Orientador: Domingos da Silva Leite / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T11:06:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Valadares_GeorgioFreesz_D.pdf: 5633139 bytes, checksum: eb53d324f81f52cd2327efa730c3e888 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Infecções por Escherichia coli são freqüentes em animais domésticos, afetando principalmente animais recém nascidos e no período do pós-desmame, sendo responsáveis por importantes danos econômicos na suinocultura e pecuária de bovinos e ovinos. A instalação da bactéria ao hospedeiro se dá através da colonização, processo mediado por proteínas denominadas adesinas, que se encontram distribuídas por toda a superfície bacteriana. Estas apresentam uma grande variedade morfológica e são coletivamente chamadas de Fatores de Colonização (FCs). Neste trabalho identificamos um novo fator de colonização (FC O25) presente em cepas de Escherichia coli isoladas de casos de colibacilose neonatal bovina, que apresenta semelhanças antigênicas com os FCs F4(K88), CS31A e F41 sem, contudo, apresentar identidade genética com estes fatores em ensaios de PCR. Baseados nessas homologias, investigamos a hipótese do FC O25 pertencer a esta família de FCs. Estudamos a seqüência do gene que compõe a subunidade principal do FC O25 com base em semelhanças com genes dos fatores de colonização homólogos e encontramos o FC O25 presente em 35 das 41 cepas em estudo. Verificamos que a proteína FC O25 apresenta 49,7% de homologia com a proteína FaeG (F4), 35,4% com ClpG (CS31A) e 29,4% com FimF41. Com ferramentas de bioinformática determinamos a relação filogenética entre essas proteínas e a estrutura secundária do FC O25. Os estudos de extração de DNA genômico e plasmidial indicaram que o gene FC O25 deve estar localizado no cromossomo bacteriano. Este foi clonado no vetor de expressão pET-151, inserido na linhagem de E.coli BL21[DE3]-Star e a proteína do FC O25 foi obtida e purificada e antissoro policlonal monoespecífico foi obtido em coelho. A proteína do FC O25 purificada foi submetida a ensaios de Western Blotting frente a antissoros anti os FCs F4, F41 e CS31A e verificamos reconhecimento da proteína em diferentes graus. A cepa CG1905-B foi utilizada em ensaios de microscopia eletrônica de transmissão com marcação por anticorpos conjugados com ouro e verificamos que a estrutura do FC O25 é do tipo fibrilar assemelhando-se à estrutura do CS31A. Em ensaios de adesão a linhagens de células eucarióticas in vitro observamos adesão às células Caco-2 (carcinoma de cólon humano) e que esta adesão era inibida pelo antissoro anti-FC O25. Os resultados sugerem que o FC O25 pode ser importante para a patogenicidade das E. coli bovinas no Brasil, uma vez que encontramos uma associação deste com outros fatores de colonização e, sobretudo com toxinas relacionadas com a patogenia em bovinos, evidenciando novas relações entre mecanismos de virulência que merecem novas investigações, além da própria elucidação completa da estrutura do operon FC O25 / Abstract: Infections from Escherichia coli are frequent in domestic animals, affecting mainly newborn animals in the post weaning period, being thus responsible for important economic losses in the cattle, porcine and lamb herds. The establishment of the bacterium in the host is made by colonization and it is a process mediated by proteins called adhesins that are distributed along the bacterial surface. They present a great morphological variety and are called Colonization factors (CFs). Our objective in this work was to identify the new colonization factor (CF O25) in Escherichia coli strains isolated from bovine neonatal colibacillosis, this CF O25 presents antigenic similarities with the FCs F4(K88), CS31A and F41 without, however, present genetic identity to these factors in PCR assays. Based in these homologies, we investigated the hypothesis of the NFC be a member of this "family" of CFs. So we studied the sequence of the CF O25¿s main subunit gene and its similarities with the genes of the homologous CFs (F4, F41 and CS31A) in polymerase chain reaction (PCR) assays. We found the CF O25 in 35 of the 41 studied strains. Through DNA sequencing, we verified that CF O25 protein presents 49.7% of homology with FaeG protein (F4), 35.4% with ClpG (CS31A) and 29.4% with FimF41. Using bioinformatics tools we determined the phylogenetic relationships between these proteins and the secondary structure of the CF O25. The genomic and plasmid DNA extraction assays indicates that the CF O25 gene is located in the bacterial chromosome. The CF O25 gene was cloned in the pET-151 expression vector, inserted in the E.coli BL21[DE3]-Star strain and the CF O25 protein was over expressed, purified and monospecific antiserum was obtained in rabbits. The purified CF O25 protein was submitted to Western Blotting assays with antissera against the FCs F4, F41 and CS31A and we verified recognition of the CF O25 in different degrees. The CG1905-B strain was used in the assays of electronic transmission microscopy using immunogold. The structure of the PCF is fibrillar resembling it the structure of the CS31A. This strain also was submitted the assays of adhesion to the eukaryotic culture cells and we observed adhesion to the Caco-2 cells (human colon carcinoma), this adhesion could be inhibited by anti-CFO25 antiserum. Our results suggest that the CF O25 can be important for the bovine pathogenicity of E. coli in Brazil, since we found CF O25 associated with other colonization factors and toxins, related with patogenicity in bovines, evidencing new relationships between virulence mechanisms that deserve new investigations, as well the elucidation of the complete structure of CF O25 operon / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

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