Bakgrund: Lungcancer är en av de cancerformer med sämst prognos, vilket delvis förklaras av sen diagnos. Potentiellt kan cirkulerande extracellulära vesiklar, som diagnoskälla och screeningverktyg, möjliggöra tidigare diagnostik och därmed förbättra den annars dåliga prognosen. Syfte: Syftet var att undersöka om det är möjligt att, genom kvantifiering av extracellulära vesiklar, urskilja malign från benign lungsjukdom samt lungsjuka från friska. Vesiklarna isolerades med akustik för att bedöma dess användbarhet som framtida diagnostiskt verktyg. Metoder: Plasmaprover togs från forskningspersoner med malign (n =5) respektive benign (n=5) lungsjukdom samt frisk kontrollgrupp (n = 10). Grupperna med malign och benign lungsjukdom matchades utifrån kön, ålder (åldersspann ± 1 år) och rökstatus (fyra av fem par matchade). Vesiklarna isolerades genom akustik med AcouTrap och analyserades därefter med Nanoparticle Trackning Analysis (NTA). Resultat: Repeterbarheten uttryckt i variationskoefficienten (CV) vid isolering med AcouTrap hade medelvärdet 18,3% gällande koncentration och 3,7% gällande storlek medan NTA-analys hade medelvärdet 12,9% gällande koncentration och 3,2% gällande storlek. Mediankoncentrationen hos lungsjuka var 4,7x1013 partiklar/ml jämfört med 5,1x1012 partiklar/ml hos friska individer (p=0,005). Medianstorleken vid malign lungsjukdom var 74,4 nm jämfört med 68,0 nm vid benign lungsjukdom (p=0,08). Slutsatser: Trots det fåtal patientprover som analyserats observerades en statistiskt signifikant skillnad i antalet extracellulära vesiklar mellan lungsjuka och friska samt en icke-signifikant trend som visade större partiklar hos de med malign lungsjukdom än benign lungsjukdom. Akustik som isoleringsmetod av extracellulära vesiklar hade hög repeterbarhet och således kan metoden bli ett bra framtida kliniskt verktyg.

Extracellular vesicles are important players in cell-to-cell communication and have the potential to be used as biomarkers for decease. The mechanical properties of extracellular vesicles is an active field of research, with new methods and models being developed. In this thesis, two samples of extracellular vesicles containing different levels of membrane protein expressions are investigated using atomic force microscopy. Three models for determining stiffness are applied to the samples: the Hertz model, an adhesion angle dependent model, and the modified Canham-Helfrich model. The Hertz model indicated a higher Young’s Modulus for vesicles without membrane proteins, but with large errors. The adhesion angle dependent model did not provide high enough sensitivity to determine any difference in stiffness between the two samples. The modified Canham-Helfrich model indicated a higher bending modulus for the vesicles with membrane proteins. The results highlight the importance of taking several measurements on each vesicle, in contrast to how the method is currently applied in research. / Extracellulära vesiklar är essentiella komponenter inom cell-till-cell-kommunikation, och har potentialen att kunna användas som sjukdomsmarkörer. Extracellulära vesiklars mekaniska egenskaper är ett aktivt forskningsfält där nya experimentella metoder och teoretiska modeller är under utveckling. I den här arbetet används atomkraftsmikroskopi för att undersöka de mekaniska egenskaperna av två prover av extracellulära vesiklar med olika mängd membranproteiner. Tre modeller för att utvärdera deras styvhet tillämpas: Hertz-modellen, en adhesionsvinkelberoende modell, och den modifierade Canham-Helfrichmodellen. Hertz-modellen indikerade högre elasticitetsmodul för provet med lägre antal membranprotein, men med stora fel i mätningarna. Den adhesionsvinkelbaserade modellen var inte känslig nog att påvisa några skillnader i styvhet mellan proverna. Den modifierade Canham-Helfrich-modellen indikerade att vesiklarna med membranprotein har högre böjmodul än veiklarna utan membranprotein. Resultaten understryker att det är viktigt att göra flertalet mätningar på varje vesikel, i kontrast mot hur modellen tillämpas i dagsläget.

Extracellular vesicles (EVs) are lipid bilayer encapsulated nanoparticles which have emerged as an excellent source of biomarkers for multiple diseases, including cancer. However, they are highly heterogeneous in their molecular compositions which remains a major challenge hindering the utilization of their biomarker potential. A single-EV analysis is essential to both discovery and detect EVs that carry disease-specific signature. In this work, we designed plasmonic nanohole array for capturing single EVs and perform fluorescence detection of their membrane proteins by exploiting plasmonic amplification of the fluorescence signal. The design of the array was optimized using COMSOL Multiphysics-based simulation. Nanohole arrays with three different periodicities were fabricated on aluminum thin film on glass substrate. The substrates were then functionalized with three different methods for investigation of antibody-free capturing techniques, which are electrostatic interaction, hydrophobic interaction, and size-selective capturing. After surface functionalization with each of the techniques, genetically engineered EVs expressing mNeonGreen (mNG) were incubated and their capture efficiency were compared. The presence of single-EVs within plasmonic nanoholes was verified through both fluorescence analysis and atomic force microscopy (AFM). Fluorescence intensities of mNG-EVs recorded with the plasmonic chip with different periodicities showed intensity variations in agreement with the simulation results. Furthermore, the EVs were immunostained with R-phycoerythrin (R-PE) conjugated CD-9 to demonstrate the possibility of general and multimarker fluorescence detection. In a separate experiment, DOPC liposomes were synthesized and their deformability was analyzed by using AFM. The nanohole array provides a basis for a future platform of EV analyses, promising to capture the signature arising from low expressing proteins. / Extracellulära vesiklar (EV) är lipadmembranförsedda nanopartiklar som har dykt upp som en utmärkt källa till biomarkörer för flera sjukdomar, däribland cancer. De är dock mycket heterogena i sina molekylära sammansättningar, vilket skapar en stor utmaning och hindrar utnyttjandet av deras potential som biomarkörer. EV-analys på enpartikelnivå är nödvändig både för att upptäcka och detektera vesiklar som har en sjukdomsspecifik signatur. I detta arbete designade vi en plasmonisk uppsättning av nanohål för att fånga enstaka EVs och utföra fluorescensdetektion av deras membranproteiner genom att utnyttja plasmonisk amplifiering av fluorescenssignaler. Designen av uppsättningen optimerades med hjälp av COMSOL Multiphysics-baserad simulering. Nanohålsuppsättningar med tre olika periodiciteter tillverkades på tunn aluminiumfilm på glassubstrat. Substraten funktionaliserades sedan enligt tre olika metoder för undersökning av antikroppsfria bindningsmetoder. De tre metoderna är elektrostatisk interaktion, hydrofob interaktion och storleksselektiv bindning. Efter ytfunktionalisering med var och en av teknikerna inkuberades vesiklar genetiskt modifierade att uttrycka mNeonGreen (mNG) och deras bindningseffektivitet jämfördes. Närvaron av individuella EVs i plasmoniska nanohål bekräftades genom både fluorescensmikroskopi och atomkraftsmikroskopi (AFM). Fluorescensintensiteter för mNG-EVs registrerades med plasmonchipet med olika periodiciteter och visade intensitetsvariationer i överensstämmelse med simuleringsresultaten. Dessutom immunfärgades vesiklarna med R-fykoerytrin (R-PE) konjugerad CD-9 för att påvisa möjligheten till allmän och multimarkör fluorescensdetektion. I ett separat experiment syntetiserades DOPC-liposomer och deras deformerbarhet analyserades med AFM. Nanohåluppsättningen lägger grund för en framtida plattform för EV-analys, som lovar att fånga signaturen som uppstår från låguttryckande proteiner.