The Bordetellae are aerobic Gram-negative coccobacilli colonizing the upper respiratory tract of mammals and thereby causing diseases with similar symptoms but different host specificity. The bacteria produce a variety of adhesins and toxins that facilitate their ability to promote infection and evade the innate immune system. Among them, the filamentous hemagglutinin (FHA) and the adenylate cyclase toxin (CyaA) are the major virulence factors providing the adherence to the host epithelial cells and the protection against bactericidal activity of phagocytic cells, respectively. Moreover, CyaA along with the Escherichia coli α-hemolysin (HlyA) and the Kingella kingae cytotoxin (RtxA) represent a prominent group of Repeats in ToXin (RTX) cytotoxins/hemolysins that undergo post-translational acylation on conserved lysine residues. Here, different mass spectrometry approaches were employed to analyze the structural features of FHA and to characterize the acylation status of the RTX toxins and their various hybrid molecules. First, the differential 16O/18O labeling revealed that the mature FHA proteins of B. pertussis (Bp-FHA) and the B. bronchiseptica (Bb-FHA) are processed at different sites, after Ala2348 and Lys2479 of the FhaB precursor, respectively. Second, the bottom-up proteomics of the...

Bacillus thuringiensis subsp. israelensis é uma bactéria gram positiva, amplamente utilizada no controle de insetos Diptera, família Culicidae, tais como Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus. O sequenciamento de genomas completos de estirpes de B. thuringiensis tem permitido a identificação e caracterização de proteínas inseticidas, assim como a realização de estudos de genômica comparativa, permitindo evidenciar diferenças funcionais e filogenéticas. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo realizar análises genômicas de quatro isolados de B. thuringiensis subsp. israelensis que apresentam diferentes toxicidades para larvas de A. aegypti e C. quinquefasciatus. O sequenciamento dos genomas dos isolados T0124, T0131, T0137 e T0139 foi realizado a partir da plataforma MiSeq-Ilumina, e a montagem e anotação foram feitas utilizando ferramentas do programa de bioinformática Geneious. As análises resultaram em cromossomos com tamanhos aproximados de 5.414 Kb, conteúdo G+C de 35,2% e 5.358 regiões codificantes. Com relação ao conteúdo extracromossomal, foram montados três plasmídeos menores de 5,4; 6,8 e 7,6 Kb, e três plasmídeos maiores de 127, 235 e 359 Kb para todos os isolados, e estes foram enumerados de 1 a 6. A anotação revelou que apenas os plasmídeos de número 4, que correspondem ao pBtoxis, possuem proteínas inseticidas, sendo elas Cry4Aa, Cry4Ba, Cry11Aa, Cry10Aa, Cyt1Aa, Cyt2Ba e Cyt1Ca. A análise comparativa entre os genomas demonstra que os cromossomos T0124, T0131, T0137 e T0139 apresentam sequências colineares e com 99% de identidade, e seus respectivos plasmídeos 1, 2, 3, 4, 5 e 6 compartilham todas as suas regiões codificantes, incluindo aquelas relacionadas a δ-endotoxinas. A comparação de sequências de enterotoxinas, metaloproteases e fosfolipases demonstra que estes também são conservados entre os genomas. Na análise filogenética, os cromossomos T0124, T0131, T0137 eT0139 agruparam-se juntamente com os genomas dos isolados AM65-52 e HD-789 disponíveis no GenBank, sugerindo uma estreita relação genética entre estirpes de B. thuringiensis subsp. israelensis. Os isolados T0124, T0131, T0137 e T0139 apresentam diferentes concentrações letais para larvas de A. aegypti e C. quinquefasciatus, e a adição de dados proteômicos aos dados genômicos, aqui obtidos, poderão auxiliar na compreensão destas diferenças de toxicidade. Contudo as análises comparativas entre os genomas dos isolados T0124, T0131, T0137 e T0139 mostram alto grau de conservação genética a nível de nucleotídeos de B. thuringiensis subsp. israelensis. / Bacillus thuringiensis subsp. israelensis is a gram-positive bacterium widely used to control insects of the order Diptera, such as Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) and Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). The sequencing of complete genomes of B. thuringiensis strains has allowed the identification and characterization of insecticidal proteins, as well as the comparative genomic studies, allowing the identification of functional and phylogenetic differences. In this context, the present study aimed to perform genomic analysis of four isolates of B. thuringiensis subsp. israelensis having different toxicities for larvae of A. aegypti and C. quinquefasciatus larvae. Sequencing of genomes of the isolates T0124, T0131, T0137 and T0139 was performed from the MiSeq-Ilumina platform, and assembly and annotation were done using tools from the Geneious bioinformatics program. The analyzes resulted in chromosomes with approximate sizes of 5,414 Kb, G + C content of 35.2% and 5,358 coding regions. Regarding extrachromosomal content, three smaller plasmids of 5.4, 6.8 and 7.6 Kb, and three larger plasmids of 127, 235 and 359 Kb were assembled for all the isolates, and these were enumerated from 1 to 6. The annotation revealed that only the plasmids of number 4, corresponding to pBtoxis, possess insecticidal proteins, being Cry4Aa, Cry4Ba, Cry11Aa, Cry10Aa, Cyt1Aa, Cyt2Ba and Cyt1Ca. Comparative analysis between the genomes demonstrates that chromosomes T0124, T0131, T0137 and T0139 have collinear sequences and 99% identity, and their respective plasmids 1, 2, 3, 4, 5 and 6 share all of their coding regions, including those related to δ-endotoxins. Comparison of enterotoxin, metalloprotease and phospholipase sequences shows that these are conserved among the genomes. In the phylogenetic analysis, chromosomes T0124, T0131, T0137 and T0139 were grouped together with the genomes of the isolates AM65-52 and HD-789 available in GenBank, suggesting a close genetic relation between strains of B. thuringiensis subsp. israelensis. The isolates T0124, T0131, T0137 and T0139 present different lethal concentrations to larvae of A. aegypti and C. quinquefasciatus, and the addition of proteomic data to the genomic data obtained here may help to understand these differences in toxicity. However, the comparative analyzes between the genomes of isolates T0124, T0131, T0137 and T0139 show a high degree of genetic conservation at the nucleotide level of B. thuringiensis subsp. israelensis.

Neste trabalho, esclarecemos tópicos da patogenicidade de EIEC que sustentam a sua menor virulência quando comparada à S. flexneri, e mostramos a importância das células dendríticas (CD) nesse processo. Estudou-se o comportamento de EIEC e S. flexneri quando em contato com células Caco-2, avaliando-se uma cinética de expressão dos genes envolvidos na invasão e disseminação bacteriana. Em geral, todos os genes foram menos expressos em EIEC, fato corroborado pelo fenótipo de disseminação bacteriana, onde EIEC foi menos eficiente do que Shigella. Também foi avaliada a modulação da resposta inflamatória de células dendríticas intestinais murinas pela produção de citocinas, expressão de moléculas co-estimulatórias e apresentação de antígenos, após desafio das células com as bactérias. Os resultados sugerem que EIEC induz a uma resposta protetora ao hospedeiro, enquanto que Shigella estaria \"driblando\" o sistema imune, além de provavelmente super-estimular o sistema imune adaptativo, fato que poderia levar a um agravamento da doença. As ações integradas das células Caco-2, células dendríticas e estímulos bacterianos foram estudadas em co-cultura celular. Observou-se que EIEC e suas proteínas secretadas induzem a migração das CDs ao compartimento apical da co-cultura; nada foi observado quando o desafio se deu com Shigella. Também foram avaliadas as concentrações de citocinas inflamatórias no microambiente infeccioso formado. A citocina TNF-α, bem como CCL20 e MCP-1 foram mais proeminentes após estímulo com EIEC, fato que poderia explicar parcialmente a migração das CDs ao lado apical da co-cultura após estímulo com EIEC e suas proteínas secretadas. Nossas evidências experimentais indicam que a doença desencadeada por EIEC é mais restrita a um determinado local da infecção, ou seja, não é capaz de se disseminar a ponto de estender a lesão tecidual de forma mais drástica, como Shigella. Esse fenômeno pode estar associado à menor expressão de seus dos fatores de virulência e à resposta imune inata induzida no sítio de infecção, o que levaria, fatalmente, à resolução da doença. / In this study, we clarify topics of pathogenicity from EIEC that support its lower level of virulence when it is compared to S. flexneri, and we have shown the importance of dendritic cells (DC) in this process. We studied the conduct of EIEC and S. flexneri when they were in contact with Caco-2 cells and we analyzed the kinetics of the genes expression that was involved in the spread and invasion of the bacteria. In general, all genes were expressed less in EIEC, as demonstrated by the phenotype of the bacterial spread, where EIEC was less efficient than Shigella. We also analyzed the modulation of the inflammatory response by the murine intestinal dendritic cells by the production of cytokine, expression of co-stimulators molecules and antigens presentation, after the interaction of the cells with the bacteria. The results showed that EIEC induces a response that protects the host while Shigella manipulate the host intestinal innate and adaptive immune system and it probably over-stimulates the adaptive immune system which could let the disease worse. The integrated actions of Caco-2 cells, dendritic cells and bacterial stimulus, were studied in a co-culture cell. We observed that EIEC and its secreted proteins induce the migration of the DCs to the apical compartment of the co-culture; nothing was observed related to Shigella. We also evaluated the concentrations of the inflammatory cytokines at the infective micro environment that was formed. The cytokine TNF-α, as CCL20 and MCP-1 were more prominent after been stimulated with EIEC, a fact that could partially explain the migration of DCs to the apical side of the co-culture after the stimulus with EIEC and its secreted proteins. Our experimental evidence shows that the disease triggered by the EIEC is more restricted at a definite infection place, which means that it is not capable of disseminating beyond a certain point to extend the tissue\'s injury and let it worsen, as Shigella do. This phenomenon can be associated with the lower level of expression of its virulence factors and to the immune response induced in the infection site, what could finally lead to the eradication of the disease.

Neste trabalho, esclarecemos tópicos da patogenicidade de EIEC que sustentam a sua menor virulência quando comparada à S. flexneri, e mostramos a importância das células dendríticas (CD) nesse processo. Estudou-se o comportamento de EIEC e S. flexneri quando em contato com células Caco-2, avaliando-se uma cinética de expressão dos genes envolvidos na invasão e disseminação bacteriana. Em geral, todos os genes foram menos expressos em EIEC, fato corroborado pelo fenótipo de disseminação bacteriana, onde EIEC foi menos eficiente do que Shigella. Também foi avaliada a modulação da resposta inflamatória de células dendríticas intestinais murinas pela produção de citocinas, expressão de moléculas co-estimulatórias e apresentação de antígenos, após desafio das células com as bactérias. Os resultados sugerem que EIEC induz a uma resposta protetora ao hospedeiro, enquanto que Shigella estaria \"driblando\" o sistema imune, além de provavelmente super-estimular o sistema imune adaptativo, fato que poderia levar a um agravamento da doença. As ações integradas das células Caco-2, células dendríticas e estímulos bacterianos foram estudadas em co-cultura celular. Observou-se que EIEC e suas proteínas secretadas induzem a migração das CDs ao compartimento apical da co-cultura; nada foi observado quando o desafio se deu com Shigella. Também foram avaliadas as concentrações de citocinas inflamatórias no microambiente infeccioso formado. A citocina TNF-α, bem como CCL20 e MCP-1 foram mais proeminentes após estímulo com EIEC, fato que poderia explicar parcialmente a migração das CDs ao lado apical da co-cultura após estímulo com EIEC e suas proteínas secretadas. Nossas evidências experimentais indicam que a doença desencadeada por EIEC é mais restrita a um determinado local da infecção, ou seja, não é capaz de se disseminar a ponto de estender a lesão tecidual de forma mais drástica, como Shigella. Esse fenômeno pode estar associado à menor expressão de seus dos fatores de virulência e à resposta imune inata induzida no sítio de infecção, o que levaria, fatalmente, à resolução da doença. / In this study, we clarify topics of pathogenicity from EIEC that support its lower level of virulence when it is compared to S. flexneri, and we have shown the importance of dendritic cells (DC) in this process. We studied the conduct of EIEC and S. flexneri when they were in contact with Caco-2 cells and we analyzed the kinetics of the genes expression that was involved in the spread and invasion of the bacteria. In general, all genes were expressed less in EIEC, as demonstrated by the phenotype of the bacterial spread, where EIEC was less efficient than Shigella. We also analyzed the modulation of the inflammatory response by the murine intestinal dendritic cells by the production of cytokine, expression of co-stimulators molecules and antigens presentation, after the interaction of the cells with the bacteria. The results showed that EIEC induces a response that protects the host while Shigella manipulate the host intestinal innate and adaptive immune system and it probably over-stimulates the adaptive immune system which could let the disease worse. The integrated actions of Caco-2 cells, dendritic cells and bacterial stimulus, were studied in a co-culture cell. We observed that EIEC and its secreted proteins induce the migration of the DCs to the apical compartment of the co-culture; nothing was observed related to Shigella. We also evaluated the concentrations of the inflammatory cytokines at the infective micro environment that was formed. The cytokine TNF-α, as CCL20 and MCP-1 were more prominent after been stimulated with EIEC, a fact that could partially explain the migration of DCs to the apical side of the co-culture after the stimulus with EIEC and its secreted proteins. Our experimental evidence shows that the disease triggered by the EIEC is more restricted at a definite infection place, which means that it is not capable of disseminating beyond a certain point to extend the tissue\'s injury and let it worsen, as Shigella do. This phenomenon can be associated with the lower level of expression of its virulence factors and to the immune response induced in the infection site, what could finally lead to the eradication of the disease.