El presente trabajo de tesis estudia diferentes mutantes zeste1 y el efecto que esta mutación tiene sobre la regulación de la transcripción en diversos genes. En primer lugar se estudiaron los machos de las cepas M115 y RM115 cuya característica principal, además de ser portadores de la mutación z1, es la inserción de un elemento FB-NOF en el tercer intrón del gen CG32795, que forma con white un par de genes head-to-tail. Para estudiar el efecto de la inserción de FB-NOF en un entorno z1, fue necesario en primer lugar caracterizar el gen CG32795, a nivel de secuencia del mRNA y de predicción de la posible función de la proteína codificada. Se encontraron diversas variantes de splicing, tanto para su extremo 5' como para el 3', parecidas pero diferentes de las variantes predichas anteriormente. Conociendo más en profundidad este gen, nos propusimos estudiar los posibles efectos de la inserción de FB-NOF respecto a la expresión de los genes w y CG32795. Los resultados nos llevaron a un estudio más detallado de la expresión de w en diferentes partes del cuerpo, teniendo en cuenta la especificidad de tejido que la interacción zeste-white presenta. Así, demostramos que el gen w no se ve afectado por la inserción de FB-NOF en su extremo 3' y que las diferencias de expresión observadas son debidas a la duplicación del Zeste Binding Site de w en un entorno z1. Sin embargo, la inserción de FB-NOF en el tercer intrón de CG32795 si modifica la expresión de este gen. La inserción no es sólo responsable de la alteración de la expresión de CG32795 sino también la reordenación que se produce en la cepa RM115 eliminando la copia de w original y dejando la que se duplicó en M115.La segunda parte de esta tesis estudia las hembras mutantes z1. Analizamos la expresión de dos genes con un ZBS (w y dpp) y observamos como se reduce la expresión de dichos genes en las hembras z1. Además, estudiando la expresión del gen CG32795 constatamos que el efecto de la interacción zeste-white es local, sin afectar a CG32795 aunque su extremo 5' se encuentra a tan solo 700bp del extremo 3' del gen w. La reducción de la expresión podría ser debida a alteraciones en la estructura de la cromatina, puesto que los agregados de Zeste en los ZBS son los responsables de reclutar el complejo remodelador de la cromatina BRM, facilitando así la transcripción. Mediante un ensayo de nucleasa micrococal detectamos algunas modificaciones en el posicionamiento de nucleosomas en los ZBS de w y dpp, siendo el posicionamiento en las hembras z1 más estricto. Si el complejo BRM es el responsable de estas diferencias, los patrones de metilación también podrían verse alterados, pues muchos factores asociados a los complejos SWI/SNF se han relacionado con actividades de regulación de la expresión mediante modificación de los mismos. Mediante el ensayo de modificación del DNA por bisulfito sódico estudiamos los patrones de metilación de cinco regiones. Sorprendentemente, el ZBS de w y de dpp, así como las regiones próximas a ellos, se encontraban hipometilados en las hembras z1. El desconocimiento general sobre la metilación en D. melanogaster nos hizo plantear cuales pueden ser las secuencias diana de la metilación en esta especie. Así realizamos un estudio estadístico sobre cuales son las dos bases anteriores y posteriores a las Cs metiladas en nuestras secuencias. Se obtuvieron diferencias en las frecuencias de cada posición y se estableció como secuencia más frecuente para ser metilada ApDp5mCpDpD. Aún así, es una secuencia muy degenerada, y se hacen necesarios estudios más profundos y amplios para confirmarla. / The present PhD thesis studies several zeste1 mutants and this mutation effect over the transcriptional regulation of some genes. The first part is based on the study of the males of M115 and RM115 strains, mainly characterized by the z1 mutation and the insertion of a FB-NOF element in the third intron of the CG32795 gene, known to form a head-to-tail gene pair with white. To study the FB-NOF insertion effect on a z1 background firstly we need to characterize the CG32795, its mRNA sequence and the codified protein predicted structure and function. Several splicing variants were found, not only for its 5' end but also for its 3'end, similar but different from the ones been predicted previously. Once obtained this information we proceeded to study the effects of the FB-NOF insertion over the w and the CG32795 gene expression. The results lead us to a deeper study of the w expression in different body segments, taking into account the zeste-white interaction tissue specificity. Thus, we proved that the w gene expression is not affected by the FB-NOF insertion downstream of its 3' end. The differences observed in the w expression levels were due to the duplication of the w Zeste Binding Site in a z1 background. On the contrary, the FB-NOF insertion not only does modify CG32795 expression, but also mediates the reordenation produced in the RM115 strain being responsible of the w original copy lost and leaving alone the w copy duplicated in the M115 strain.The second part studies the z1 female mutants. We analyzed the expression of two genes possessing a ZBS (w and dpp). The results obtained showed an expression reduction for both genes in the z1 females. Moreover, through the study of the CG32795 gene expression we showed that the zeste-white interaction effect is local, not having any effect on CG32795 expression even though its 5' end is located at only 700bp from the w gene 3' end. Knowing that the Zeste aggregates in the ZBS recruit the chromatin remodelling complex BRM, facilitating thus transcription, we thought that the expression reduction might occur due to chromatin structure alterations. A micrococal nuclease assay was performed and some modifications in nucleosome positioning were found in w and dpp ZBS, being the positioning in the z1 females stricter. Were the BRM complex responsible of those differences, the DNA methylation patterns might also be changed, since many SWI/SNF associated factors have been related to expression regulation duties through DNA methylation patterns modification. A bisulphite modification assay was performed, studying the DNA methylation pattern of five different regions. Surprisingly, w and dpp ZBS and the regions surrounding them were hypomethylated in the z1 females. The little information available about DNA methylation in D. melanogaster encouraged us to study the DNA methylation sites in this specie. Our sequences were statistically analyzed including the two bases before and after the methylated cytosine. The results showed differences in the each nucleotide frequency in each position. The preferently methylated "consensus sequence": ApDp5mCpDpD. However, it is a much degenerated sequence and deeper and broader studies are required to confirm it.

El presente trabajo trata sobre dos temas coyunturalmente relacionados: el fenotipo de las cepas M115 y RM115 de Drosophila melanogaster y el elemento transponible FB-NOF.La cepa M115 de D. melanogaster presenta el fenotipo zeste1 ampliado a los machos. Este fenotipo se caracteriza por los ojos de color amarillo claro y, aunque normalmente se presenta en hembras pues es necesario el apareamiento de dos copias del gen white para producirse, puede observarse en machos portadores de duplicaciones de white. Es la conocida interacción zeste-white. M115 es una cepa inestable y se pueden encontrar individuos revertientes de forma regular. Un macho revertiente dio lugar a la cepa RM115. Este par de cepas son fenotípicamente parecidas a las descritas por la Dra. Rasmuson-Lestander, w+UZ y w+UR.Siguiendo los pasos de Rasmuson-Lestander en la caracterización de w+UZ y w+UR, identificamos la inserción de un elemento transponible FB-NOF en nuestras cepas M115 y RM115, pocas kilobases a 3' del gen white. Aunque el punto de inserción es exactamente el mismo que en las cepas de Rasmuson-Lestander, nuestros experimentos de Southern Blot demuestran que se trata de inserciones distintas, lo cual plantea si esa región podría ser un hot spot de integración para FB-NOF. Al llevar el análisis un paso más adelante, encontramos que las cepas de ojos amarillos, M115 y w+UZ, eran portadoras de una duplicación del gen white, que explica el fenotipo ampliado a los machos. La reversión en RM115, por su parte, consiste en la deleción de una de las dos copias del gen. Así pues, debemos descartar las hipótesis de Rasmuson-Lestander que apuntaban a la interferencia de FB-NOF en la interacción zeste-white.El elemento transponible FB-NOF es uno de los menos conocidos de D. melanogaster. Dio origen al grupo de transposones denominados foldback por su estructura modular repetitiva y se desconocen los detalles de su biología. En este trabajo proponemos una forma más sencilla de estructurar el elemento que facilita su estudio, sobretodo a partir de secuencias genómicas. Además, analizamos su distribución en el genoma de D. melanogaster, la relación entre las secuencias que lo integran y la expresión de su secuencia codificante. Los resultados de dicho análisis revelan que FB-NOF funciona como un solo transposón con un sesgo en sus preferencias de inserción y que se mantiene activo en la actualidad. / The subject of the present thesis focuses on two related issues: the phenotype of the mutant strains M115 and RM115 from Drosophila melanogaster and the transposable element FB-NOF.The D. melanogaster strain M115 presents an extended zeste1 phenotype to both males and females. This phenotype confers a pale yellow color in the eyes and, however it is usually seen only in females since it is necessary to have paired copies of the white gene, this phenotype can also be observed in males carrying a white duplication. This is known as the zeste-white interaction. M115 is an unstable strain and one can find revertant flies regularly. A revertant male established the so-called RM115 strain. These two strains are phenotipically similar to those described by Dr. Rasmuson-Lestander, w+UZ and w+UR.Following Rasmuson-Lestander's steps in the characterization of w+UZ and w+UR, we identified the insertion of an FB-NOF transposable element in M115 and RM115, just few kilobases downstream the white gene's coding region. Despite the insertion point is exactly the same in both sets of strains, ours and Rasmuson-Lestander's, our Southern blot analysis demonstrate that the two insertions are different. This suggests we could have found a hot spot for the FB-NOF integration. Taking our analysis a step further, we found that the yellow-eyed strains, M115 and w+UZ, carried a white gene duplication, which is the main cause for the male extended zeste1 phenotype. Reversion of the phenotype consists in deletion of one of the two copies of the gene. Therefore, we must discard Rasmuson-Lestander's hypothesis pointing to an FB-NOF interference in the zeste-white interaction as the main cause of the extended phenotype.The FB-NOF transposable element is one of the less known in D. melanogaster. It established the group called foldback transposons due to its modular and repetitive structure, and its biology still remains unknown. In this thesis, we propose a simplest way to arrange the element's sequence to make its study from genomic sequences easier. Moreover, we analyze its distribution in the D. melanogaster's genome, the relationship between the sequences that compose it and the expression of the coding regions within. The results from this analysis reveal that FB-NOF behaves as a single transposon, with a bias in its insertion preferences and it is still active at the present time.