La pourriture grise est une maladie qui affecte de nombreuses cultures dont la vigne. Elle est provoquée par un complexe de deux espèces fongiques, l’espèce majoritaire Botrytis cinerea et l’espèce minoritaire Botrytis pseudocinerea. Les deux espèces se distinguent par leur sensibilité à certains fongicides notamment au fenhexamid, inhibiteur de la 3-cétoréductase des stérols. Ce fongicide a un spectre d’action restreint aux espèces phylogénétiquement proches du genre Botrytis (Sclerotinia et Monilinia fructicola). Son utilisation a conduit à la sélection de souches résistantes parmi lesquelles on distingue trois phénotypes : le phénotype HydR1 correspond à l’espèce B. pseudocinerea naturellement résistante ; les phénotypes HydR2 et HydR3 correspondent à l’espèceB. cinerea ayant acquis la résistance suite à l’introduction du fongicide. L’objet de cette thèse est l’étude des phénotypes HydR1 et HydR2 présents à de faibles, voire très faibles fréquences dans des populations de pourriture grise.Chez B. pseudocinerea (HydR1), nous avons identifié une monooxygénase à cytochrome P450 nommée Cyp684 responsable de la résistance au fenhexamid. Le gène cyp684 montre des polymorphismes (structure et séquence nucléotidique) entre les espèces ainsi qu’une induction par le fenhexamid chez B. pseudocinerea. La comparaison de la séquence du gène cyp684 chez plusieurs espèces de Botrytis et de leurs niveaux de résistance au fenhexamid indique que les acides aminés polymorphes de la protéine Cyp684 sont responsables de la résistance au fenhexamid chez B. pseudocinerea. Le rôle connu des monooxygénase à cytochrome P450 dans la métabolisation des xénobiotiques et la synergie entre le fenhexamid et des inhibiteurs de monooxygénases à P450 suggèrent que Cyp684 soit impliqué dans la métabolisation du fenhexamid. Concernant le phénotypeHydR2 de B. cinerea, le mécanisme de résistance reste à identifier. Les souches HydR2 se distinguent par leur phénotype rose dû à un métabolite secondaire nommé bikavérine. Le génotypage réalisé sur les descendantes d’un croisement entre une souche HydR2 et une souche sensible a mis en évidence un lien physique entre le gène ou l’allèle hydR2 et le cluster bikavérine. Afin d’identifier la niche écologique et de comprendre l'épidémiologie de B. pseudocinerea, nous avons développé une méthode de qPCR espèce spécifique, nommée « B. pseudocinerea allele specific PCR » (BpASP). Cet outil permettra de détecter et de quantifier l’espèce B.pseudocinerea dans les populations de Botrytis, selon la saison, la région géographique et les plantes hôtes. / Grey mold is a fungal disease affecting many crops including grapevine. It is generated by a species complex of two fungal species, the major one, Botrytis cinerea, and the minor species, Botrytis pseudocinerea. Both species differ by their sensitivity to several fungicides, in particular to fenhexamid, a potent inhibitor of sterol 3-ketoreductase. This fungicide has a narrow spectrum of activity limited to species closely related to the genus Botrytis (e.g., Sclerotinia and Monilinia fructicola). Fenhexamid applications have led to the selection of resistant strains with three different phenotypes: the HydR1 phenotype corresponds to the naturally resistant species B. pseudocinerea; HydR2 and HydR3 phenotypes correspond to B. cinerea strains that acquired resistance after the introduction of fenhexamid. The topic of this thesis is the study of the phenotypes HydR1 andHydR2 present at low or even very low frequencies in grey mold populations. We identified a cytochrome P450 monooxygenase named Cyp684 responsible for resistance to fenhexamid in B.pseudocinerea (HydR1). The cyp684 gene differs between both species in its gene structure, nucleotide sequence (polymorphisms) and expression. The comparison of cyp684 sequences among different Botrytis species and their resistance levels to fenhexamid indicate the polymorphic amino acids of the Cyp684 protein to be responsible for fenhexamid resistance in B. pseudocinerea. The known involvement of cytochrome P450s in xenobiotic metabolisation and synergy between fenhexamid and P450-inhibitors suggest that Cyp684 could be involved in fenhexamid metabolisation. Concerning the B. cinerea HydR2 phenotype, the resistance mechanism remains to be identified. HydR2 strains have a specific purple pigmentation due to the secondary metabolite bikaverin. Genotyping of progeny derived from a cross between a HydR2 and a sensitive strain revealed aphysical link between the hydR2 gene or allele and the gene cluster involved in bikaverin biosynthesis. In order to identify the ecological niche of B. pseudocinerea and its epidemiological behavior we developed a species-specific qPCR method named “B. pseudocinerea allele specific PCR” (BpASP). This tool will allow detecting and quantifying the species B. pseudocinerea in natural Botrytis populations, collected according to season, geographic origin or plant hosts.

Les pesticides sont des molécules utilisées en grandes quantités en France et dans le monde entier pour la protection des cultures. Lorsque ces substances sont répandues une grande quantit é rejoint les sols. Dans cette thèse, le devenir de pesticides dans le sol est étudié. Pour cela, trois pesticides ont été sélectionnés : l'atrazine, la métamitrone et le fenhexamide ; et une argile de type montmorillonite a été choisie. Les simulations menées lors de cette thèse emploient le formalisme de la Théorie de la Fonctionnelle de la Densité (DFT). La première partie de cette thèse porte sur l'étude statique de l'interaction de l'atrazine avec la pyrophyllite et la montmorillonite. Dans les chapitres suivants, la Dynamique Moléculaire Car-Parrinello en DFT est utilisée. L'étude débute par les pesticides seuls, métamitrone et fenhexamide, puis leurs complexes avec un ou deux cations Na+ et Ca2+. Ensuite, l'adsorption de ces entités, en présence ou non d'eau, sur une surface de montmorillonite, est envisagée à l'aide de calculs périodiques. Dans le second chapitre de ce travail, des résultats issus d'optimisations de géométries en phase gazeuse sont présentés. La troisième partie développe les résultats obtenus pour l'adsorption de la métamitrone et du fenhexamide sur le modèle d'argile choisi. Dans le dernier chapitre, certaines des structures les plus stables de chaque pesticide adsorbé sur la surface ont été solvatées et une étude de la désorption du fenhexamide de la surface de montmorillonite a été réalisée à l'aide de la méthode Umbrella Sampling. Ce travail a permis de quantifier théoriquement la barrière d'énergie libre à franchir pour désorber le fenhexamide de la montmorillonite hydratée. / Pesticides are widely employed molecules for crop protection in France and all over the world. When these substances are spread an important quantity reaches soils. In the present thesis, pesticide fate is under study. For this purpose, three pesticides have been selected: atrazine, metamitron and fenhexamid ; and the most abundant smectite clay type, montmorillonite, has been chosen. The computational simulations conducted in this thesis use the Density Functional Theory (DFT) formalism. The first part of this thesis treats a static study of atrazine interaction with pyrophyllite and montmorillonite. In the following chapters, Car-Parrinello Molecular Dynamics through DFT is used. This study begins with isolated pesticides, metamitron and fenhexamid, then their complexes with one or two Na+ and Ca2+. Finally, the adsorption of these entities, in the presence of water or not, onto a montmorillonite surface, is considered using periodic calculations. Within the second chapter of the present work, results from geometry optimisations in gas phase are presented. The third part develops the obtained results on the adsorption of metamitron and fenhexamid over the chosen clay model. In the last chapter of this thesis, some of the most stable structures of each adsorbed pesticide onto the surface have been solvated and a study of fenhexamid desorption from the montmorillonite surface using Umbrella Sampling has been done. This work allowed to quantify theoretically the free energy barrier to overcome to desorb fenhexamid from the hydrated montmorillonite.

La lutte chimique est la principale méthode utilisée pour contrôler les maladies causées par les champignons phytopathogènes. Dans certains cas, desphénomènes de résistance envers les fongicides se développent au sein despopulations, altérant parfois l’efficacité des molécules. La compréhension du moded’action des fongicides et des mécanismes de résistance sous-jacents participe à élaboreret à adapter des stratégies de management anti résistance ; et ainsi permettre depérenniser la durée de vie des molécules. Le fenhexamid est un fongicide récent (BayerCropScience, 2000), avec un mode d’action unique. Il est le seul fongicide commercialisébloquant l’étape de C4-déméthylation de la biosynthèse de l’ergostérol. Plusieurs typesde résistance (naturelle et acquises) ont été détectées dans les vignobles européens chez lecomplexe d’espèces Botrytis spp. responsable de la pourriture grise de la vigne. Lestravaux développés durant la thèse s’inscrivent dans l’objectif de la caractérisation dumode d’action et de l’élucidation des mécanismes de résistance. Le premier axe s’estattaché à la caractérisation fonctionnelle de deux gènes impliqués dans la C-4déméthylation de la biosynthèse de l’ergostérol : le gène erg27 codant la 3-céto réductase,cible du fenhexamid, et le gène erg28 codant une protéine qui interagirait en partie avecla 3-céto réductase. Concernant la résistance au fenhexamid, il a été démontré que, pargénétique inverse, les mutations détectées dans le gène erg27 de différents types d'isolatsrésistants issus du vignoble (phénotypes de résistance HydR3- et HydR3+) conféraient larésistance. Par ailleurs, une analyse de fitness du phénotype le plus préoccupant(phénotype HydR3+) a été réalisée en conditions contrôlées sur des souches isogéniquesartificielles afin d’apporter une réponse sur la persistance possible de ces souches auvignoble. Une méthode fine de quantification moléculaire de ces mêmes isolats aégalement été mise au point pour faciliter le suivi de leur évolution et de la persistancedes populations naturelles à l’échelle des vignobles. Cette nouvelle méthode, nomméeASPPAA PCR, exploite le polymorphisme nucléotidique du gène erg27, à l’origine de larésistance. Enfin, la résistance naturelle au fenhexamid de l’espèce apparentée à Botrytiscinerea, appelée Botrytis pseudocinerea a été élucidée. La résistance au fongicide de cetteespèce a été expliquée par la combinaison de modifications de cible (mécanismeminoritaire) et d’une dégradation du fongicide par un cytochrome P450 nomméCyp68.4 (mécanisme majeur). Il s’agit de la première identification et caractérisationgénétique d’un mécanisme de résistance à un fongicide conférée par un processus dedétoxification chez un champignon phytopathogène. / Chemical control is the main method used to control diseases caused byphytopathogenic fungi. In some cases, the resistance phenomena towardfungicides occur within fungal populations, which might alter practicalefficiency of molecules. Understanding modes of action of fungicides andunderlying resistance mechanisms participate to the development and adaptationof management strategies against resistance, and thus help to sustain the life ofmolecules. Fenhexamid is a recent fungicide (Bayer CropScience, 2000), with aparticular mode of action. It is the only fungicide marketed blocking the C4-demethylation step of ergosterol biosynthesis. Several types of resistance (naturaland acquired) were detected in European vineyards in the Botrytis spp speciescomplex, causing grey mold disease. This work focused on the characterization ofthe mode of action and the elucidation of resistance mechanisms. The first aspectinvestigated the functional characterization of two genes involved in the C4-demethylation of ergosterol biosynthesis. The erg27 gene potentially encoding the3-keto reductase which is the fenhexamid target and the erg28 gene encoding aprotein that interact in part with the 3-ketoreductase. Concerning fenhexamidresistance, we shown by reverse genetics that mutations detected in the erg27 genefrom different resistant isolates from the vineyards (phenotypes HydR3- andHydR3+) confer resistance. Furthermore, a fitness analysis under controlledconditions on the most worrying resistant phenotype (HydR3+) was performed onisogenic artificial strains in order to predict the possible persistence of these strainsin vineyards. A fine molecular method to quantify these isolates was developed tofacilitate the follow-up of evolution and persistence of resistant populations in thevineyard. This new method, named ASPPAA PCR is based on the nucleotidepolymorphism of the erg27 gene, responsible for fenhexamid resistance. Finally,the natural resistance to fenhexamid of the related species to Botrytis cinerea, B.pseudocinerea, was elucidated. Fungicide resistance of this species is explained bythe combination of target site modifications (minor mechanism) and fungicidedegradation mediated by a cytochrome P450 named Cyp68.4 (major mechanism).This is the first characterization of a genetic resistance mechanism to a fungicideconferred by detoxification in a phytopathogenic fungus.