Se ha llevado a cabo un estudio sobre el parasitismo branquial de 91 dentones (Dentex dentex, Pisces, Sparidae). Dicha muestra se compuso de 61 dentones salvajes capturados mediante palangre procedentes de aguas de Mallorca y canal de Menorca, y 30 dentones cautivos procedentes de una jaula situada en el puerto de Mallorca. Se encontraron un total de ocho especies parásitas, un dinoflagélido (Amyllodinium ocellatum), un monogénido (Microcotyle erythrini), un udonélido (Udonella caligorum), un trematodo digenea (Stephanostomum sp. metacercariae), tres copépodos (Caligus productus, Caligus diaphanus y Clavellotis fallax) y un isópodo (Gnathia vorax, praniza larvae). De dichas especies únicamente el dinoflagélido apareció en la muestra de peces cautivos, hallándose el resto de parásitos encontrados en la muestra de peces salvajes. El udonélido Udonella caligorum fue hallado como hiperparásito o foronte de los tres copépodos. Se describen, las prevalencias, intensidades y abundancias medias, así como otros parámetros ecológicos, igualmente se estudia la distribución espacial de cada parásito sobre el tejido branquial. Se discute el hipotético daño que las infecciones producidas por estos parásitos podrían causar en peces cultivados en el área de estudio. No se han podido establecer correlaciones positivas entre los diferentes parásitos y las condiciones de peso/talla del hospedador, no pudiendo concluir por lo tanto, que el número de parásitos aumente según lo hace el tamaño del hospedador. Sólo aparecieron correlaciones positivas entre los cáligos y C. diaphanus y C. fallax. Al ordenar los hospedadores por grupos de peso y estudiar las prevalencias, intensidades y abundancias medias de cada parásito, no se ha encontrado un patrón de comportamiento constante de los diferentes parásitos a lo largo de los grupos de peso. También se estudia qué ocurre con el parasitismo según la talla de los hospedadores, pues es este factor el que muestra la edad del animal. No se observaron diferencias de peso significativas en los hospedadores atribuibles a la carga de parásitos soportada. Por último se examinan cómo se asocian los diferentes parásitos en combinaciones multiparásitas. / A preliminary study of the gill parasites from 91 common dentex (Dentex dentex, Pisces, Sparidae) was developed. Sample was formed by 61 wild fishes caught in waters of Mallorca and Menorca channel (Balearic Islands) and 30 farmed fishes from a cage located in the harbour of Mallorca. Eight parasite species were found: one dinoflagellate (Amyllodinium ocellatum), one monogenean (Microcotyle erythrini), one udonellidean (Udonella caligorum), one digenean trematode (Stephanostomum sp. metacercariae), three copepods (Caligus productus, Caligus diaphanus and Clavellotis fallax) and one isopod (Gnathia vorax, praniza larvae). The udonellidean U. caligorum was found as a hyperparasite or phoront of the three copepods. Prevalence, mean intensity and abundance and other ecological parameters as well as the spatial site of each parasite in the gill tissue are described. It also discusses the hypothetical damage that infections might cause in sea cage-farmed common dentex from the same area through interaction between wild and farmed common dentex populations. Positive correlations among the different parasites and the host conditions (size/weight) have not been found, so we could not affirm that the number of parasites increases with host body size. We only found positive correlations between both caligid copepods and between C. diaphanus and C. fallax. After grouping hosts in weight classes and studying the prevalence, mean intensity and abundance of each parasite, any of them showed a constant behavior pattern along such weight classes. Host size and parasitism is analyzed in order to know the possible relationship between parasitism and host age. No significative differences on host weight in relation with the parasitic burden were detected. The multiparasitic combinations are also examined.

El molusco bivalvo Pinna nobilis, perteneciente al orden Pterioida, es una especie endémica del Mar Mediterráneo, que suele habitar en las praderas de fanerógamas marinas, donde vive semienterrado, anclado mediante los filamentos del biso. Se trata del molusco más grande del Mediterráneo, ya que puede superar los 80 cm de longitud. El deterioro generalizado de las zonas costeras ha afectado también a esta especie, que ha sido incluida en el Anexo II de la directiva de hábitats, el Anexo IV del Convenio de Barcelona y el Anexo II del Catálogo Nacional de Especies Amenazadas. El presente proyecto de Tesis supone una nueva aportación sobre las características de las poblaciones de esta especie en su medio natural desde un enfoque dinámico, abordando el cambio en el tiempo de una densa población localizada en la ensenada de Moraira (Alicante). Además, se ha profundizado en el estudio de aspectos de su biología y fisiología como el sistema de fijación al sustrato, que ha sido descrito en profundidad, así como la actividad de las valvas y el estudio de la abertura ponderada de las mismas. Por último, se ha estudiado la morfometría dinámica de las valvas, un aspecto muy característico de esta especie, capaz de reconstruir la concha de una forma original, después de grandes procesos de erosión anterior, sin que su característica forma triangular se pierda en el proceso.Los resultados han destacado la gran importancia del hidrodinamismo en la estructura de la población y la existencia de importantes diferencias en la densidad de individuos y la media de tamaños, que aumentan con el incremento de la profundidad. Asimismo, se han observado diferencias muy importantes en las tasas de mortalidad y crecimiento, según la cota de profundidad donde habitan los individuos. El gran número de filamentos que unen al animal al fondo, más de 20.000 y las diversas estrategias de fijación, que se caracterizan por ser muy elaboradas, han hecho suponer que la fijación al sustrato es fundamental para la supervivencia de los individuos, en respuesta a estrés hidrodinámico.El estudio de la actividad de las valvas ha puesto en evidencia que esta especie realiza ciclos circadianos y circalunares, siguiendo estrechamente la posición del Sol y la Luna, de forma que en términos generales, Pinna nobilis cierra las valvas por la noche, excepto cuando la luna está presente en el cielo con el disco iluminado por encima del 50%.Finalmente, el estudio de la morfometría dinámica de la concha ha permitido detectar una serie de registros internos que sirven para estudiar la edad y el crecimiento de los individuos. Además, el descubrimiento de un proceso continuo de neoformación de la concha, mediado por procesos de erosión y reconstrucción anterior, supone una explicación a las causas del polimorfismo de esta especie. A este respecto, se aporta por primera vez una explicación soportada por numerosas pruebas, a la forma papyracea de la concha descrita por Czihak y Dierl (1961).

El coure (Cu) és un element essencial per tal de dur a terme les reaccions de transferència d’electrons en els organismes de metabolisme aerobi. Tanmateix, la citotoxicitat associada a l’excés de Cu, deguda a la producció d’espècies reactives d’oxigen (ROS), implica l’existència de mecanismes homeostàtics regulats de forma precisa. La majoria dels elements de la xarxa homeostàtica del Cu està conservada en els organismes eucariotes. Els transportadors de Cu d’alta afinitat CTR/COPT hi participen durant el procés d’adquisició del metall sota condicions de deficiència. En la present tesi s’escomet l’establiment dels rangs nutricionals de Cu i la identificació de marcadors moleculars associats en la planta model Arabidopsis thaliana. En base als resultats obtesos, se suggereix que els medis ½MS suplementats amb una concentració entre 0.5 i 1 M de CuSO4 comprenen el rang de suficiència de Cu. Per altra banda, l’excés de Cu s’associa als medis suplementats amb una concentració igual o superior a 5 M CuSO4, mentre que la deficiència de Cu s’estableix en els medis suplementats amb una concentració inferior a 0.5 M de CuSO4. El patró d’expressió dels mRNA regulats per Cu suggereix que COPT2 i FSD1 esdevenen marcadors moleculars per detectar el dèficit de Cu, mentre que l’expressió de CCS i CSD1 s’associa a rangs òptims. Atenent a aquests paràmetres, s’ha aportat noves evidències de què el medi ½ MS comercial, considerat un medi estàndard per créixer plantes, esdevé un medi deficient en Cu. En segon lloc, s’ha abordat la caracterització de les proteïnes COPT2, COPT6 i COPT5 d’Arabidopsis thaliana. Podem concloure que COPT2 i COPT6 constitueixen, junt amb COPT1, els transportadors de membrana plasmàtica. Ara bé, mentre que sota condicions de deficiència de Cu COPT1 i COPT2 s’expressen fonamentalment a l’arrel principal amb un patró no solapant, COPT6 és un gen d’expressió exclusiva a la part aèria, els nivells del qual no s’alteren per Cu. La importància del Cu en la planta es reflecteix en què tots tres transportadors de membrana plasmàtica s’expressen a l’embrió i als teixits reproductius, i s’evidencia pels fenotips dels mutants per pèrdua de funció. Tot i que els mutants de pèrdua d’expressió copt2 no exhibeixen alteracions en deficiència de Cu, els mutants COPT1 antisentit manifestaven una disminució en el contingut de Cu endogen i alteracions morfològiques en el gra de pol•len, mentre que la línia mutant copt6 produeix menys llavors que les línies silvestres en condicions de dèficit de Cu. COPT5, per la seua banda, esdevé un transportador intracel•lular probablement associat al compartiment prevacuolar (PVC) d’expressió àmplia en el cos de la planta, a excepció de les anteres i del gra de pol•len, preferentment a nivell de feixos vasculars i nervadures. La manca d’expressió de COPT5 en els mutants per pèrdua de funció causa una hipersensibilitat al dèficit sever de Cu que es tradueix en la inhibició del creixement de l’arrel principal, pèrdua de pes fresc i un estat avançat de clorosi. De la mateixa manera, el dèficit sever de Cu implica en els mutants copt5 una disminució dràstica en el flux de la cadena de transport d’electrons entre fotosistemes, probablement degut a alteracions en la distribució del Cu a la plastocianina. Tot plegat, COPT5 constitueix una via essencial per a la distribució del Cu en condicions de dèficit sever i perllongat de Cu. Les dades aportades en la present tesi doctoral contribueixen a millorar el coneixement de la resposta d’Arabidopsis thaliana al dèficit de Cu i bastiran el desenvolupament de futures estratègies biotecnològiques enfocades tant a la millora de l’adquisició del Cu com a la fitorremediació. / Copper (Cu) is an essential element that participates in electron transfer reactions in aerobic organisms. Nevertheless, Cu excess causes toxicity among others reasons due to reactive oxygen species generation. Eukaryotic cells display conserved homeostatic networks in which the CTR/COPT proteins are involved in high affinity Cu uptake under environmental deficient conditions. In this thesis, we have first studied the availability of Cu in the Arabidopsis thaliana growth medium ½MS. We show that the ½MS medium supplemented with 0.5-1 M CuSO4 represents the Cu sufficiency range, whereas Cu excess is achieved in media with more than 5 M CuSO4 and Cu deficiency results from growth in media with a concentration of CuSO4 bellow 0.5 M. Furthermore, gene expression studies at different Cu concentrations suggest that COPT2 and FSD1 are appropriate markers for Cu deficiency in Arabidopsis. We have also characterized the role played by COPT2, COPT6 and COPT5 in Arabidopsis. According to the expression studies performed with COPT::GFP fusion constructs, COPT2 and COPT6 are plasma membrane proteins. By using COPTp::GUS plants, we show that COPT2 is a Cu-regulated gene, mostly expressed in roots, whereas COPT6 is predominantly expressed in aerial tissues in a Cu-independent manner. Interestingly, our studies demonstrate that Arabidopsis COPT5 is a protein associated to the prevacuolar compartment and expressed through the whole plant, except in anthers and pollen grains. Moreover, copt5 knock-out lines are hypersensitive to Cu deficiency and exhibit an inhibition of the main root growth and a decrease in both fresh weight and chlorophyll when compared to the wild type. Furthermore, Cu deficiency causes the impairment of copt5 electron transport between photosystems, probably due to problems in Cu delivery to plastocyanin. Altogether, these data suggest that COPT5 functioning is crucial for Cu delivery under severe Cu deficiency conditions.

Dada la influencia negativa de la presencia de aminas biógenas en el vino, por el efecto perjudicial sobre la salud humana y por la disminución de la calidad del vino y dada también la presencia de las bacterias lácticas (BL) en los mismos, en esta tesis nos planteamos determinar la importancia de las BL en la presencia de estas aminas en el vino, así como que factores podían influir en la concentración de las mismas o en la mayor o menor producción por parte de las BL.En primer lugar, desarrollamos un método enzimático que permite analizar la concentración de histamina en vino y la producción de la misma por BL, a continuación analizamos la concentración de histamina, tiramina, feniletilamina, putrescina, cadaverina y triptamina en vinos de distintas zonas geográficas y de distintas variedades de uva, así como la influencia del pH, de la fermentación maloláctica y de los periodos de almacenamiento, además, la capacidad aminobiogénica de bacterias aisladas de algunos vinos también fue analizada. Entre otros resultados, pudimos comprobar que era durante la fermentación maloláctica cuando incrementaban los niveles de histamina, tiramina y feniletilamina, pero no de las otras aminas estudiadas, además encontramos BL capaces de producir histamina, tiramina y feniletilamina, pero no putrescina, cadaverina ni triptamina. Ante la necesidad de desarrollar un método molecular que nos permitiera identificar la presencia del gen de la tirosina descarboxilasa (tdc) en BL de origen enológico, nos planteamos la secuenciación y caracterización molecular del operón tdc del Lactobacillus brevis 9809, encontrándonos que este operón contiene 4 genes completos que codifican para una tirosin-RNAt sintetasa, para la tirosina descarboxilasa, para una probable tirosina permeasa y para un antiporter Na+/H+.Posteriormente, analizamos mediante métodos moleculares y bioquímicos la capacidad de producción de histamina, tiramina y feniletilamina por parte de más de 150 cepas de BL, además de correlacionar la presencia en vinos de estas aminas con la capacidad de producción de las mismas por las BL presentes en los mismos, observamos que Lactobacillus hilgardii y Pediococcus parvulus eran los responsables de los elevados niveles de histamina en vino y que la mayor parte de los Oenococcus podían producir esta amina, pero no representaban un peligro al producir bajos niveles. En cuanto a la tiramina, todos los Lactobacillus brevis y algún Lactobacillus hilgardii producían tiramina y feniletilamina atribuyéndose a estas especies la responsabilidad de los niveles de tiramina y feniletilamina.Finalmente, estudiamos la influencia de factores físico-químicos del vino y la fase de crecimiento sobre la producción de histamina, pudimos comprobar como la glucosa y fructosa y los ácidos málico y cítrico junto con la histamina disminuían la expresión del gen de la histidina descarboxilasa y por tanto la producción de histamina, por otro lado la histidina aumentaba dicha expresión, además la presencia de ciertos niveles de etanol y pyridoxal 5-fosfato aumentaba la producción de histamina actuando sobre el enzima histidina descarboxilasa, por último observamos como la fase de crecimiento de las BL influye decisivamente en la expresión del gen de la histidina descarboxilasa. / Biogenic amines are organic bases endowed with biological activity which are frequently found in fermented foods and beverages. They are produced mainly as a consequence of decarboxylation of amino acids. High concentrations of biogenic amines can cause undesirable physiological effects in sensitive humans, especially when alcohol and acetaldehyde are presentIn this work, we describe a new enzymatic method that allows directly estimating histamine concentration in synthetic media, grape must or wine (white, rosé and red) without polyphenols or sugar interferences. This new enzymatic method shows a good correlation (r=0.996, p<0.001) between the histamine concentrations and absorbances in the interval 0.4 to 160 mg l-1.The influence of grape variety, type of vinification, wine pH, malolactic fermentation, and storage in bottle on biogenic amine concentrations was also studied. Results show important differences in putrescine and histamine concentrations between regions, varieties of grape and type of wine; differences were less appreciable for the remaining biogenic amines studied. Low pH prevented biogenic amine formation. Malolactic fermentation and short storage periods in bottle (3 - 6 months) showed increases in histamine concentration, while longer periods of storage led to a general decrease in histamine. Grape varieties, different types of winemaking, pH and lactic acid bacteria may be responsible for the differences observed in the biogenic amine concentration of wines analyzed.Strains of lactic acid bacteria were isolated in this work, and their ability to form biogenic amines was assayed in synthetic media, grape must and wine. The species exhibiting the highest frequency of histamine production is Oenococcus oeni. However, the concentration of histamine produced by this species is lower than the produced by strains belonging to species of Lactobacillus and Pediococcus. A correlation of 100% between presence of histidine decarboxylase gene and histamine production was observed. The main wine species tyramine and phenylethylamine producer was Lactobacillus brevis whereas this character was no present or infrequent in the rest of analysed wine strains.The sequence of tyrosine decarboxylase operon contained four complete genes encoding atyrosyl-tRNA synthetase, the tyrosine decarboxylase, a probable tyrosine permease and a Na+/H+ antiporter.The aim of this work was also to study the influence of enological factors (organic acids, sugars, ethanol, histidine, histamine, SO2, pH and temperature) on the hdc expression and on HDC activity in Lactobacillus hilgardii, Pediococcus parvulus and Oenococcus oeni. Cell extracts and whole cells were used to study the influence of different factors on histidine decarboxylase gene (hdc) expression and histidine decarboxylase enzyme (HDC) activity. Glucose, fructose, malic acid, citric acid and histamine diminished the hdc expression, while ethanol and histidine increased the histidine decarboxylase enzyme activity. Temperature and pH had effect on the activity of HDC but not on hdc expression. Tartaric acid and L-lactic acid, and SO2 had no effect on enzyme synthesis and activity. Lb hilgardii is the most active, and O. oeni the less one, lactic acid bacteria species difer in the relative enzymatic activity but all the factors affected in the same way to Lb. hilgardii, P. parvulus and O. oeni. The hdc gene expression was lowered by glucose, fructose, malic acid, and citric acid, whereas ethanol enhanced the HDC enzyme activity. This behavior was observed for all the studied microorganisms. Thus, the conditions that normally occur during malolactic fermentation and later on, could favor the histamine production. SO2 could prevent bacterial growth, but does not diminish the HDC enzyme activity.

La transformación del mosto de uva en vino es un proceso microbiológico complejo aunque la fermentación alcohólica es llevada a cabo generalmente por cepas de Saccharomyces.El uso de inóculos de cepas preseleccionadas es frecuente en bodega dado que la cepa iniciadora se impone sobre las indígenas proporcionando ventajas encaminadas a una mayor producción y a una mejora de la calidad. El empleo de cultivos iniciadores hace necesario el establecimiento de criterios de selección de cepas con características deseables para su uso industrial. Además, el conocimiento en profundidad de la biología de estas levaduras permite el diseño de estrategias de mejora genética encaminadas a una mejora del proceso y/o de la calidad.C1. Caracterización fisiológica de cepas de Saccharomyces sp.: Estudio de la relación entre comportamiento fermentativo y resistencia a estrés.Se estudió el comportamiento fermentativo de diferentes cepas vínicas y se determinó su sensibilidad a diferentes condiciones de estrés demostrándose que existe una correlación estadísticamente significativa entre la capacidad de consumo de azúcares en condiciones de vinificación y la sensibilidad a dos condiciones de estrés, el oxidativo y el causado por adición de etanol.Los ensayos de resistencia a estrés pueden ser utilizados como criterios de selección de cepas con buen poder de fermentación. C2. Expresión de genes de respuesta a estrés durante la vinificación.Se analizó el perfil de expresión de genes de respuesta a estrés en diferentes condiciones de vinificación y en cepas con diferente comportamiento fermentativo. En cuanto a condiciones se ha visto que al inicio de la vinificación existe una influencia del pH del mosto y de la temperatura de incubación en la expresión de los genes analizados. En cuanto a expresión diferencial entre cepas se ha observado que las cepas con problemas fermentativos leves muestran en algunas fases de la vinificación y en algunos de los genes analizados niveles de expresión inferiores al resto de las cepas. En las cepas con problemas fermentativos graves el perfil de expresión es muy particular en varios de los genes mostrando algunos de ellos niveles máximos y mantenidos. A la vista de los resultados la correcta expresión de genes de respuesta a estrés parece importante para una adecuada adaptación de las levaduras a las condiciones de vinificación.C3. Expresión global en cepas con diferente comportamiento fermentativo durante la entrada en fase de crecimiento estacionaria.Se comparó la expresión génica (mediante micromatrices de DNA) y proteica (mediante electroforesis bidimensional) de una cepa con buen comportamiento fermentativo y otra cepa con leves problemas de vinificación. Así, se han podido determinar algunos factores moleculares que podrían explicar las diferencias fisiológicas entre estas dos cepas como aspectos relacionados con metabolismo de carbohidratos, con oxidación de compuestos orgánicos, con metabolismo del ergosterol y con respuesta a estrés. Además, se han observado diferencias de expresión de otros genes y proteínas que pueden ser relevantes para el uso industrial de estas levaduras.C4. Aplicaciones biotecnológicas. Se ensayó el comportamiento de las cepas en mostos naturales y partiendo de levadura seca activa demostrándose un comportamiento muy similar al que se había observado en vinificaciones con mosto sintético y con levaduras procedentes de cultivos líquidos.En segundo lugar se contruyeron cepas auxótrofas para uracilo de manera que se pueda estudiar el efecto de manipulaciones genéticas. Así, se puede ensayar la sobreexpresión de genes que mejoren la capacidad fermentativa en la cepa incapaz de completar el proceso de manera que no es necesario recurrir a condiciones limitantes de vinificación. / Must grape transformation into wine is a complex microbiological process although the alcoholic fermentation is mainly carried out by Saccharomyces strains. The use of preselected wine yeasts commercially available as active dry yeast is frequent since the initiator strain prevails on the natives providing advantages directed to a greater production and quality improvement. The use of this methodology makes necessary the establishment of criteria of wine yeast selection with desirable characteristics for its industrial use. In addition, a depth knowledge of the biology of these yeasts allows the design of genetic manipulation directed to an improvement of the process and/or a better quality of the final product. In this PHD project different wine yeast were characterized in order to obtain strains with different capabilities to conduct the vinification process. The resistance of these strains to different stress conditions was tested and we found a statistically significant correlation between the fermentative behaviour and the resistance to stress conditions. Later on we studied the molecular response of some of these yeasts analysing gene expression (RT-PCR quantitative and semi quantitative, micro arrays, macro arrays) and protein profiles (two-dimensional electrophoresis). With these studies it has been possible to determine some molecular factors that could explain the physiological differences between the strains like aspects related to carbohydrate metabolism, oxidation of organic compounds, metabolism of ergosterol and stress response. In addition, differences in the expression of other genes and proteins could be relevant for the industrial use of these strains. Finally, we tested the fermentative behaviour of these strains in conditions that try to mimic those which are found in the winery (natural must, active dry yeast) obtaining similar results to the previous experiments (synthetic must, liquid culture). Moreover we introduced an autotrophy in one of the strains with fermentative problems so it is possible to study the overexpression of genes which can improve the fermentative behaviour in non-limiting conditions.