Evidências sugerem que o fator de crescimento de fibroblasto 2 (FGF2), produzido por melanomas, possui importante papel no crescimento tumoral, angiogênese e metástase. Assim, o uso de anticorpo monoclonal (mAb) que reconhece e bloqueia a atividade de FGF2 é uma abordagem a ser considerada em oncologia. O propósito desse estudo foi avaliar a aplicação diagnóstica e terapêutica de um novo anticorpo anti-FGF2, 3F12E7 IgG1, em melanoma experimental B16-F10. Para isso, camundongos C57Bl/6 foram implantados subcutaneamente (ou intravenosamente, para ensaios de metástase) com células de melanoma murino B16-F10 (5x105 células/animal). Quando tumores alcançaram 3-4 mm de diâmetro (ou 24 h pós-inóculo de células B16-F10, no caso de ensaios de metástase), camundongos foram tratados com anti-FGF2 3F12E7 IgG. Animais controle receberam igual volume do veículo ou quantidade de anticorpo controle de isotipo. Grupos: animais tratados com (1) anti-FGF2 3F12E7 IgG1; (2) ligante de CEA IgG1 (controle de isotipo); e (3) veículo. O tratamento dos camundongos portadores de tumor com anti-FGF2 IgG resultou, comparado com os controles salina e de isotipo, em uma redução no número de focos metastáticos nos pulmões (ANOVA, p < 0,05), em ensaios de metástase experimental, bem como em uma menor taxa de crescimento de tumores subcutâneos (n=7/grupo). Esse resultado é acompanhado por uma redução na densidade vascular do tumor, conforme determinado por imunomarcação para CD34 ou CD31. A captação tumoral de anti-FGF2 3F12E7 IgG foi avaliada por métodos de medicina nuclear, usando esse anticorpo radiomarcado com tecnécio-99m. Estudos SPECT/CT in vivo e de biodistribuição ex vivo revelaram que 99mTc-anti-FGF2 3F12E7 IgG pode atingir eficientemente tumores subcutâneos e metastáticos de B16-F10. Assim, esses dados sugerem que anti-FGF2 3F12E7 IgG pode ser uma estratégia antitumoral promissora para melanoma, bem como uma potencial ferramenta de imagem a ser explorada, atuando como um possível traçador para rastrear tumores FGF2-positivos e mapear esse estímulo angiogênico no microambiente tumoral. Aprovado pelo comitê de ética (CAPPesq): número 0942/09 / Compelling evidence suggests that fibroblast growth factor 2 (FGF2), produced by melanomas, plays important role in tumor growth, angiogenesis and metastasis. Therefore, the use of a monoclonal antibody (mAb) that recognizes and blocks FGF2 activity is seen as an approach to be considered in oncology. The purpose of this study was to evaluate the diagnostic and therapeutic application of a new anti-FGF2 antibody, 3F12E7 IgG1, in experimental melanoma B16-F10. For this, C57Bl/6 mice were subcutaneously (or intravenously, for experimental metastasis assay) implanted with murine melanoma B16-F10 cells (5x105 cells/animal). When tumors reached 3-4 mm in diameter (or 24 h after B16-F10 cells injection, in the case of metastasis assay), mice started receiving anti-FGF2 3F12E7 IgG. Control mice received equal volume of vehicle or isotype control IgG amount. Groups: (1) anti-FGF2 3F12E7 IgG1-treated, (2) CEA-binding IgG1-treated (isotype control) and (3) vehicle-treated mice. The treatment of tumor-bearing mice with anti-FGF2 IgG, compared with saline and isotype controls, led to a reduction in the number of metastatic foci in the lungs (ANOVA test, p < 0.05), in experimental metastasis assays, as well as to a lower subcutaneous tumor growth rate (n=7 per group). This result is accompanied by a reduction in the tumor vascular density, as determined by CD34 or CD31 staining. The anti-FGF2 3F12E7 IgG tumor uptake was evaluated by nuclear medicine approaches, using this antibody radiolabeled with technetium-99m. In vivo SPECT/CT and ex vivo biodistribution studies reveled that 99mTc-anti-FGF2 IgG could efficiently achieved B16-F10 subcutaneous and metastatic tumors. Thus, these data suggest that the anti-FGF2 3F12E7 IgG may be a promising antitumor strategy for melanoma, as well as a potential imaging tool to be explored, working as a possible tracer to identify FGF2-positive tumors and map this angiogenic stimulus in the tumor microenvironment. Ethics committee (CAPPesq) approval number 0942/09

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-08-03Bitstream added on 2014-06-13T20:30:21Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_lcf_me_araca.pdf: 916072 bytes, checksum: a0dad11c3aa9513daedea50b01cd4ff9 (MD5) / O objetivo deste estudo foi avaliar o mecanismo envolvido na produção de TGF-β, FGF-2 e CCL3/MIP-1α induzida por Stem cell factor (SCF) em células da musculatura lisa de traqueia (CMLT) e as vias de transdução de sinalização ativadas. Traqueias de camundongos normais foram coletadas, fragmentadas e colocadas em garrafas contendo meio de cultura DMEM com 10% de Soro Fetal Bovino. CMLT foram estimuladas com SCF (1, 10 and 100 ng/mL) e avaliadas após 1, 6 e 24 horas. Características fenotípicas das CMLT foram analisadas por imunofluorescência para α-actina de músculo liso (α-AML), α-citoqueratina e α-proteína de ativação de fibroblastos (α-FAP). Ativação de c-kit em CMLT estimuladas por SCF foi avaliada por citometria de fluxo. A expressão de RNAm para TGF-β foi observada pela reação de polimerase em cadeia-transcriptase reversa (RT-PCR) e a produção da proteína, por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). A produção de FGF-2 foi avaliada por immunoblot e a produção de CCL3/MIP-1α por ELISA. Em outro conjunto de experimentos, CMLT foram pré-tratadas com inibidores de MAPK p42/44(PD 98059 [PD]), p38(SB 202190[SB]), e JNK (SP 600125 [SP]) por 30 minutos seguidos de estimulação com SCF (10 ng/mL) por 24 horas. Células pré-tratadas com anticorpos específicos não revelaram qualquer marcação para citoqueratina nem para α-FAP, contudo, ocorrendo a marcação para α-AML, indicando a pureza da linhagem celular primária. SCF induziu a expressão de receptores c-kit em CMLT. CMLT estimuladas por 10 ng/mL de SCF expressaram TGF-β mRNA e produziram TGF- β proteína, FGF-2 e CCL3/MIP-1α após 24 horas. O pré-tratamento com SB, PD e SP inibiu estas produções. Estas produções foram mediadas pela ativação das vias p42/44, p38, e JNK. CMLT parecem ser importantes células residentes... / The aim of this study was to evaluate the mechanism involved in SCF-induced TGF-β, FGF-2 and CCL3/MIP-1α production in tracheal smooth muscle cells (tSMC) and the activated signaling transduction pathway. Normal mouse tracheas were collected, fragmented and placed in bottles containing the culture medium DMEM with 10% Fetal Bovine Serum. tSMC primary cultures were stimulated with SCF (1, 10 and 100 ng/mL) and evaluated at 1, 6 and 24 hours. The phenotypic characteristic of tSMC in primary culture was analyzed using immunofluorescence staining for α-smooth muscle actin (α-SMA), α-cytokeratin and α-Fibroblast Activation Protein (α-FAP). c-Kit activation in SCF-stimulated tSMC was evaluated by flow cytometric. The TGF-β mRNA expression was observed by reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and protein production by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). FGF-2 production was evaluated by immunoblot and CCL3/MIP-1α production by ELISA. In other set of experiment, tSMC were pretreated p42/44 inhibitor (PD 98059 [PD]), p38 inhibitor (SB 202190[SB]), or JNK inhibitor (SP 600125 [SP]) for 30 minutes followed by stimulation with SCF (10 ng/mL) for 24 hour. Cells treated with specific antibodies, showing neither labeling for cytokeratin nor either FAP, however, labeling for α-SMA indicating purity of the primary cell line. SCF induces c-Kit expression on tSMC. SCF-stimulated tSMC express TGF-β mRNA expression and FGF-2 and CCL3/MIP-1α production at 10 ng/mL after 24 hours. SB, PD and SP pre-treatment inhibited these productions. These productions were mediated by activation pathways p42/44, p38, and JNK. tSMC seems to be important resident cells involved in the cell activation and tissue repair, since they are capable of producing growth factors and chemokines and added new... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Sandra Helena Penha de Oliveira / Banca: Lúcia Helena Faccioli / Banca: Carla Máximo Prado / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar o mecanismo envolvido na produção de TGF-β, FGF-2 e CCL3/MIP-1α induzida por Stem cell factor (SCF) em células da musculatura lisa de traqueia (CMLT) e as vias de transdução de sinalização ativadas. Traqueias de camundongos normais foram coletadas, fragmentadas e colocadas em garrafas contendo meio de cultura DMEM com 10% de Soro Fetal Bovino. CMLT foram estimuladas com SCF (1, 10 and 100 ng/mL) e avaliadas após 1, 6 e 24 horas. Características fenotípicas das CMLT foram analisadas por imunofluorescência para α-actina de músculo liso (α-AML), α-citoqueratina e α-proteína de ativação de fibroblastos (α-FAP). Ativação de c-kit em CMLT estimuladas por SCF foi avaliada por citometria de fluxo. A expressão de RNAm para TGF-β foi observada pela reação de polimerase em cadeia-transcriptase reversa (RT-PCR) e a produção da proteína, por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). A produção de FGF-2 foi avaliada por immunoblot e a produção de CCL3/MIP-1α por ELISA. Em outro conjunto de experimentos, CMLT foram pré-tratadas com inibidores de MAPK p42/44(PD 98059 [PD]), p38(SB 202190[SB]), e JNK (SP 600125 [SP]) por 30 minutos seguidos de estimulação com SCF (10 ng/mL) por 24 horas. Células pré-tratadas com anticorpos específicos não revelaram qualquer marcação para citoqueratina nem para α-FAP, contudo, ocorrendo a marcação para α-AML, indicando a pureza da linhagem celular primária. SCF induziu a expressão de receptores c-kit em CMLT. CMLT estimuladas por 10 ng/mL de SCF expressaram TGF-β mRNA e produziram TGF- β proteína, FGF-2 e CCL3/MIP-1α após 24 horas. O pré-tratamento com SB, PD e SP inibiu estas produções. Estas produções foram mediadas pela ativação das vias p42/44, p38, e JNK. CMLT parecem ser importantes células residentes... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to evaluate the mechanism involved in SCF-induced TGF-β, FGF-2 and CCL3/MIP-1α production in tracheal smooth muscle cells (tSMC) and the activated signaling transduction pathway. Normal mouse tracheas were collected, fragmented and placed in bottles containing the culture medium DMEM with 10% Fetal Bovine Serum. tSMC primary cultures were stimulated with SCF (1, 10 and 100 ng/mL) and evaluated at 1, 6 and 24 hours. The phenotypic characteristic of tSMC in primary culture was analyzed using immunofluorescence staining for α-smooth muscle actin (α-SMA), α-cytokeratin and α-Fibroblast Activation Protein (α-FAP). c-Kit activation in SCF-stimulated tSMC was evaluated by flow cytometric. The TGF-β mRNA expression was observed by reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and protein production by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). FGF-2 production was evaluated by immunoblot and CCL3/MIP-1α production by ELISA. In other set of experiment, tSMC were pretreated p42/44 inhibitor (PD 98059 [PD]), p38 inhibitor (SB 202190[SB]), or JNK inhibitor (SP 600125 [SP]) for 30 minutes followed by stimulation with SCF (10 ng/mL) for 24 hour. Cells treated with specific antibodies, showing neither labeling for cytokeratin nor either FAP, however, labeling for α-SMA indicating purity of the primary cell line. SCF induces c-Kit expression on tSMC. SCF-stimulated tSMC express TGF-β mRNA expression and FGF-2 and CCL3/MIP-1α production at 10 ng/mL after 24 hours. SB, PD and SP pre-treatment inhibited these productions. These productions were mediated by activation pathways p42/44, p38, and JNK. tSMC seems to be important resident cells involved in the cell activation and tissue repair, since they are capable of producing growth factors and chemokines and added new... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Evidências sugerem que o fator de crescimento de fibroblasto 2 (FGF2), produzido por melanomas, possui importante papel no crescimento tumoral, angiogênese e metástase. Assim, o uso de anticorpo monoclonal (mAb) que reconhece e bloqueia a atividade de FGF2 é uma abordagem a ser considerada em oncologia. O propósito desse estudo foi avaliar a aplicação diagnóstica e terapêutica de um novo anticorpo anti-FGF2, 3F12E7 IgG1, em melanoma experimental B16-F10. Para isso, camundongos C57Bl/6 foram implantados subcutaneamente (ou intravenosamente, para ensaios de metástase) com células de melanoma murino B16-F10 (5x105 células/animal). Quando tumores alcançaram 3-4 mm de diâmetro (ou 24 h pós-inóculo de células B16-F10, no caso de ensaios de metástase), camundongos foram tratados com anti-FGF2 3F12E7 IgG. Animais controle receberam igual volume do veículo ou quantidade de anticorpo controle de isotipo. Grupos: animais tratados com (1) anti-FGF2 3F12E7 IgG1; (2) ligante de CEA IgG1 (controle de isotipo); e (3) veículo. O tratamento dos camundongos portadores de tumor com anti-FGF2 IgG resultou, comparado com os controles salina e de isotipo, em uma redução no número de focos metastáticos nos pulmões (ANOVA, p < 0,05), em ensaios de metástase experimental, bem como em uma menor taxa de crescimento de tumores subcutâneos (n=7/grupo). Esse resultado é acompanhado por uma redução na densidade vascular do tumor, conforme determinado por imunomarcação para CD34 ou CD31. A captação tumoral de anti-FGF2 3F12E7 IgG foi avaliada por métodos de medicina nuclear, usando esse anticorpo radiomarcado com tecnécio-99m. Estudos SPECT/CT in vivo e de biodistribuição ex vivo revelaram que 99mTc-anti-FGF2 3F12E7 IgG pode atingir eficientemente tumores subcutâneos e metastáticos de B16-F10. Assim, esses dados sugerem que anti-FGF2 3F12E7 IgG pode ser uma estratégia antitumoral promissora para melanoma, bem como uma potencial ferramenta de imagem a ser explorada, atuando como um possível traçador para rastrear tumores FGF2-positivos e mapear esse estímulo angiogênico no microambiente tumoral. Aprovado pelo comitê de ética (CAPPesq): número 0942/09 / Compelling evidence suggests that fibroblast growth factor 2 (FGF2), produced by melanomas, plays important role in tumor growth, angiogenesis and metastasis. Therefore, the use of a monoclonal antibody (mAb) that recognizes and blocks FGF2 activity is seen as an approach to be considered in oncology. The purpose of this study was to evaluate the diagnostic and therapeutic application of a new anti-FGF2 antibody, 3F12E7 IgG1, in experimental melanoma B16-F10. For this, C57Bl/6 mice were subcutaneously (or intravenously, for experimental metastasis assay) implanted with murine melanoma B16-F10 cells (5x105 cells/animal). When tumors reached 3-4 mm in diameter (or 24 h after B16-F10 cells injection, in the case of metastasis assay), mice started receiving anti-FGF2 3F12E7 IgG. Control mice received equal volume of vehicle or isotype control IgG amount. Groups: (1) anti-FGF2 3F12E7 IgG1-treated, (2) CEA-binding IgG1-treated (isotype control) and (3) vehicle-treated mice. The treatment of tumor-bearing mice with anti-FGF2 IgG, compared with saline and isotype controls, led to a reduction in the number of metastatic foci in the lungs (ANOVA test, p < 0.05), in experimental metastasis assays, as well as to a lower subcutaneous tumor growth rate (n=7 per group). This result is accompanied by a reduction in the tumor vascular density, as determined by CD34 or CD31 staining. The anti-FGF2 3F12E7 IgG tumor uptake was evaluated by nuclear medicine approaches, using this antibody radiolabeled with technetium-99m. In vivo SPECT/CT and ex vivo biodistribution studies reveled that 99mTc-anti-FGF2 IgG could efficiently achieved B16-F10 subcutaneous and metastatic tumors. Thus, these data suggest that the anti-FGF2 3F12E7 IgG may be a promising antitumor strategy for melanoma, as well as a potential imaging tool to be explored, working as a possible tracer to identify FGF2-positive tumors and map this angiogenic stimulus in the tumor microenvironment. Ethics committee (CAPPesq) approval number 0942/09