La creciente concienciación social en materia medioambiental conlleva un aumento gradual de la presión sobre los límites de vertido y consumo de agua. El presente trabajo contempla el desarrollo de alternativas de tratamiento mediante tecnologías limpias en tres casos, referentes al sector textil, formulación de tensioactivos y tratamiento de superficies metálicas.El primer caso aborda el estudio "in situ" de diversas secuencias de tratamiento para un efluente homogeneizado procedente de una industria de estampación y tintura. El objetivo final es conseguir el reciclaje parcial del efluente y un efluente apto para el vertido. La secuencia ha de proporcionar una calidad al efluente adecuada para alimentar un proceso de ósmosis inversa. Se combinan tecnologías de tratamiento biológicas (filtro percolador y fangos activos), físico-químicas (coagulación-floculación y electrocoagulación) y físicas (adsorción sobre carbón activo y microfiltración). La secuencia óptima atendiendo a criterios de rendimiento de depuración (98 % en DQO) y coste de explotación (0,74 /m3 y 0,16 /Kg DQO) es: filtro percolador, fangos activos, coagulación-floculación. De esta forma se consigue la mínima producción de lodos (1,87 Kg de lodos húmedos/L), la mínima adición de reactivos y el mejor rendimiento de depuración en términos de materia orgánica. El segundo caso contempla el estudio de la tecnología de electrocoagulación-flotación en el tratamiento de efluentes sintéticos con tensioactivos de diferente origen: aniónico, catiónico y no iónico. El objetivo es conocer si se puede tratar de una tecnología limpia. Asimismo, se compara el funcionamiento de esta tecnología con otras más convencionales (coagulación-floculación y adsorción sobre carbón activo). La electrocoagulación da lugar a unos rendimientos de depuración elevados en el caso del efluente con tensioactivos aniónicos (70-90 %) y más pobres en los efluentes con tensioactivos catiónicos y no iónicos (20-50%). En cualquier caso, los rendimientos son considerablemente superiores a los obtenidos mediante coagulación-floculación. El carbón activo proporciona rendimientos del 100 %. La electrocoagulación-flotación, sin embargo, proporciona una cantidad elevada de lodos, consecuencia del alto consumo de ánodo de aluminio, lo que eleva los costes de explotación incluso por encima de los del carbón activo, motivo por el cual no se puede considerar una tecnología limpia.El tercer caso trata la posibilidad de obtener KNO3 (un valioso fertilizante) a partir de un proceso de depuración de efluentes. Estos proceden de etapas de decapado realizadas con ácido nítrico. El baño agotado tratado mediante coagulación-floculación con KOH, da lugar a un sobrenadante concentrado en nitrato potásico. Las aguas de enjuague de este mismo baño siguen el mismo proceso inicial con KOH; luego el sobrenadante pasa a una etapa de concentración mediante electrodiálisis y evaporación a vacío. Del proceso se obtienen 7 g de KNO3/ L y un efluente libre de metales, reutilizable y que en su mayoría puede ser vertido a cauce público. Cuando el enjuague procede de un baño de ácido sulfúrico y nítrico, la etapa de coagulación se realiza con una mezcla de Ca(OH)2 y KOH. Por otra parte, el proceso en la etapa de evaporación da lugar a la separación de una fracción sólida rica en CaSO4 (también usado como fertilizante) quedando el licor saturado en KNO3. Una etapa de cristalización por enfriamiento proporciona los cristales de KNO3. Con esta secuencia se consigue obtener 2,3 g de KNO3 y 1,5 g de CaSO4/L, así como un efluente de alta calidad para su reutilización y vertido. / The growing environmental concern at society is dealing with stricter wastewater limits and consumption levels. This project develops the use of clean technologies in three wastewater problems: textile, detergents and metal finishing sectors.The first case tackles several methods to treat the wastewater from a textile factory. The aim is to get a large quality effluent, enough to pour and recycle it in a RO process for final reuse. The technologies used are: biologic (trickling filter and activated sludge), chemical-physical (coagulation-flocculation and electrocoagulation) and physical (adsorption in activated carbon and microfiltration). Taking into account operating costs and treatment yield the best sequence for treatment is: trickling filter, activated sludge and coagulation-flocculation.The second case compares the electrocoagulatión-flotation, a possible clean technology, with the coagulation-flocculation and activated carbon ones in synthetic effluents with different types of detergents. Although electrocoagulation-flotation treatment provides acceptable yields (namely in effluents with anionic detergents), the costs due to high consumption of anodes and production of sludge are excessive.The third case deals with the chance to get KNO3 (a valuable fertilizer) from a pickling wastewater with nitrates, in addition to obtain a reusable effluent. The exhausted nitric acid bath is treated with KOH to precipitate the metals and thus having a concentrate solution of KNO3. After the same process the rinse water of pickling process is handled to concentration stages by electrodialysis and vacuum evaporation. In this way, it has been got crystals of KNO3 and an effluent free from metals to be reused or wasted. Rinse effluents from a pickling process with nitric-sulphuric acid mix needs a lightly different treatment. The coagulation-flocculation stage is carried out with KOH and Ca(OH)2. The vacuum evaporation step produces CaSO4 precipitation (also useful as fertilizer) jointly with a saturated solution of KNO3. Finally, cold crystallization stage provides KNO3 crystals.

En ratolins existeixen certes feromones no volàtils i de caràcter sexual contingudes en la borumballa embrutada per mascles i que resulten innatament atractives per a les femelles. Els senyals volàtils emanats de la borumballa de mascles, en canvi, no resulten atractius en la primera experiència amb els mateixos, però poden adquirir propietats atractives de manera secundària després de l'exposició reiterada a aquests volàtils i als no volàtils innatament atractius de manera conjunta. Els dos primers objectius fonamentals d'aquesta tesi han estat estudiar si les feromones sexuals de mascle són detectades per l'òrgan vomeronasal, o si pel contrari, constitueixen un estímul olfactiu, i comprovar, igualment, si l'atracció induïda per volàtils depèn de la integritat del sistema vomeronasal.Per abordar aquests objectius es va comparar la preferència cap a senyals químics de mascle que mostren les femelles amb la funció vomeronasal interrompuda (mitjançant la lesió electrolítica del bulb olfactiu accessori), amb la què mostren les femelles amb la funció vomeronasal intacta (se'ls practicà una lesió simulada) en diferents situacions experimentals. Els resultats d'aquests experiments mostraren que les feromones contingudes en la borumballa embrutada per mascles intactes que resulten innatament atractives per a les femelles de ratolí són detectades per l'òrgan vomeronasal. També confirmaren que per tal que els volàtils puguen adquirir propietats atractives de manera secundària és necessària la seua associació amb un estímul detectat a través del sistema vomeronasal. A continuació comprovàrem si a més de ser innatament atractives, les feromones sexuals de mascle són reforçants per a les femelles, per a la qual cosa realitzàrem una sèrie d'experiments seguint un paradigma comportamental anomenat test d'adquisició de preferència de lloc, utilitzar per comprovar les propietats reforçants dels estímuls.Els resultats mostraren que les femelles de ratolí són capaces de detectar el gènere i l'estat de dominància dels conespecífics a través de senyals químics continguts en la borumballa embrutada pels mateixos. A més, revelaren que les feromones sexuals de mascle són reforçants per a les femelles de ratolí, però els senyals continguts en la borumballa embrutada per mascles castrat o altres femelles no.Per últim estudiàrem la via de transducció del reforç degut a feromones sexuals. Amb aquest objectiu, i donat que prèviament havíem comprovat que les feromones sexuals són detectades a través del sistema vomeronasal, analitzàrem l'expressió del proto-oncogen c-fos en distints nuclis vomeronasal (el nucli posteromedial de la amígdala cortical, els Illots de Calleja i l'Àrea de transició amígdalo-hipocàmpica). Aquesta expressió la comparàrem entre dos grups experimentals, un al què les femelles solament tenien accés a borumballa neta, i un altre en què les femelles eren exposades a borumballa de mascle. Els resultats indicaren que la via responsable de mitjançar aquest reforç no és la via dopaminèrgica tegment-estriatal clàssica, sinó que es la via que va des del nucli posteromedial de la amígdala cortical i l'àrea amígdalo-hipocàmpica als Illots de Calleja més ventromedials.En resum els resultats d'aquesta tesis mostren l'existència d'un nou estímul reforçant en ratolins, les feromones sexuals de mascle, que són detectades a través de l'òrgan vomeronasal. A més, hem vist que existeixen altres regions de l'estriat ventral, a part de les clàssiques, implicades en la codificació de les propietats reforçants dels estímuls naturals. / Male mice soiled bedding contains non volatile sexual pheromones that are innately attractive to females. Male volatile signals are, in contrast, not attractive to females in their very first contact with them, but can acquire secondary attractive properties by its association with the non volatile and innately attractive signals. In this work we analysed whether male sexual pheromones are detected through the accessory olfactory system, and if the association between non-volatiles and volatile signals is also dependent on the integrity of vomeronasal system. To do so, we carried out a battery of experiments in a group of females with a lesion in their accessory olfactory bulb (AOB) comparing their behaviour with that from another group of animals with a sham lesion in their AOB. In addition, we also analysed if male sexual pheromones are rewarding to female mice, using a behavioural paradigm named place preference test. Finally, we studied which would be the neural system that mediates these reinforcing properties. To do so, we compared c-fos expression in different vomeronasal nuclei in animals exposed to male-soiled bedding and animals exposed to clean bedding.The results of our experiments show that male sexual pheromones are detected through the vomeronasal organ and that the acquisition of secondary attractive properties by male volatile signals depends on its association with non volatiles signals also detected through the vomeronasal system. Furthermore we have demonstrated that male sexual pheromones have reinforcing properties to female mice, ant that the neural system that mediates these reinforcing properties is not the classical dopaminergic tegmento-estriatal projection, but the projections from some regions of the posteromedial cortical nucleus of the amygdala and the amygdalo-hypocampal area to the most ventromedial Islands of Calleja.The results from these experiments show the existence of a new reinforcing stimulus in mice, the sexual pheromones. In addition, these pheromones are detected through the vomeronasal organ. Moreover, we have shown that there are more regions a part from the classical ones in ventral striatum involved in mediating reinforcing properties of natural stimuli.

Una característica esencial de la vida de todo organismo es la adaptación constante a los cambios que tienen lugar en su entorno. Para ello, esas variaciones ambientales deben ser leídas y traducidas en respuesta fisiológica. De ahí que, los organismos hayan desarrollado diversos mecanismos de integración, de amplificación y de mantenimiento de la señal del medio. La naturaleza de los mecanismos de señalización y respuesta celular varía en función de la complejidad del organismo. Sin embargo, se puede decir que el aspecto básico de toda adaptación es de carácter universal, en el que se pueden distinguir tres grandes etapas: 1) la lectura de la señal propiciada por el entorno, 2) la transmisión de la señal recibida y, 3), la respuesta celular. Al final toda respuesta celular implica un cambio intracelular basado en el control de la expresión génica y/o actividad de proteínas, cuya función permite adecuar el metabolismo celular a las necesidades de cada momento. La tesis aquí presentada se centra en el mecanismo de señalización por glucosa. La glucosa es la principal fuente de carbono y de energía para la mayoría de los organismos. Además de ser nutriente se puede considerar a la glucosa como una "hormona de crecimiento", ya que regula varios aspectos del crecimiento, metabolismo y desarrollo celular. Para llevar a cabo dicho estudio hicimos uso de la levadura Saccharomyces cerevisiae.En S. cerevisiae la presencia de glucosa modula distintos procesos celulares. La regulación del metabolismo supone controlar las rutas implicadas a distintos niveles: a corto plazo se modifica la actividad de distintas proteínas, como es el caso de la inactivación por catabolito de los transportadores de galactosa y maltosa; mientras que a largo plazo se producen cambios en la actividad transcripcional. La glucosa en S. cerevisiae regula la expresión génica mediante dos rutas diferentes denominadas ruta de inducción y ruta de represión. Mediante la ruta de represión se inactiva la expresión génica de un gran número de genes tales como los genes responsables de la utilización de otras fuentes de carbono distintas a la glucosa, de la gluconeogénesis y la respiración. Por el contrario, mediante la ruta de inducción se activan los genes responsables de la utilización de la glucosa, tales como genes que codifican para enzimas glicolíticos y transportadores de glucosa, HXTs. Para estudiar la señalización por glucosa estudiamos la regulación de la expresión génica del transportador de glucosa de baja afinidad, HXT1, de S. cerevisiae, cuyo sistema de expresión se considera modelo de inducción génica por glucosa. Los resultados obtenidos demuestran que la regulación por glucosa de la expresión del transportador de glucosa de baja afinidad, HXT1, de S. cerevisiae se realiza a través de al menos tres mecanismos de señalización diferentes: el sistema de inducción génica por glucosa, la ruta TOR, ruta de señalización de nutrientes a través de los homólogos a las proteínas 14-3-3, y la ruta HOG, ruta de respuesta a estrés osmótico. La acción coordinada de dichos mecanismos modula la actividad transcripcional sobre el gen HXT1, permitiendo finalmente que el gen se exprese ante la presencia de glucosa. Por tanto, la regulación de HXT1 es un ejemplo más de cómo se interrelacionan distintos procesos celulares para adecuar el metabolismo celular según las necesidades.TOR ("target of rapamycin").HOG ( High osmolarity glycerol signal transduction pathway ). / Sensing nutrients is a fundamental requisite for all living cells. For most eukaryotic cells glucose is a major source of energy, having significant and varied effects on cell function. Maintaining glucose homoeostasis is consequently of great importance to many organisms. Interest in identifying mechanisms by which cells sense and respond to variations in glucose concentration has increased lately. Glucose regulates genes in all cells by mechanisms which have been conserved throughout evolution. The consensus is that glucose could act on target cells either by binding to a receptor at the cell surface, or through its metabolism. The aim of this thesis is to elucidate the mechanism involved in glucose sensing in the yeast Saccharomyces cerevisiae.Yeast cells prefer glucose as carbon source and have evolved mechanisms for sensing and responding to wildly fluctuating levels of extracellular glucose. These mechanisms involve a large family of hexose transporters (HXT proteins) and the glucose transporter homologues Snf3 and Rgt2. Snf3 and Rgt2 are glucose-sensing proteins at the plasma membrane with no detectable transport activity. They sense the extracellular glucose and generate an intracellular glucose signal that triggers the induction of HXT gene expression.Expression of HXT1, a gene encoding a Saccharomyces cerevisiae low-affinity glucose transporter, is regulated by glucose availability, being activated in the presence of glucose and inhibited when the levels of the sugar are scarce. In this study we show how glucose regulate HXT1 expression, and how glucose requires at least the coordinated action of three different mechanisms of signalling: glucose signalling pathway, osmotic stress signalling (HOG pathway) and nutrient-signalling (TOR pathway) .

En las células eucariotas el DNA se encuentra asociado a diferentes tipos de proteínas,empaquetándose en una estructura organizada, denominada cromatina. La unidad básica de lacromatina es el nucleosoma, que consiste en 147 pb de DNA ensamblados alrededor de unoctámero de histonas, formado por dos copias de cada una de las histonas, H2A, H2B, H3 y H4.Cada histona contiene dos motivos funcionales, el motivo histone fold que participa eninteracciones histona-histona y también en interacciones histona-DNA, y las colas de losextremos NH2-terminal, que son susceptibles de sufrir modificaciones postraduccionales, talescomo acetilación, metilación, fosforilación, ubiquitinación y sumoilación. Estas colas tambiénparticipan en la interacción con nucleosomas adyacentes. Además de las histonas internas, lacromatina de eucariotas también contiene la histona H1, que se dispone en el exterior delnucleosoma, y otras proteínas no histona como las HMGs (High Mobility Group). La acetilaciónde histonas es una de las modificaciones postraduccionales que más se ha estudiado. Estamodificación es realizada por complejos histona acetiltransferasa (HATs), y es revertida porcomplejos histona desacetilasa (HDs). En base a la localización subcelular, la preferencia dehistona y la habilidad de modificar histonas nucleosomales, los complejos HAT nativos se hanclasificado en dos grupos. Los enzimas HAT tipo A son enzimas nucleares capaces de acetilarhistonas ensambladas en cromatina, y que frecuentemente se asocian con procesos deregulación de la transcripción. Los enzimas HAT tipo B tienen una localización principalmentecitoplasmática y únicamente acetilan histonas libres, presumiblemente antes de su deposiciónen el DNA para formar nucleosomas. En levadura se describió la presencia de una HAT tipo B,[Ruiz-García et al., 1998], que se aisló en la fracción citoplásmica y que tenía una masamolecular de 200 kDa. Este enzima acetila específicamente la histona H4 libres, pero esincapaz de acetilar nucleosomas, y está formado, al menos, por la subunidad catalítica Hat1p ypor Hat2p [Lopez-Rodas et al., 1991, Kleff et al., 1995 y Parthun et al., 1996]. En este trabajo seha identificado bioquímicamente la proteína Hif1 (43.3 kDa, 385 aminoácidos), como unasubunidad del enzima B, no identificada hasta el momento. Además se han realizado estudiosde localización subcelular, mostrando que las proteínas del complejo HAT-B se encuentranmayoritariamente en el núcleo. Asimismo, encontramos una dependencia de la localizaciónsubcelular de Hat1p con la presencia de Hat2p. En este trabajo mostramos que el complejoHAT-B acetila una fracción soluble de H4, no ensamblada en cromatina, en las lisinas 12 y 5.Cuando esta fracción soluble de H4 se acumula por alguna causa, es degradada por una rutadependiente de la proteína Rad53, una proteína quinasa de checkpoint. La acetilación de lahistona H4 es dependiente de las proteínas Hat1 y Hat2, pero no de la subunidad Hif1p, que noparece estar implicada en la función de acetilación. Además, tanto la proteína Hat1 como Hat2son necesarias para la unión del sustrato, H4, pero Hif1p no participa en esta unión. / Hat1 is the catalytic subunit of the only type B histone acetyltransferase known (HAT-B). Theenzyme specifically acetylates lysine 12, and to a lesser extent lysine 5, of free, non-chromatinboundhistone H4. The complex is usually isolated with cytosolic fractions and is thought to beinvolved in chromatin assembly. The Saccharomyces cerevisiae HAT-B complex also containsHat2, a protein stimulating Hat1 catalytic activity. At these work we identified by two-hybridexperiments Hif1 as both a Hat1- and a histone H4-interacting protein. These interactions weredependent on HAT2, indicating a mediating role for Hat2. Biochemical fractionation and coimmunoprecipitationassays demonstrated that Hif1 is a component of a yeast heterotrimericHAT-B complex, in which Hat2 bridges Hat1 and Hif1 proteins. In contrast to Hat2, this novelsubunit does not appear to regulate Hat1 enzymatic activity. Nevertheless, similarly to Hat1,Hif1 influences telomeric silencing. In a localization analysis by immunofluorescencemicroscopy on yeast strains expressing tagged versions of Hat1, Hat2, and Hif1, we have foundthat all three HAT-B proteins are mainly localized in the nucleus, and the nuclear Hat1plocalization is dependent on Hat2 protein. Thus, we propose that the distinction between A- andB-type enzymes should henceforth be based on their capacity to acetylate histones bound tonucleosomes and not on their location within the cell. At these work we demonstrate HAT-Bcomplex acetylates a soluble histone H4 fraction, not assembled in chromatin, at lysines 5 and12. When the soluble histone fraction is acumulated in the cell, it is degradated by a pathwayregulated by Rad53p.Histone H4 acetylation is dependent on Hat1 and Hat2 proteins, but noton Hif1p. These subunit not seems be related with histone acetylation function. Indeed, both,Hat1p and Hat2p, are necessaries for the histone H4 binding, but not Hif1p.

La Ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa (Rubisco) cataliza el primer paso en la fijación fotosintética del CO2 a través del ciclo de Calvin. La estructura del holoenzima activo en organismos eucariotas es un hexadecámero compuesto por 8 subunidades grandes (de 51-58KDa) y 8 subunidades pequeñas (de 12-18KDa). En condiciones de senescencia natural o inducida por estrés la Rubisco sufre una degradación rápida y selectiva. Una de las respuestas más generalizadas ante diferentes tipos de estrés en distintos organismos es la oxidación de grupos tioles de la Rubisco, que se ha relacionado in vitro e in vivo con la inactivación y susceptibilización proteolítica del enzima. Los residuos de cisteínas filogenéticamente conservados de la Rubisco son candidatos potenciales a mediar esta regulación redox. Con estos antecedentes, el objetivo general del presente trabajo ha sido evaluar la implicación de los residuos Cys172 y Cys192 (altamente conservados en eucariotas y cianobacterias) en la actividad, modulación redox, y en la organización estructural del holoenzima. Para ello se han abordado los siguientes aspectos:I. Obtención y caracterización de las Rubiscos mutantes C172S, C192S y C172S/C192S Las funciones de los residuos Cys172 y Cys192 se han investigado estudiando el fenotipo de mutantes en los que dichos residuos se han sustituido por serina mediante mutagénesis dirigida del gen rbcL en el alga unicelular Chlamydomonas reinhardtii. El enzima C172S posee un factor de especificidad mayor que el silvestre, con unas constantes aparentes de Michaelis para el CO2 y O2 aumentadas. La Rubisco C192S presenta una especial sensibilidad a la inactivación por agentes modificadores de grupos sulfhidrilo. Ello parece responder al carácter crítico de la modificación de la Cys172 en la actividad enzimática y al efecto protector que sobre este residuo ejerce la Cys192. El estudio del ensayo de la sensibilidad térmica, de los cambios en la sensibilidad proteolítica y de la movilidad del holoenzima en geles nativos indica que la sustitución de las Cys172 y/o Cys192 afecta a la estructura de los enzimas. II. Determinación de la estructura de las Rubiscos C172S y C192S por difracción de rayos X Se ha determinado la estructura tridimensional de la Rubisco de los mutantes C172S y C192S. Como diferencia más significativa se ha detectado un desplazamiento de la hebra β1 del barril α/β en el enzima C172S en relación a la estructura del enzima silvestre. III. Estudio de la respuesta de los mutantes a diferentes tipos de estrés El mutante C172S sometido a estrés salino degrada la Rubisco de forma más lenta que la cepa silvestre o los demás mutantes. Además, bajo un estrés por diamida específicamente dirigido a la oxidación de los grupos sulfhidrilo, el mutante C172S se muestra resistente a la inactivación que sufren las demás cepas. Ello apunta a un papel singular del residuo Cys172 en la modulación del catabolismo de la Rubisco en respuesta a situaciones de estrés. En condiciones de estrés por diamida, todas las cepas mutantes (C172S, C192S y C172S/C192S) presentan una degradación retardada de la Rubisco por comparación con la cepa silvestre. Ello sugiere que, en estas condiciones de oxidación directa de los tioles celulares, la formación de un puente disulfuro entre la Cys172 y la Cys192 podría actuar como una señal condicionante de la degradación del enzima. / Cysteines 172 and 192 from the large subunit of the photosynthetic enzyme ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) are a pair of vicinal residues evolutively conserved among cyanobacteria, algae and higher plants. In the present study, it has been analyzed the effect of the substitution of Cys172 and Cys192 by serine on the catalytic properties, thermostability, three-dimensional structure of the mutant enzymes, and the in vivo turnover and inactivation of Rubisco enzymes in stressed cells.1. Site-directed mutagenesis of conserved cysteine residues (Cys172 and Cys192) of Rubisco in Chlamydomonas reinhardtii and Rubisco mutants characterization.The most remarkable effect of the C172S mutant was a 15% increase in the value of the specificity factor compared to the wild-type enzyme, while the specificity factor of C192S Rubisco was identical to wild-type.The C192S enzyme was more sensitive to inactivation through oxidation of cysteines than the wild type and the rest of the enzymes. The results suggest that the Cys192 protects the critical modification of the Cys172. The results of thermal stability, proteolytic susceptibility assays and holoenzyme mobility in native electrophoresis show that the substitution of Cys172 and/or Cys192 affect to the enzyme structure. 2. Crystallization and Structure determination of C172S and C192S Rubisco mutants.X-ray structures of the mutant enzymes reveal that the substitution at position 172 causes a significant shift of the main chain backbone atoms of β-strand1 of the α/β-barrel.3. In Vivo turnover and inactivation of the C172S, C192S, C172S/C192S and wild-type Rubisco Enzymes in stressed Cells.The absence of Cys172 protects Rubisco from degradation under saline stress conditions. The C172S mutant enzyme is more resistant to inactivation under oxidative (diamide induced) stress.In a oxidative conditions (diamide stress) Cys172-Cys192 disulfide bond formation could act as a redox signaling pathway.

Las proteínas Muscleblind humanas, MBNL1, MBNL2 y MBNL3, son factores de splicing alternativo que se unen a sus pre-mRNAs diana mediante un nuevo dominio de dedos de zinc del tipo CCCH que esta conservado evolutivamente. Las proteínas MBNL están implicadas en la ruta de patogénesis de la Distrofia Miotónica (DM) ya que son secuestradas por la expansión del trinucleótido CUG presente en los mRNA mutantes de los genes DMPK (DM1) y ZNF9 (DM2). De acuerdo con el fenotipo de la DM, las mutaciones por pérdida de función en el gen muscleblind (mbl) de Drosophila afectan a la diferenciación terminal de la musculatura y los fotorreceptores. Sin embargo, no se conoce la función molecular de las proteínas Mbl en organismos modelo de invertebrados tales como Drosophila. En este trabajo mostramos que los tres genes MBNL humanos son parálogos, que tienen un patrón de expresión regulado a lo largo del desarrollo y que sus pre-mRNAs sufren un complejo patrón de procesado alternativo que genera distintas isoformas proteicas. Un estudio evolutivo muestra que las proteínas Mbl están presentes en todos los Bilateria y que se caracterizan por la presencia de, al menos, dos dedos de zinc del tipo CX7CX6CX3H. En humanos describimos un polimorfismo en la región 5´ no traducida del gen MBNL1 y analizamos su posible relevancia como modificador genético del fenotipo de la DM. Además, descartamos la presencia de mutaciones en la región codificante de MBNL1 en pacientes con DM sin expansión en el gen DMPK y en pacientes con Retinitis pigmentosa tipo 3. También descartamos mutaciones en la región codificante de MBNL3 en pacientes con Ptosis congénita asociada al cromosoma X. En Drosophila, hacemos un rastreo genético de modificadores dominantes del fenotipo de sobreexpresión de muscleblind en ojo. Los genes que interaccionan genéticamente se pueden agrupar en tres categorías generales: (1) Metabolismo del RNA, que incluye componentes del exon junction complex (EJC) tales como Aly y factores de splicing como nonA; (2) Regulación de la Transcripción, que incluye tanto proteínas que regulan la estructura de la cromatina (Jumeaux) como activadores de la transcripción (Dp), y (3) Control de la Apoptosis, que incluye tanto genes proapoptóticos (thread) como antiapoptóticos (Traf). Además, en este trabajo generamos moscas transgénicas que expresan la proteína de fusión MblC:GFP y las usamos para llevar a cabo experimentos de co-immunoprecipitación (coIP) con el fin de identificar proteínas que interaccionen físicamente con Mbl. Como resultado, hemos identificado seis bandas que coIP in vivo con la proteína de fusión MblC:GFP. Mediante la técnica de Western blot, descartamos la presencia en el coIP de MblC:GFP de algunas proteínas candidatas como Jumu, Aly, Amos y NonA. Este resultado nos permite concluir que estas cuatro proteínas no interaccionan físicamente con Mbl, al menos bajo las condiciones experimentales testadas. / Human Muscleblind proteins MBNL1, MBNL2 and MBNL3 are alternative splicing regulators that bind pre-mRNAs through an evolutionarily conserved tandem CCCH zinc finger domain. MBNL proteins have been implicated in the pathogenetic pathway of the Myotonic Dystrophy (DM) as they are sequestered by the CUG triplet repeat expansion-containing mRNAs of mutant DMPK (DM1) and ZNF9 (DM2) genes. In agreement with the DM phenotype, Drosophila muscleblind (mbl) loss-of-function mutations impair terminal differentiation of muscle and photoreceptor cells. However, little is known about the molecular function of Mbl proteins in invertebrate model organisms. In this work, we report that the three human MBNL genes are paralogues, their expression pattern is developmentally regulated and their pre-mRNAs undergo a complex alternative splicing regulation generating several protein isoforms. An evolutionary study shows that Mbl proteins are present in all Bilateria and are characterized by the presence of, at least, two CX7CX6CX3H zinc fingers. In humans, we describe a polymorphism in the 5´ untranslated region of the MBNL1 gene and analyze its potential relevance as a genetic modifier of the DM phenotype. Moreover, we discard mutations in the coding region of the MBNL1 gene in DM patients showing no CTG expansion in the DMPK gene and in patients with Retinitis Pigmentosa type 3. We also discard mutations in the coding region of the MBNL3 gene in patients with X-linked Congenital Isolated Ptosis. In Drosophila, we made a genetic screen for dominant modifiers of a muscleblind overexpression phenotype in the eye. Genes that genetically interact with mbl fall into three broad categories: (1) RNA metabolism, including components of the exon junction complex (EJC) such as Aly and splicing factors such as nonA; (2) Transcription regulation, which includes chromatin structure regulators (Jumeaux) and transcription activators such as Dp, and (3) Apoptosis control, including both proapoptotic (thread) and antiapoptotic (Traf) genes. In addition, we generated transgenic flies expressing a MblC:GFP fusion protein and used them to perform co-inmunoprecipitation (coIP) experiments to uncover proteins that physically interact with Mbl. We identified six bands specifically coIP with the MblC:GFP fusion protein and discarded Jumu, Aly, Amos and NonA as Mbl molecular partners.

Rotavirus es el principal agente causante de gastroenteritis viral en niños y animales jóvenes en todo el mundo. Una de las principales proteínas de rotavirus es la glicoproteína no estructural 4 (NSP4) que juega un papel crucial tanto en el ciclo replicativo de rotavirus, actuando como receptor de partículas inmaduras en el retículo endoplasmático, como en la fisiopatología de rotavirus, siendo la primera enterotoxina de origen vírico descrita hasta el momento. El objetivo de la presente tesis fue clonar y producir la glicoproteína NSP4 de diferentes cepas humanas y animales de rotavirus para así poder realizar estudios inmunogénicos tales como la caracterización de epitopos presentes en la proteína y la respuesta inmune que esta proteína despierta tras la infección por rotavirus. Así mismo nos planteábamos estudiar la capacidad que poseen tanto la infección por rotavirus como la proteína NSP4 de producir óxido nítrico (ON) tanto "in vivo" como "in vitro" y la posible implicación del ON en la fisiopatología de rotavirus. Se utilizó el sistema de expresión de baculovirus en células de insecto para la producción y purificación de la proteína NSP4 de diferentes cepas de rotavirus humanas y de animales en forma biológicamente activa. Experimentos de inmunización de ratones demostraron que los anticuerpos producidos frente a la proteína NSP4 reconocen principalmente el fragmento carboxi-terminal de la proteína (aminoácidos 114 a 175), por lo que esta región es inmunodominante. En la presente tesis se utilizó la tecnología de "phage display" para producir anticuerpos monoclonales de simple cadena (scFv) frente a la proteína NSP4. Esta técnica nos permitió aislar scFvs frente a regiones no inmunodominantes de la proteína NSP4.Los estudios realizados con sueros de niños convalecientes de una infección por rotavirus muestran que la proteína NSP4 provoca una respuesta inmune humoral tras la infección natural por rotavirus en niños, constituída por anticuerpos séricos de clase IgG y que esta respuesta no parece ser de larga duración, según los resultados obtenidos con sueros de niños y adultos sanos. Proteínas NSP4 procedentes de dos diferentes genotipos (A y B) fueron utilizadas para estudiar la reactividad cruzada de los anticuerpos frente a NSP4. Los resultados obtenidos muestran que los anticuerpos IgG séricos desarrollados frente a NSP4 en niños con gastroenteritis aguda por rotavirus presentan en el 40% de los casos estudiados reactividad cruzada frente a más de un genotipo de dicha proteína, por lo que este reconocimento de los genotipos A y B de NSP4 no es siempre heterotípico. Los experimentos realizados con células epiteliales humanas HT-29 "in vitro" muestran que la proteína NSP4 provoca un incremento de la secreción de ON en este tipo celular. Este incremento ocurre de forma paralela al incremento de calcio intracelular observado en la misma línea celular en respuesta a NSP4, indicando una posible participación de la enzima óxido nítrico sintasa constitutiva (cNOS). Por último los experimentos realizados "in vivo" en el modelo murino, así como en muestras de orina procedentes de niños con gastroenteritis por rotavirus muestran que las infecciones por rotavirus en ratones Balb/c provocan un aumento en la concentración de los productos derivados del ON en la orina de los animales infectados, con la participación de la enzima óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) en el modelo murino y que este incremento se observa también en la orina de niños con gastroenteritis por rotavirus. / The baculovirus expression system in insect cells was utilized to produce and purify the biologically active form of the NSP4 protein from rotavirus strains isolated from different animal and human strains. After the immunization of mice with the different ourified NSP4 proteins the super-immune sera obtained from NSP4 immunized mice, strongly recognize the carboxi-end of the protein (aminoacids 114 to 175), being indicative of the immunodominance of this region.One of the objebtives of this thesis was to obtain monoclonal antibodies, using the phage display technique that showed to be a useful tool in producing antibodies that recognize different epitopes in the NSP4 protein, thus being able to conduct inhibitory studies to identify biological activity. One interesting result when using this technique was that the phage display technique allowed us for the isolation of single chain monoclonal antibodies against non-immunodominant regions of NSP4.We also present data on the immunogenicity of the NSP4 protein in natural rotavirus infections in humans. Our results show that the NSP4 protein elicits a humoral immune response in children that had been naturally infected by rotavirus. The IgG serical antibodies developed against the NSP4 in children suffering acute rotavirus gastroenteritis, present cross reactivity against more than one genotype of the protein in 40% of the studied cases, indicating that the recognition of A and B NSP4 genotypes is not always heterotypic.Finally we studied the possible role of the nitric oxide (NO) in rotavirus pathophysiology. The NSP4 protein produced an increase in NO secretion in cultured HT-29 human epithelial cells. This increase occurred in parallel to the intracellular calcium increase previously observed in the same cell line in response to the NSP4.The rotaviral infections in Blab/c mice produced an increase in the concentration of the nitric oxide derived products in the urine of the infected animals, through the induction of the inducible nitric oxide enzyme (iNOS) in the murine model. This increase was also observed in the urine of children suffering acute rotaviral gastroenteritis.

Durante los últimos años la producción de masas congeladas para bollería ha experimentado un notable incremento. La calidad de estos productos está lejos de la que se obtiene a partir de masas frescas Esto es debido a la sensibilidad al proceso de congelación y descongelación de S. cerevisiae y a la reducción de su capacidad fermentativa durante el almacenamiento. Si las masas congeladas son azucaradas el problema es todavía mayor. En la elaboración de masas dulces se utiliza hasta un 30% de azúcar provoca una fuerte reducción de la actividad de agua generando ambientes de alta presiones osmóticas. Como consecuencia de todo esto el tiempo de fermentación de estas masas se prolonga y el volumen del producto se reduce. Para resolver este problema es habitual que los industriales añadan cantidades adicionales de levadura de entre un 8-12% lo cual incrementa el coste del producto final y modifica sus características organolépticas. Todo esto ha generado la demanda de nuevas cepas de levadura de panadería con características de osmotolerancia y crioresistencia. Sin embargo pese a los numerosos esfuerzos realizados para la construcción, mediante técnicas de genética clásica o de ADN-recombinante, de cepas industriales más osmotolerantes y crioresistentes, no se dispone en la actualidad de ninguna cepa comercial que cumpla estos requisitos. Frente a esta alternativa, en este trabajo nos planteamos el estudio y la utilización en el proceso de panificación de levaduras silvestres de panaderia con características intrínsecas de crioresistencia y osmotolerancia Concretamente, hemos centrado nuestro interés en el estudio de T. delbrueckii. Dos cepas de esta especie, las cepas PYCC5321 e IPYCC5323, muestran una elevada viabilidad y capacidad fermentativa en masas congeladas. Esta característica junto con el hecho de que son levaduras que se encuentran frecuentemente en alimentos y bebidas con altas concentraciones de azúcares nos lleva a pensar en la posibilidad de utilizar esta especie como modelo de estudio de tolerancia a estrés en levadura de panadería. Esta tesis esta estructurada en forma de publicaciones. En la primera de ellas se estudia la potencial utilización industrial de las cepas de T. delbrueckii PYCC5321 y PYCC5323 para la producción de masas dulces congeladas, analizando además parámetros fisiológicos relacionados con osmotolerancia y crioresistencia como son la síntesis y acumulación de glicerol y trehalosa. El segundo Capítulo de este trabajo comprende dos publicaciones centradas en la obtención de herramientas moleculares para poder utilizar a T. delbrueckki como modelo de levadura de panadería de tolerancia a estrés. En la primera de ellas se describe como la obtención de una genoteca de la cepa PYCC5321 nos ha permitido clonar y caracterizar el gen TdURA3 de T. delbrueckki. En la segunda publicación se muestra la obtención de cepas auxótrofas para uracilo en esta levadura con las cuales hemos analizado la potencialidad T. delbrueckii para expresar y secretar proteínas heterólogas. En el tercer Capítulo se estudian en T. delbrueckii las dos rutas mas importantes implicadas en la respuesta a estrés osmótico y salino en levadura, la ruta HOG y la ruta de la calcineurina-Crz1p. Para este fin, hemos aislado el gen TdHOG1 , que codifica un proteína altamente homóloga a la MAP quinasa Hog1p , así como los genes TdENA1 y TdCRZ1 los cuales codifican respectivamente para una proteína homologa a la ATPasa ENA1, implicada en la detoxificación celular de sodio y litio, y para un factor trancripcional con una cierta homología al factor Crz1p de S. cerevisiae. / This work is organized as a compound of five publications. On the first one we confirm that T. delbrueckii strains PYCC5321 and PYCC5323, fulfil the most important requisites of modern baking in sweet and frozen sweet doughs. We also observed that the strain PYCC5321 shows a clear phenotype of osmotolerance and Na+ toxicity resistance in synthetic media. Therefore these strain could be a good model to identify co-ordinately expressed genes under those conditions in bakers yeast. On the second part of this work we used a genomic library of the PYCC5321 strain in order to isolated the TdURA3 gene, encoding a orotidine-5'-phosphate decarboxilase, and we used the sequence of these gene to construct a T. delbrueckii Ura- host strain for genetic manipulation, the FRY112 strain. Due to the potential biotechnological application of Torulaspora, we used these strain to confirm its use as a host of heterologous genes. In the last part of this work, we studied in T. delbrueckii two of the most important pathways implied in osmotolerance and ionic resistance in S. cerevisiae, the HOG pathway and the Calcineurin-Crz1p pathway. For this purpose, we have cloned the TdHOG1 gene, encoding a putative 427-amino acids protein which displayed a high degree of identity with the MAPK Hog1p of S. cerevisiae. We also cloned the TdENA1 and TdCRZ1 genes , which a putative Na+/Li+ P-Type ATPase and a zinc finger protein homologous to S. cerevisiae Crz1p. We concluded that in T. delbrueckii exists a HOG and Calcineurin-Crz1p pathways with different functional roles of S. cerevisiae.