A FBXO25 é parte de uma E3 ligase do tipo RING, (Really Interesting New Gene), oligomérica do tipo SCF, responsável pelo reconhecimento específico do substrato a ser degradado via Sistema Ubiquitina-Proteassoma (SUP). O SUP é o principal mecanismo proteolítico intracelular, responsável pela degradação de 80-90% das proteínas citosólicas e nucleares. A FBXO25 é capaz de formar um complexo SCF1 ativo (formado pela interação das proteínas Skp1, Cul1, Roc1 e uma proteína do tipo F-box), capaz de ubiquitinar seus substratos. Essa proteína se acumula no núcleo celular formando uma nova estrutura subnuclear denominada FANDs (FBXO25 Associated Nuclear Domains) que estão envolvidos na ubiquitinação nuclear. Nesse trabalho, purificamos complexos SCF1 (WT ou sem o domínio de interação com Skp1 (F)), tratados ou não com PMA, pela técnica de imunoprecipitação. Identificamos por espectrometria de massas um sítio de fosforilação essencial para FBXO25, quando células transfectadas são tratadas com o mitógeno PMA. Buscamos também por substratos diferencialmente ubiquitinados por esses complexos, por meio de ensaios em ProtoArrays®, identificando substratos envolvidos na via de sinalização ERK1/2. / The FBXO25 is an E3 ligase RING type (Really Interesting New Gene), SCF oligomeric type, responsible for the specific recognition of the substrate to be degraded via the ubiquitin-proteasome system (SUP). SUP is the main intracellular proteolytic mechanism responsible for 80-90% degradation of cytosolic and nuclear proteins. The FBXO25 is capable of forming a complex SCF1 (formed by the interaction of proteins Skp1, Cul1, Roc1 protein and a type F-box), resulting in an active SCF complex which is able to ubiquitinate their substrates. This protein accumulates in the nucleus forming a subnuclear structure called FANDs (FBXO25 Associated Nuclear Domains) that are involved in nuclear ubiquitination. In this work, we purify complex SCF1 (WT or F- box, which is not able to interact with Skp1), treated or not with PMA, by immunoprecipitation technique. We identified by mass spectrometry, an essential phosphorylation site for FBXO25, when it is phosphorylated under the action of the mitogenic reagent PMA. We also search for differentially ubiquitinated substrates for these complexes, by testing in ProtoArrays® identifying substrates involved in the signaling pathway ERK1 / 2.

A FBXO25 é parte de uma E3 ligase do tipo RING, (Really Interesting New Gene), oligomérica do tipo SCF, responsável pelo reconhecimento específico do substrato a ser degradado via Sistema Ubiquitina-Proteassoma (SUP). O SUP é o principal mecanismo proteolítico intracelular, responsável pela degradação de 80-90% das proteínas citosólicas e nucleares. A FBXO25 é capaz de formar um complexo SCF1 ativo (formado pela interação das proteínas Skp1, Cul1, Roc1 e uma proteína do tipo F-box), capaz de ubiquitinar seus substratos. Essa proteína se acumula no núcleo celular formando uma nova estrutura subnuclear denominada FANDs (FBXO25 Associated Nuclear Domains) que estão envolvidos na ubiquitinação nuclear. Nesse trabalho, purificamos complexos SCF1 (WT ou sem o domínio de interação com Skp1 (F)), tratados ou não com PMA, pela técnica de imunoprecipitação. Identificamos por espectrometria de massas um sítio de fosforilação essencial para FBXO25, quando células transfectadas são tratadas com o mitógeno PMA. Buscamos também por substratos diferencialmente ubiquitinados por esses complexos, por meio de ensaios em ProtoArrays®, identificando substratos envolvidos na via de sinalização ERK1/2. / The FBXO25 is an E3 ligase RING type (Really Interesting New Gene), SCF oligomeric type, responsible for the specific recognition of the substrate to be degraded via the ubiquitin-proteasome system (SUP). SUP is the main intracellular proteolytic mechanism responsible for 80-90% degradation of cytosolic and nuclear proteins. The FBXO25 is capable of forming a complex SCF1 (formed by the interaction of proteins Skp1, Cul1, Roc1 protein and a type F-box), resulting in an active SCF complex which is able to ubiquitinate their substrates. This protein accumulates in the nucleus forming a subnuclear structure called FANDs (FBXO25 Associated Nuclear Domains) that are involved in nuclear ubiquitination. In this work, we purify complex SCF1 (WT or F- box, which is not able to interact with Skp1), treated or not with PMA, by immunoprecipitation technique. We identified by mass spectrometry, an essential phosphorylation site for FBXO25, when it is phosphorylated under the action of the mitogenic reagent PMA. We also search for differentially ubiquitinated substrates for these complexes, by testing in ProtoArrays® identifying substrates involved in the signaling pathway ERK1 / 2.

A proteína FBXO25 é uma E3-ligase do tipo SCF, responsável pela seletividade da ligação da Ub à proteína substrato e pelo direcionamento da proteína marcada para o barril proteassomal 26s. Sabe-se que FBXO25 é capaz de interagir e ubiquitinar a proteína Elk-1 em células HEK293T e, assim, inibir a expressão de genes importantes na regulação da proliferação celular, como C-FOS e EGR-1, após estímulo com o mitógeno PMA. Aqui mostramos que FBXO25 atua em um outro ponto da via das MAPKs, modulando os níveis de fosforilação de ERK1/2. Por meio da utilização de células nocaute para FBXO25 (FBXO25KO) foi possível observar que o tratamento com PMA promoveu aumento dos níveis de fosforilação de ERK1/2 nestas células quando comparadas com sua linhagem parental. Observouse também que o estímulo com os mitógenos PMA ou ATP levou a um aumento da proliferação celular não relacionada à modulação direta do ciclo celular nas células nocautes, sendo que estas apresentaram uma redução significativa dos seus níveis de apoptose. Tomando esses resultados em conjunto, mostramos que FBXO25 atua sobre a sinalização de MAPK por meio de redução da ativação ERK1/2 e, dessa forma, promove uma resposta secundária sobre o fenótipo de proliferação celular / The FBXO25 protein is an SCF-type E3-ligase responsible for the selectivity of Ub binding to the protein and the targeting of the labeled protein to the 26s proteasome barrel. FBXO25 has been long known to be able to interact and ubiquitinate the Elk-1 protein in HEK293T cells, thereby inducing a decrease in the expression of important genes in the regulation of cell proliferation such as CFOS and EGR-1 after stimulation with the mitogen PMA. Here we show that FBXO25 acts at another point in the MAPK pathway by modulating the ERK1/2 phosphorylation levels. We observed that the treatment with PMA rised the phosphorylated levels of ERK1/2 in knockout cells for FBXO25 (FBXO25KO) when compared to its parental lineage. Stimulation with the mitogens PMA or ATP also led to an increase in cell proliferation unrelated to a direct modulation of the cell cycle in knockout cells, with a significant weight of apoptosis levels being observed. Taking these results together, we show that FBXO25 acts on MAPK signaling by reducing ERK1/2 activation and thus promotes a secondary response on the cell proliferation phenotype.

A proteína FBXO25 é uma E3-ligase do tipo SCF, responsável pela seletividade da ligação da Ub à proteína substrato e pelo direcionamento da proteína marcada para o barril proteassomal 26s. Sabe-se que FBXO25 é capaz de interagir e ubiquitinar a proteína Elk-1 em células HEK293T e, assim, inibir a expressão de genes importantes na regulação da proliferação celular, como C-FOS e EGR-1, após estímulo com o mitógeno PMA. Aqui mostramos que FBXO25 atua em um outro ponto da via das MAPKs, modulando os níveis de fosforilação de ERK1/2. Por meio da utilização de células nocaute para FBXO25 (FBXO25KO) foi possível observar que o tratamento com PMA promoveu aumento dos níveis de fosforilação de ERK1/2 nestas células quando comparadas com sua linhagem parental. Observouse também que o estímulo com os mitógenos PMA ou ATP levou a um aumento da proliferação celular não relacionada à modulação direta do ciclo celular nas células nocautes, sendo que estas apresentaram uma redução significativa dos seus níveis de apoptose. Tomando esses resultados em conjunto, mostramos que FBXO25 atua sobre a sinalização de MAPK por meio de redução da ativação ERK1/2 e, dessa forma, promove uma resposta secundária sobre o fenótipo de proliferação celular / The FBXO25 protein is an SCF-type E3-ligase responsible for the selectivity of Ub binding to the protein and the targeting of the labeled protein to the 26s proteasome barrel. FBXO25 has been long known to be able to interact and ubiquitinate the Elk-1 protein in HEK293T cells, thereby inducing a decrease in the expression of important genes in the regulation of cell proliferation such as CFOS and EGR-1 after stimulation with the mitogen PMA. Here we show that FBXO25 acts at another point in the MAPK pathway by modulating the ERK1/2 phosphorylation levels. We observed that the treatment with PMA rised the phosphorylated levels of ERK1/2 in knockout cells for FBXO25 (FBXO25KO) when compared to its parental lineage. Stimulation with the mitogens PMA or ATP also led to an increase in cell proliferation unrelated to a direct modulation of the cell cycle in knockout cells, with a significant weight of apoptosis levels being observed. Taking these results together, we show that FBXO25 acts on MAPK signaling by reducing ERK1/2 activation and thus promotes a secondary response on the cell proliferation phenotype.