Le développement hématopoïétique est régulé par l’action combinée de facteurs de transcription lignée spécifiques et de la machinerie transcriptionnelle de base, permettant ainsi l’expression de gènes en temps et lieu appropriés. Les travaux présentés dans cette thèse portent sur l’étude structurale et fonctionnelle d’interactions décisives pour la régulation de l’expression de gènes et impliquant des domaines de transactivation (TAD). En effet, les interactions faisant intervenir les TAD d’activateurs permettent de réguler l’activation de la transcription de façon spécifique. La première étude présentée dans cette thèse relate l'identification et la caractérisation d'une nouvelle interaction entre deux facteurs de transcription : le facteur hématopoïétique GATA-1 et la protéine suppresseur de tumeur p53. En combinant des études in vitro par titrage calorimétrique en condition isotherme (ITC) et par spectroscopie RMN et des études in vivo, nous avons identifié et caractérisé cette nouvelle interaction. Il s'avère que le TAD de p53 et le domaine de liaison à l’ADN de GATA-1 sont les domaines minimaux requis pour la formation de ce complexe. L'inhibition de la voie p53 par GATA-1 s’est avérée être la conséquence majeure de cette interaction, permettant ainsi le maintien en vie des précurseurs érythrocytaires via l’inhibition de l’apoptose. Un deuxième type d’interaction a fait l’objet d’études : l’interaction entre divers TAD et la machinerie transcriptionnelle de base, plus spécifiquement avec le Facteur général de Transcription IIH (TFIIH). La structure des complexes constitués par la sous-unité Tfb1/p62 du facteur TFIIH en interaction avec le TAD viral de VP16 d’une part, et avec le TAD humain du facteur érythrocytaire « Erythroid Krüppel-like factor» (EKLF) d’autre part, ont été résolues par spectroscopie RMN. La structure du complexe Tfb1/VP16 a révélée que le mode de liaison de VP16 à Tfb1 est similaire au mode de liaison du TAD de p53 avec le même partenaire. En effet, les TAD de VP16 et de p53 forment tous deux une hélice α de 9 résidus en interaction avec Tfb1. En dépit de partager avec p53 et VP16 le même site de liaison sur Tfb1/p62, la structure RMN du complexe EKLF/Tfb1 démontre que le mode d’interaction de ce TAD se distingue du mode de liaison canonique des activeurs transcriptionnels. Etonnamment, EKLF adopte un mécanisme de liaison semblable au mécanisme de liaison du facteur général de transcription TFIIEα avec p62, leurs conformations demeurent étendues en interaction avec Tfb1/p62. En se basant sur nos données structurales, nous avons identifié un résidu dans le TAD d'EKLF décisif pour la formation du complexe EKLF/p62 : le Trp73. La mutation de cet acide aminé perturbe son interaction avec Tfb1PH/p62PH et réduit significativement l'activité transcriptionnelle d'EKLF dans les érythrocytes. / Hematopoietic development is regulated through a combinatorial interplay between lineage-specific activators and the general transcription machinery that enables cell-specific patterns of gene expression. This thesis reports structural and functional studies of interactions involving the transcativation domains (TAD) of activators proteins and their role in hematopoietic development. Interactions between the TAD of activators and their partners play an important role in the transcriptional regulation of all genes including those regulating hematopoiesis. The first section reports the identification and characterization of a novel interaction between the erythroid transcription factor GATA-1 and the tumor suppressor protein p53. Using a combination of isothermal titration calorimetry (ITC), NMR spectroscopy and in vivo studies, we identified and characterized the direct interaction between these two important transcription factors in an attempt to determine the role of this interaction in erythroid development. Based on our results, the TAD of p53 directly interacts with the DNA-binding domain of GATA-1 in a cell-type specific manner. Through this interaction, GATA-1 inhibits activation of select p53-regulated genes and we postulate that the inhibition of p53-dependent apoptotic pathways is essential for survival of erythroid precursor cells. In the second section, we report on the interactions between two acidic TADs and the general transcription factor IIH (TFIIH). The structure of the complexes formed by the Tfb1/p62 subunit of TFIIH (Tfb1PH/p62PH) and the acidic TAD of Herpes Simplex viral protein 16 (VP16) and the Erythroid Krüppel-like factor (EKLF) were determined by NMR spectroscopy. The structure of the Tfb1PH/VP16 complex demonstrated that a viral TAD has the ability to mimic the actions of the TAD from the human p53 with Tfb1PH/p62PH. The TADs of both VP16 and p53 adopt a 9-residue α-helix in complex with Tfb1PH/p62PH. Interestingly, the NMR structure of the EKLF/Tfb1PH complex demonstrated that despite sharing a common binding site with p53 and VP16 on Tfb1PH, the EKLF/Tfb1PH binding interface is distinctly different from the binding interfaces we previously observed with p53/Tfb1PH and VP16/Tfb1PH complexes. Surprisingly, EKLF adopted a similar binding mechanism as the general transcription factor TFIIEα in interaction with p62PH as both interact in an extended conformation. Moreover, based on our structural data, we have identified Trp73 as a key residue within the TAD of EKLF that is required for the formation of the EKLF/Tfb1PH complex. Mutations of Trp73 disrupted the binding to Tfb1PH/p62PH and significantly reduced the transcriptional activity of EKLF in red blood cells.

Le développement hématopoïétique est régulé par l’action combinée de facteurs de transcription lignée spécifiques et de la machinerie transcriptionnelle de base, permettant ainsi l’expression de gènes en temps et lieu appropriés. Les travaux présentés dans cette thèse portent sur l’étude structurale et fonctionnelle d’interactions décisives pour la régulation de l’expression de gènes et impliquant des domaines de transactivation (TAD). En effet, les interactions faisant intervenir les TAD d’activateurs permettent de réguler l’activation de la transcription de façon spécifique. La première étude présentée dans cette thèse relate l'identification et la caractérisation d'une nouvelle interaction entre deux facteurs de transcription : le facteur hématopoïétique GATA-1 et la protéine suppresseur de tumeur p53. En combinant des études in vitro par titrage calorimétrique en condition isotherme (ITC) et par spectroscopie RMN et des études in vivo, nous avons identifié et caractérisé cette nouvelle interaction. Il s'avère que le TAD de p53 et le domaine de liaison à l’ADN de GATA-1 sont les domaines minimaux requis pour la formation de ce complexe. L'inhibition de la voie p53 par GATA-1 s’est avérée être la conséquence majeure de cette interaction, permettant ainsi le maintien en vie des précurseurs érythrocytaires via l’inhibition de l’apoptose. Un deuxième type d’interaction a fait l’objet d’études : l’interaction entre divers TAD et la machinerie transcriptionnelle de base, plus spécifiquement avec le Facteur général de Transcription IIH (TFIIH). La structure des complexes constitués par la sous-unité Tfb1/p62 du facteur TFIIH en interaction avec le TAD viral de VP16 d’une part, et avec le TAD humain du facteur érythrocytaire « Erythroid Krüppel-like factor» (EKLF) d’autre part, ont été résolues par spectroscopie RMN. La structure du complexe Tfb1/VP16 a révélée que le mode de liaison de VP16 à Tfb1 est similaire au mode de liaison du TAD de p53 avec le même partenaire. En effet, les TAD de VP16 et de p53 forment tous deux une hélice α de 9 résidus en interaction avec Tfb1. En dépit de partager avec p53 et VP16 le même site de liaison sur Tfb1/p62, la structure RMN du complexe EKLF/Tfb1 démontre que le mode d’interaction de ce TAD se distingue du mode de liaison canonique des activeurs transcriptionnels. Etonnamment, EKLF adopte un mécanisme de liaison semblable au mécanisme de liaison du facteur général de transcription TFIIEα avec p62, leurs conformations demeurent étendues en interaction avec Tfb1/p62. En se basant sur nos données structurales, nous avons identifié un résidu dans le TAD d'EKLF décisif pour la formation du complexe EKLF/p62 : le Trp73. La mutation de cet acide aminé perturbe son interaction avec Tfb1PH/p62PH et réduit significativement l'activité transcriptionnelle d'EKLF dans les érythrocytes. / Hematopoietic development is regulated through a combinatorial interplay between lineage-specific activators and the general transcription machinery that enables cell-specific patterns of gene expression. This thesis reports structural and functional studies of interactions involving the transcativation domains (TAD) of activators proteins and their role in hematopoietic development. Interactions between the TAD of activators and their partners play an important role in the transcriptional regulation of all genes including those regulating hematopoiesis. The first section reports the identification and characterization of a novel interaction between the erythroid transcription factor GATA-1 and the tumor suppressor protein p53. Using a combination of isothermal titration calorimetry (ITC), NMR spectroscopy and in vivo studies, we identified and characterized the direct interaction between these two important transcription factors in an attempt to determine the role of this interaction in erythroid development. Based on our results, the TAD of p53 directly interacts with the DNA-binding domain of GATA-1 in a cell-type specific manner. Through this interaction, GATA-1 inhibits activation of select p53-regulated genes and we postulate that the inhibition of p53-dependent apoptotic pathways is essential for survival of erythroid precursor cells. In the second section, we report on the interactions between two acidic TADs and the general transcription factor IIH (TFIIH). The structure of the complexes formed by the Tfb1/p62 subunit of TFIIH (Tfb1PH/p62PH) and the acidic TAD of Herpes Simplex viral protein 16 (VP16) and the Erythroid Krüppel-like factor (EKLF) were determined by NMR spectroscopy. The structure of the Tfb1PH/VP16 complex demonstrated that a viral TAD has the ability to mimic the actions of the TAD from the human p53 with Tfb1PH/p62PH. The TADs of both VP16 and p53 adopt a 9-residue α-helix in complex with Tfb1PH/p62PH. Interestingly, the NMR structure of the EKLF/Tfb1PH complex demonstrated that despite sharing a common binding site with p53 and VP16 on Tfb1PH, the EKLF/Tfb1PH binding interface is distinctly different from the binding interfaces we previously observed with p53/Tfb1PH and VP16/Tfb1PH complexes. Surprisingly, EKLF adopted a similar binding mechanism as the general transcription factor TFIIEα in interaction with p62PH as both interact in an extended conformation. Moreover, based on our structural data, we have identified Trp73 as a key residue within the TAD of EKLF that is required for the formation of the EKLF/Tfb1PH complex. Mutations of Trp73 disrupted the binding to Tfb1PH/p62PH and significantly reduced the transcriptional activity of EKLF in red blood cells.

Le facteur de transcription IIH (TFIIH) joue un rôle crucial dans la transcription et dans la réparation de l’ADN. La sous-unité Tfb1/p62 (levure et humain) de TFIIH interagit avec de nombreux facteurs de transcription (p53, NFκB, TFIIEα) et de réparation (Rad2/XPG and Rad4/XPC) (1). La majorité des interactions avec Tfb1/p62 requiert le domaine d’homologie à la Pleckstrin (PH) localisé dans la région N-terminal de la protéine (2, 3). Ce domaine PH forme des complexes avec des domaines de transactivation acide provenant de protéines cibles impliquées dans la transcription et la réparation de l’ADN. De récentes études ont montré que Tfb1/p62 est une cible pour les protéines virales telles que la protéine VP16 du virus de l’herpès simplex (HSV) de type 1, la protéine E1 du virus du papillome humain (VPH) et la protéine EBNA-2 du virus Epstein-Barr (EBV) (4, 5). Ces protéines virales interagissent avec la sous-unité Tfb1/p62 par un domaine de transactivation acide suggérant une interaction similaire à ce qui est observé chez les facteurs de transcription humains comme p53. Ce mémoire présente une caractérisation structurelle et fonctionnelle du complexe formé par la protéine virale EBNA2 et la protéine humaine Tfb1/p62. L’analyse est faite en utilisant le titrage calorimétrique isotherme (ITC), la résonance magnétique nucléaire (RMN) et une expérience de transactivation chez la levure. Cette étude amène une plus grande compréhension des protéines impliquées dans les maladies comme le lymphome de Burkitt et le lymphome de Hodgkin qui sont souvent associées à l’infection à l’EBV (revue dans (6)) et caractérise une cible potentielle pour un antiviral. / The general transcription factor IIH (TFIIH) plays crucial roles in both transcription and DNA repair. Tfb1/p62 (yeast and human), one of the ten/eleven subunits of TFIIH, has been shown to interact with several important transcription (p53, NFκB, TFIIEα) and repair factors (Rad2/XPG and Rad4/XPC) (1). Most of the interactions with Tfb1/p62 require the Pleckstrin homology (PH) domain located at the amino-terminal end of the protein (2, 3). This PH domain in particular forms complexes with highly acidic domains from target proteins involved in both transcriptional activation and DNA repair. Recent studies has shown that the Tfb1/p62 subunit of TFIIH is also targeted by a number of viral proteins including the Herpes Simplex virus (HSV) protein VP16, the Human papillomavirus (HPV) protein HPV E1 and the Epstein-Barr virus (EBV) protein EBNA-2 (4, 5). These viral proteins interact with the Tfb1/p62 subunit via acidic domain which suggests that they are forming similar interactions as the one observed with human transcription and repair factors. This thesis provides a structural and functional characterization of the complex formed by the viral proteins EBNA2 and the human protein Tfb1/p62 subunit of TFIIH. The analysis is done using isothermal titration calorimetry (ITC), nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and a yeast activation assay. This study brings a greater understanding of proteins implicated in diseases such as the Burkitt’s lymphoma directly linked to an EBV infection (review in (6)) and shows a viable target for antiviral drug.