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La voie RhoA/Rho-kinases (ROCK) joue un rôle important dans la physiopathologie de l’hypertension pulmonaire (HTP) par son implication dans le dysfonctionnement endothélial, la constriction et le remodelage des vaisseaux pulmonaires. Selon les classifications internationales, la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) et la pneumopathie infiltrante diffuse (PID) sont deux causes fréquentes d’HTP ayant en commun plusieurs mécanismes physiopathologiques dont le dysfonctionnement endothélial, le remodelage vasculaire et la fibrose parenchymateuse. Les objectifs de ce travail étaient d’étudier le rôle de la voie RhoA/ROCK dans la physiopathologie de la BPCO et de la PID avec ou sans HTP et de préciser les anomalies moléculaires liées à la perturbation de la signalisation de cette voie dans chacune de ces situations.Le dysfonctionnement endothélial est un événement essentiel dans l’initiation et la progression de la BPCO. L’activation de la voie RhoA/ROCK dans le dysfonctionnement endothélial systémique et pulmonaire a été mise en évidence chez les tabagiques avec ou sans BPCO. Les résultats de notre première étude montrent l’existence d’une activation de la voie RhoA/ROCK au niveau des artères pulmonaires chez les patients BPCO ayant un dysfonctionnement endothélial, et une corrélation entre l’activité de la RhoA et l’expression génique et l’activité de la NO synthase endothéliale (NOS-3).L’HTP est une complication grave des PID. Nous avons montré dans notre deuxième étude l’implication de la voie RhoA/ROCK dans la réponse inflammatoire et la fibrose pulmonaire (FP) dans un modèle murin de PID induite par injection intratrachéale de bléomycine (BLM). Nous avons ensuite testé l’effet préventif du fasudil, un inhibiteur des ROCK, sur l’apparition de la FP et l’HTP expérimentales induites par la BLM. Les résultats de cette deuxième étude montrent que la FP et l’HTP sont associées à une activation de la voie RhoA/ROCK dans ce modèle murin et que le fasudil inhibe la réponse inflammatoire, la FP et l’HTP, via l’inhibition de la phosphorylation de Smad2/3 de la voie de signalisation par le TGF-β1.La FP et l’HTP représentent deux causes principales de mortalité liée à la sclérodermie systémique (ScS). Nous avons étudié le rôle de la voie RhoA/ROCK dans la physiopathologie de la fibrose cutanée et l’atteinte pulmonaire dans un modèle murin de ScS induite par injection intradermique d’acide hypochloreux (HOCl). Les résultats de cette troisième étude montrent l’association entre la fibrose cutanée induite par l’HOCl et l’activation de la voie RhoA/ROCK au niveau de la peau, et l’effet préventif du fasudil sur la fibrose cutanée et pulmonaire, en partie via l’inhibition de la phosphorylation de Smad2/3 et de l’activation des protéines ERK1/2. Ces résultats suggèrent l’implication de la voie RhoA/ROCK dans la physiopathologie de la BPCO et de la PID avec ou sans HTP. La voie RhoA/ROCK pourrait de ce fait représenter une nouvelle cible thérapeutique dans la BPCO et la PID avec ou sans HTP.Mots-clés : RhoA, Rho-kinases, fasudil, BPCO, fibrose pulmonaire, hypertension pulmonaire. / The RhoA/Rho-kinases (ROCK) pathway plays a pivotal role in the pathophysiology of pulmonary hypertension (PH) as its abnormal activation leads to endothelial dysfunction, sustained vasoconstriction and pulmonary vascular remodeling. According to the international classification of PH, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and interstitial lung disease (ILD) represent two main causes of PH associated with chronic respiratory diseases. These two causes have in common major pathophysiological mechanisms such as endothelial dysfunction, vascular remodeling and interstitial fibrosis. The aims of the present study were to investigate the role of the RhoA/ROCK pathway in the pathophysiology of lung vascular and interstitial injuries in COPD and ILD with or without development of PH, and to study the molecular mechanisms associated with regulation of the RhoA/ROCK pathway in each of these situations.The pulmonary endothelial dysfunction is an essential event in the initiation and progression of COPD. Although the role of the RhoA/Rho-kinase pathway in pulmonary endothelial dysfunction has been demonstrated in smokers with normal lung function, little is known about its role in patients with COPD. The results of our first study demonstrated an increase in RhoA and ROCK activity in pulmonary arteries of patients with COPD, simultaneously with an altered pulmonary endothelial-dependent vasodilation. The increased RhoA activity in patients with COPD was correlated with an impairment of the gene expression and activity of endothelial NO synthase (eNOS).PH associated with pulmonary fibrosis (PF) considerably worsens prognosis of ILD. The results of our second study showed an activation of the RhoA/ROCK pathway in lung tissues of mice intoxicated by intratracheal instillation of bleomycin (BLM). BLM induced severe PF and PH in mice, associated with an increased RhoA and ROCK activity in the lung. We further demonstrated that long-term treatment with fasudil, a selective ROCK inhibitor, reduced BLM-induced lung inflammation, lung fibrosis and PH in mice, at least in part, via inhibition of Smad2/3 phosphorylation in TGF-β1 signaling.PF and PH represent two leading causes of death in patients with systemic sclerosis (SSc). In our third study, we investigated the role of the RhoA/ROCK pathway in the pathophysiology of skin fibrosis and lung injuries in a murine model of SSc induced by intradermal injection of hypochlorous acid (HOCl). We demonstrated that HOCl-induced skin fibrosis was associated with an activation of the RhoA/ROCK pathway in the fibrotic skin, and that long-term treatment with fasudil reduced both skin and lung fibrosis through inhibition of the phosphorylation of Smad2/3 and ERK1/2 in the fibrotic skin.These results suggest the implications of the RhoA/ROCK pathway in the pathophysiology of lung vascular and interstitial injuries in COPD and ILD with and without development of PH. The RhoA/ROCK pathway might be a promising therapeutic target for patients with COPD or ILD with and without PH.

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Chronic neonatal pulmonary hypertension (PHT) frequently presents with rightventricular (RV) dysfunction. In neonatal rats exposed to chronic hypoxia, RV dysfunction is reversed by sustained rescue treatment with a Rho-kinase (ROCK) inhibitor – the caveat being systemic hypotension. We therefore examined the reversing effects of pulmonary-selective ROCK inhibition. Rat pups were exposed to air or hypoxia from birth for 21 days and received sustained rescue treatment with aerosolized Fasudil (81 mg/ml t.i.d for 15 min) or i.p. Y27632 (15 mg/kg b.i.d) from days 14-21. Inhaled Fasudil normalized pulmonary vascular resistance, and reversed pulmonary vascular remodeling but did not improve RV systolic function. Systemic, but not pulmonary-selective, ROCK inhibition attenuated increased RV ROCK activity. Our findings indicate that RV dysfunction in chronic hypoxic PHT is not merely a result of increased afterload, but rather may be due to increased activity of ROCK in the right ventricle.

Chronic neonatal pulmonary hypertension (PHT) frequently presents with rightventricular (RV) dysfunction. In neonatal rats exposed to chronic hypoxia, RV dysfunction is reversed by sustained rescue treatment with a Rho-kinase (ROCK) inhibitor – the caveat being systemic hypotension. We therefore examined the reversing effects of pulmonary-selective ROCK inhibition. Rat pups were exposed to air or hypoxia from birth for 21 days and received sustained rescue treatment with aerosolized Fasudil (81 mg/ml t.i.d for 15 min) or i.p. Y27632 (15 mg/kg b.i.d) from days 14-21. Inhaled Fasudil normalized pulmonary vascular resistance, and reversed pulmonary vascular remodeling but did not improve RV systolic function. Systemic, but not pulmonary-selective, ROCK inhibition attenuated increased RV ROCK activity. Our findings indicate that RV dysfunction in chronic hypoxic PHT is not merely a result of increased afterload, but rather may be due to increased activity of ROCK in the right ventricle.

Durant ces dernières années, de nombreuses études épidémiologiques ont mis en évidence que les pathologies métaboliques (obésité, diabète) et cardiovasculaires pourraient, en partie, se déterminer dès la grossesse, via des perturbations de l’environnement intra-utérin. La notion de « programmation fœtale » implique qu’une altération durant la vie fœtale perturberait le développement du fœtus et le vulnérabiliserait au développement ultérieur de pathologies. Ainsi, un enfant qui naît avec un très faible poids de naissance (inférieur à 2,4 kg) ou à l’inverse avec un poids de naissance très élevé (supérieur à 4,0 kg) est statistiquement plus vulnérable au développement de ces maladies. Pour étudier ce phénomène et tenter d’en comprendre les mécanismes, nous avons utilisé des modèles expérimentaux (rat, souris) et évalué l’action et l’expression de deux substances vasodilatatrices : le Fasudil (un inhibiteur des Rho kinases) et l’hormone apeline. Les rates gestantes traitées par le L-NAME, un inhibiteur de la NO synthase (50 mg/jour) présentaient une hypertension artérielle et leurs nouveau-nés un retard de croissance intra-utérin (RCIU) de l’ordre de 20%. L’administration aux mères de Fasudil (10 mg/jour) permettait de restaurer une pression artérielle normale en fin de gestation et améliorait considérablement la croissance fœtale des animaux exposés au L-NAME. Cependant, alors que les animaux nés avec un RCIU (nouveau-nés L-NAME) ne présentaient que peu de perturbations métaboliques à l’âge adulte, les animaux exposés au Fasudil seul étaient rapidement en surpoids, présentaient une hyperglycémie à jeun et développaient des troubles du comportement alimentaire de type hyperphagique. D’autre part, par une étude menée chez des souris obèses et intolérantes au glucose après exposition à un régime hyperlipidique, nous avons démontré que l’expression génique de l’apeline est altérée dans plusieurs organes (foie, rein, tissu adipeux) bien que l’apelinémie des souris obèses reste inchangée. Des études en voie de finalisation sont menées afin de déterminer si le système apelinergique est modulé chez des souris gestantes obèses à la fois chez les compartiments maternels et fœtaux mais aussi dans le placenta. En conclusion, nous avons démontré que l’inhibition de la voie des Rho kinases en fin de gestation programme chez la descendance un surpoids, une hyperglycémie et à une altération de la prise alimentaire. Ayant démontré que le système apelinergique est altéré chez des souris femelles obèses et intolérantes au glucose, il nous reste à déterminer si ce système est aussi perturbé en condition de grossesse associée à l’obésité maternelle. / During the last decade, many epidemiological studies have shown that adult chronic metabolic (obesity, diabetes) and cardiovascular diseases may be determined, at least in part, during pregnancy through alterations of intrauterine environment. The “fetal programming” hypothesis implies that disturbances of the fetal development (intra uterine growth restriction – IUGR or macrosomia) increase the vulnerability to develop these pathologies in adulthood. To gain more insight into the mechanisms implicated in fetal programming, we used two experimental models of rodents (rat, mouse) and evaluated first the effect of an inhibition of the Rho-kinase pathway in utero on fetal growth and postnatal development in rats. In another study performed in mice, we aimed to assess the expression of apelin and its receptor APJ in obese and glucose intolerant mice fed with a high fat diet. Using data of this preliminary study, we speculated that this signaling system may be targeted during the pregnancy of obese mothers and could be implicated into the physiopathological consequences that may affect the fetoplacental unit. We demonstrated that pregnant rats treated by L-NAME, a NO synthase inhibitor (50 mg/day) were hypertensive and that their newborns presented a dramatic IUGR. Maternal treatment with the vasodilator Fasudil (10 mg/day) restored a normal maternal blood pressure and remarkably alleviated the fetal growth of L-NAME newborns. In adults, L-NAME male rats developed mild metabolic pathologies whereas rats exposed in utero to Fasudil presented an overweight, with hyperphagia and glucose intolerance. In obese and glucose intolerant mice fed with a high fat diet, we showed that apelin gene expression was altered in several organs (liver, kidney and adipose tissue) without any variation of apelin plasma concentration. Further studies are currently performed in our laboratory to unravel the expression of the apelin/APJ pathway in pregnant obese mice and their offsprings.

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La rétinopathie diabétique (RD) se compose d’une part d’une ischémie rétinienne périphérique et d’autre part d’une exsudation rétinienne responsable d’un œdème maculaire diabétique, première cause de cécité chez les moins 55 ans. Les traitements utilisés actuellement sont non spécifiques et traitent les complications tardives de la RD. Les phases précoces de la RD ne sont donc pas ciblées. L’hyperglycémie chronique entraine un stress oxydant et une activation des PKC qui participent à l’altération des BHR. L’objectif de ce travail a été 1°) d’étudier l’implication de la PKCζ et de la voie Rho/ROCK/Myosine II sur la physiopathogénie de la RD et 2°) de montrer l’effet bénéfique de leurs inhibiteur sur les BHR et sur la reperfusion des capillaires rétiniens. Nous avons confirmé l’hyperactivation de la PKCζ et de la voie Rho/ROCK/Myosine II chez les rats diabétiques et leur participation à la rupture de la BHR externe. Le traitement par leurs inhibiteurs respectifs normalise l’activation des deux enzymes et restaure l’intégrité anatomique et fonctionnelle de la BHR externe. De plus l'hyperactivation de ROCK altère la perfusion rétinienne par 1) constriction focale artériolaire, 2) protrusions membranaires endoluminales des cellules endothéliales (blebbing) et 3) vasoconstriction capillaire diffuse. Nous avons montré que l'ensemble de ces phénomènes étaient réversibles par traitement intravitréen de son inhibiteur le Fasudil. De manière importante le traitement par Fasudil induit également une diminution du VEGF rétinien responsable de la perméabilité des barrières et témoin indirect de l’ischémie rétinienne. Ces travaux éclairent la physiopathogénie de la RD et ouvre des perspectives thérapeutiques permettant de cibler les événements précoces de la RD. / Diabetic retinopathy (DR) mainly results from peripheral retinal ischemia and exudation leading to sight threatening complications such as retinal neovascularization or macular edema. This latter represents the main cause of visual loss among working age individuals. Current treatments address late complications of DR and are non-specific. Therefore, early events are currently not addressed. Chronic hyperglycemia increases oxidative stress and activates PKC leading to blood retinal barrier (BRB) breakdown. The aims of the present work were two fold. First, to assess the implication of PKCζ and the Rho/ROCK/Myosin II pathway on the pathogenesis of DR and second, to assess whether their specific inhibitors have the potential to restore the phenotype. Herein we have demonstrated the pathogenic role of PCKζ and ROCK hyperactivation on the development of diabetes induced external BRB breakdown. Furthermore their inhibitors restored the morphologic and functional aspect of the external BRB. We also found that ROCK hyperactivation was responsible for altered retinal perfusion through several mechanism namely 1) focal constriction of retinal arterioles; 2) endoluminal protrusions of the endothelial cell membrane (blebs) and 3) capillary diffuse vasoconstriction. We were able to demonstrate that all this aspects were reversible by Fasudil, a ROCK inhibitor, administrated into the vitreous. Of importance this treatment decreased also retinal VEGF that is a well-known factor responsible for barrier breakdown and a surrogate marker for retinal ischemia. To conclude the present findings not only shed light on the mechanisms of DR but also open new therapeutic avenues addressing the early events of DR a current unmet medical need.

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Parkinsons sjukdom (PD) är ett tillstånd som ger en försvårad och försämrad livskvalité. I dagsläget finns det endast symtomatiska läkemedel men ingen bot med vilken sjukdomen upphör eller som bromsar förloppet. Pågående forskningsarbete utgår bland annat från att ta fram nya läkemedel men även också undersöka om redan befintliga läkemedel går att använda som behandling av PD. Många av de redan befintliga läkemedlen som testas är de som har förmågan att påverka proteinet α-synuklein (α-syn) och dess aggregering, som visats vara en central orsak till uppkomsten av PD. I föreliggande litteraturstudie undersöktes på vilket sätt en del läkemedel vars indikation är PD och även andra sjukdomstillstånd såsom astma, påverkar (ex. påskyndar eller inhiberar) in-vitro aggregering av α-syn. Därutöver genomfördes en detaljerad analys av de utvalda läkemedlen och deras effekt på α-syn aggregering utifrån deras kemiska egenskaper med avseende på löslighet (hydrofila, lipofila, amfifila) och inbindning till α-syn. Här kunde det visas att aggregering av α-syn inhiberades av alla utvalda läkemedel förutom dexametason, som istället påskyndade aggregeringskinetiken för proteinet. Dessutom uppvisade fasudil, ceftriaxon, dopamin, entakapon och tolkapon inbindning till delar av (hydrofila, hydrofoba eller amfifila) vilka delade samma fysikalkemiska egenskaper som α-syn. Därtill uppvisade utvalda läkemedel med till viss del plana strukturer (ex. aromatiska ringar) direkt inbindning till α-syn, vilka också rapporterats ha en något högre grad av transport över blod-hjärnbarriären, dock måste dessa fynd mer noggrant undersökas. Sammanfattningsvis visade alla utvalda läkemedel förutom dexametason anti-aggregeringsegenskaper (hämmande) mot α-syn genom att antingen indirekt eller direkt binda till proteinet och därmed hindra proteinet från att börja binda till sig själv. Mer studier måste genomföras för att studera effekten av läkemedelsexponering på α-syn för att identifiera viktiga segment av proteinet som kan utgöra läkemedelsmål för inhibering av α-syn aggregering. / Parkinson's disease (PD) is a condition that leads to an aggravated and worsened quality of life. At present, there are only symptomatic drugs for PD but no cure that eradicate the disease nor halter the disease progression have been found. Current research is being carried out to develop new drugs, but efforts also investigate whether existing drugs can be used as treatment for PD. Many of the already existing drugs being tested are those that have the ability to interact with a protein called α-synuclein (α-syn), that has been implicated to be a major player for onset of PD. In the present literature study, it was investigated in what way some drugs, whose indication is PD but also other diseases such as asthma, affect (i.e. propagate or inhibit) the in-vitro aggregation kinetics of αsyn. Additionally, a detailed analysis of the investigated drugs and their effect on the aggregation pathway was made to characterize common chemical features of the selected drugs based upon choice of solvents and binding to α-syn. Here, it could be shown that aggregation of α-syn is inhibited upon exposure to all selected drugs except dexametason which instead propagated aggregation of α-syn. In addition, fasudil, ceftriaxone, dopamine, entacapone and tolcapone was found to bind to parts (hydrophilic, hydrophobic or amphiphilic) of α-syn similar to their solubility features. Moreover, the selected drugs that were found to bind to α-syn seemed to exhibit planar in structure (i.e. aromatic rings) and also be associated to pass the blood-brain barrier to a greater extent, however these findings need to be more thoroughly investigated. In summary, all drugs but dexametason were shown to inhibit aggregation of α-syn invitro by either indirectly or directly affecting the aggregation of the protein. Further investigations need to be carried out to study the effect of drug exposure on α-syn aggregation in order to propose key segments of α-syn that can act as drug targets for inhibition of protein aggregation.