (DNA metiltransferase 3a), histona demetilase JMJD3 e histona demetilase UTX foram analisadas por meio de RT-PCR quantitativo. Fibroblastos gengivais humanos derivados de cultura primária, e queratinócitos (HaCaT) foram expostos a LPS de P. gingivalis ou ao veículo do LPS, e foram avaliadas a viabilidade celular por meio do teste MTT e a expressão gênica de DNMT1, DNMT3a, JMJD3 e UTX por meio de RT-PCR quantitativo. As análises dos resultados demonstraram que nem a periodontite e nem o LPS exposto a fibroblastos gengivais foram capazes de modular a expressão dos genes estudados. Contudo, o LPS promoveu a diminuição da expressão de DNMT1, DNMT3a e JMJD3 nas células HaCaT. Pode-se concluir que LPS derivado P. gingivalis pode modular, em queratinócitos, a expressão gênica de algumas enzimas promotoras de eventos epigenéticos / Abstract: The aim of this study was to assess whether P. gingivalis LPS can modulate, in culture of the human keratinocytes and human gingival fibroblasts, gene expression levels of the some enzymes that promote epigenetic events. In addition, the same enzymes were evaluated in sample from healthy and periodontitis affected individuals. Primary gingival fibroblast culture and keratinocytes (HaCaT) were treated with medium containing P. gingivalis LPS or P. gingivalis LPS vehicle for 24hs. After this period, cell viability were assessed by MTT test, and total RNA were extracted to evaluate gene expression levels of the enzymes: DNMT1 (DNA methyltransferase 1), DNMT3a (DNA methyltransferase 3a), histone demethylases JMJD3 and UTX, by qRT-PCR. To evaluate the gene expression in healthy and periodontitis affected individuals, total RNA was extracted from biopsies of gingival tissue from sites with (periodontitis) or without periodontitis (healthy), and gene expression of DNMT1, DNAMT3a, JMJD3 and UTX were evaluated by qRT-PCR. No significant differences were found in the gene expression analysis between healthy gingival tissues and gingival tissue from periodontitis sites. The results showed that LPS downregulated DNMT1 (p<0.05), DNMT3a (p<0.05) and JMJD3 (p<0.01) gene expression in HaCaT cells, but no modulation was found to gingival fibroblasts. P. gingivalis LPS exposure to keratinocytes, downregulates gene expression of the enzymes that promote epigenetic events / Mestrado / Histologia e Embriologia / Mestre em Biologia Buco-Dental

Orientador: Jaime Amaya-Farfán / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-19T05:36:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gasparetto_Daniela_M.pdf: 1174438 bytes, checksum: 483c9894a40b10e40510410a552369a3 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: As proteinas do soro de leite possuem alto valor nutritivo, sendo, portanto, extensamente estudadas em diversas areas do saber. A equipe do Laboratorio de Fontes Proteicas vem estudando a associacao entre o consumo do hidrolisado de proteina do soro de leite e seus efeitos biologicos e nutricionais, em varios niveis de atividade fisica. Seu consumo tem sido associada a diminuicao do estresse metabolico, reducao nos niveis de lactato, aumento das reservas de glicogenio muscular, maior estabilidade da albumina serica e melhora nos tempos de exaustao do animal treinado. Este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito do consumo do hidrolisado de soro de leite no estado metabolico redox do rato e na utilizacao de lipideos pelo organismo como fonte de energia durante a atividade fisica. Ratos Wistar machos foram divididos em 3 grupos de dieta: Padrao (AIN 93-G, dieta elaborada com caseina), Controle (AIN 93-G, elaborada com concentrado de proteinas do soro de leite) e Experimental (AIN 93-G, elaborada com hidrolisado de proteinas do soro de leite). Cada dieta foi subdividida em 4 grupos (n = 7): sedentarios, sedentarios-exaustos, treinados e treinados-exaustos. O hidrolisado apresentou maior poder antioxidante in vitro, do que o concentrado e tres fracoes do soro, ?-lactalbumina, ?-lactoglobulina e albumina serica bovina. O consumo das proteinas do soro de leite, hidrolisadas ou nao, aumentou a concentracao de triptofano no sangue e de BCAAs livres no musculo, alem de 10 outros aminoacidos analisados. Porem, reduziu o nivel de alanina aminotransferase serica. A enzima tambem teve sua concentracao reduzida pelo treinamento fisico enquanto que a exaustao aumentou-a. Contrariamente, o exercicio continuo aumentou os niveis de acidos graxos livres sericos, ao passo que a exaustao os diminuiu. Ambas as variaveis, por sua vez, elevaram nao somente a temperatura muscular, mas tambem o nivel de 15 aminoacidos musculares livres e a concentracao de triacilglicerois sericos. O treinamento possibilitou que os animais treinado-exaustos apresentassem tempos ate a exaustao mais longos que os sedentarios-exaustos. A exaustao tambem aumentou a concentracao de nove aminoacidos sericos (dentre eles BCAAs, Ala e Gln). O treinamento, bem como a exaustao e a dieta não interferiram na expressao dos genes PPAR a, PPAR d, PGC 1a, CPT 1ß e miostatina no musculo. Nao foram constatadas alteracoes no consumo, peso do tecido adiposo, lactato sanguineo, glutationa reduzida, alem dos parametros sericos: creatinina, aspartato aminotransferase, albumina, corticosterona e acido urico. Os resultados deste trabalho sugerem haver poucas diferencas entre as dietas formuladas com proteinas do soro de leite. Porem, eles tambem sugerem que o nivel de atividade a ser empregado em ensaios biologicos deva ser criteriosamente definido / Abstract: There is extensive research on whey proteins because of its particularly high level of nutritive value. The Protein Sources Laboratory team has studied the relationship between the intake of hydrolyzed whey protein and its biological and nutritional effects at several levels of physical exercise. It has been observed that time to exhaustion is improved, serum lactate levels and metabolic stress are reduced, muscle glycogen stores are increased, and serum albumin levels are preserved. This work aimed at assessing the effects of consuming the hydrolyzed whey proteins on the metabolic redox state and the utilization of lipids as energy during physical exercise. Male Wistar rats consumed 3 diets: Experimental (AIN 93-G, prepared with hydrolyzed whey protein), Control (AIN 93-G, prepared with concentrate whey protein) and Standard (AIN 93-G). Each diet was further grouped into 4 cases (n = 7): sedentary, exhausted-sedentary trained and exhausted-trained. The hydrolyzed whey protein presented a greater antioxidant effect in vitro, than the concentrate, and its main protein components. Both the hydrolyzed and unhydrolyzed whey protein increased the tryptophan blood concentration as well as the free BCAA muscle concentration, in addition to ten other amino acids. Moreover, it reduced the serum alanine aminotransferase level. Physical training also reduced its concentration, whereas exhaustion increased it. On the other hand, continuous physical exercise increased free fatty acids levels, whereas exhaustion decreased it. Moreover, both variables increased not only the muscle temperature but also 15 muscle amino acids levels as well as the triacylglycerols levels. Training led to longer time to exhaustion of the trained-exhausted than to sedentaryexhausted. Exhaustion also increased the concentration of nine serum amino acids (among them BCAAs, Ala e Gln). Both training and exhaustion, and diet had no affect on the gene expression of PPAR a, PPAR d, PGC 1a, CPT 1ß and myostatin in the muscle. No effect was observed for food intake, adipose tissue mass, blood lactate, reduced glutathione as well as serum parameters: creatinine, aspartate aminotransferase, albumin, corticosterone, uric acid. These findings indicated that there are few differences between the whey-protein based diets. However, they do point out that some level of activity should also be taken into account during the biological experiments / Mestrado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Mestre em Alimentos e Nutrição