Submitted by Sandra Pereira (srpereira@ufrrj.br) on 2016-08-03T16:30:05Z No. of bitstreams: 1 2011 - Alex da Silva Santos.pdf: 1990293 bytes, checksum: b92b4e5aec031d9fcd17900f0f1ef9c8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-03T16:30:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011 - Alex da Silva Santos.pdf: 1990293 bytes, checksum: b92b4e5aec031d9fcd17900f0f1ef9c8 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior, CAPES / The production of enzymes for application at different areas of food agroindustry presents promising future perspectives, due to several intrinsic properties regarded to the performance of the enzymes as natural and biodegradable compounds, responsible for achieving specific reactions with better quality. Cellulases have been the most employed enzymes on food industry, acting sinergically on the hydrolysis of the glucosidic links ?-1,4 from the molecules of cellulose, and being used on several applications in this sector as in vegetal oils extraction, fruit maceration and juice clarification. Based on this context, the present study aimed to produce, concentrate and partially characterize an enzymatic extract by a mutant fungus strain of Aspergillus niger. Production was performed by solid-state fermentation (SSF) in aerated columns, using humidified wheat bran with (NH4)2SO4 solution on 0,1N HCl as substrate and cellobiose as inducer. Cellulolytic extract was a blend of extracts from three different assays selected on previous studies as the best conditions for the enzymes caboxymethilcellulase, ?-glucosidase and filter paper cellulose (FPase). During the characterization of the enzymatic extract, besides cellulases activity, the presence of protease and other enzymes with similar action to cellulases as xylanase and poligalacturonase was evaluated. For enzymatic extract concentration, three different strategies were performed: ultrafiltration, using a stainless steel plates system through a 20 kDa molecular weight cut-off polyethersulphone membrane and 0,014 m2 area; precipitation with ammonium sulphate under 20%, 40 %, 60% and 80% saturation level and lyophiilization. The best results were achieved by the ultrafiltration process, partially purified sample and providing enzymatic activities recovery between 75% and 99%, except for FPase. SDS-PAGE analysis presented 15 visible protein bands on cellulolytic extract with molecular weights ranging from 13.3 to 104.6 kDa. Zymography test was applied for cellulases and correlate enzymes as well as to protease, however, just for the last one the conditions were considered appropriate, identifying bands on 88, 103 and 145 kDa. The effective performance of ?-glucosidase and xylanase over xylan and cellobiose hydrolysis was confirmed by thin layer chromatography. A central rotational statistical design 22 with 4 central points was used for evaluating optimal temperature and pH for carboxymethylcellulase and ?-glucosidase. The analysis of the results obtained for both enzymes demonstrated that all variables were significative at a 95% confidence level. Based on the conditions studied it can be concluded that optimal pH and temperature ranges for efficient and combined action of carboxymethylcellulase and ?-glucosidase are 3.7 to 5.5 and 60 to 65?C, respectively. / A produ??o de enzimas para uso em diferentes ?reas da agroind?stria de alimentos mostra perspectivas futuras promissoras, devido ?s v?rias caracter?sticas inerentes ? a??o das enzimas que s?o compostos naturais, biodegrad?veis e capazes de desempenhar rea??es espec?ficas com melhor qualidade. Entre as enzimas mais utilizadas pelo setor de alimentos est?o as celulases, um complexo de enzimas que atuam de forma sin?rgica sobre a hidr?lise das liga??es glicos?dicas ?-1,4 das mol?culas de celulose, e possuem v?rias aplica??es industriais neste setor, como na extra??o de ?leos vegetais, na macera??o de frutas e na clarifica??o de sucos. Dentro deste contexto, este trabalho teve como objetivo produzir, concentrar e caracterizar parcialmente um extrato celulol?tico obtido por linhagem f?ngica mutante de Aspergillus niger. A produ??o foi realizada por fermenta??o no estado s?lido (FES) em colunas aeradas, utilizando como substrato farelo de trigo triturado umidificado com solu??o de (NH4)2SO4 em HCl 0,1N e celobiose, como indutor. O extrato celulol?tico consistiu de uma mistura de extratos obtidos em 3 ensaios fermentativos diferentes, selecionados em trabalhos anteriores como as melhores condi??es para produ??o de cada uma das enzimascarboximetilcelulase (CMCase), ?-glicosidase e celulase em papel de filtro (FPase). Durante a caracteriza??o do extrato enzim?tico, al?m da atividade das celulases, tamb?m era avaliado o teor de prote?na, a presen?a de protease e de enzimas correlatas ? a??o de celulases como xilanase e poligalacturonase. Para concentra??o do extrato enzim?tico foram realizadas tr?s diferentes estrat?gias: ultrafiltra??o em um sistema de quadro e placas em a?o inox, utilizando uma membrana de polietersulfona com massa molar de corte de 20 kDa e ?rea de 0,014m2; precipita??o com sulfato de am?nio utilizando satura??es de 20%, 40%, 50%, 60%, 80% e liofiliza??o. O processo de ultrafiltra??o foi o que obteve o melhor resultado, purificando parcialmente a amostra e proporcionando uma recupera??o das atividades enzim?ticas entre 75% e 99% para todas as atividades avaliadas, exceto FPase. A an?lise eletrofor?tica em SDS-PAGE demonstrou a presen?a de 15 bandas vis?veis de prote?nas no extrato celulol?tico com pesos moleculares que compreendem uma faixa entre 13,3 e 104,6 kD. O teste de zimografia foi realizado para as celulases e enzimas correlatas, bem como para protease, no entanto somente para esta ?ltima, as condi??es testadas foram adequadas tornando-se poss?vel identificar bandas em 88, 103 e 145 kDa. A efetiva a??o das enzimas ?-glicosidase e xilanase na hidr?lise de celobiose e xilana, respectivamente,foi comprovada em cromatografia de camada fina. Al?m disso, a temperatura e pH ?timos de atua??o de carboximetilcelulase e ?-glicosidase foram determinados utilizando o delineamento composto central rotacional 22, com 4 pontos centrais. A an?lise dos resultados de ambas as enzimas demonstrou que as vari?veis eram significativas, a um n?vel de confian?a de 95%. Com base nas condi??es estudadas, concluiu-se que as faixas de pH e temperatura ?timos para a atua??o eficiente e conjunta de CMCase e ?-glicosidase est?o entre 3,7 a 5,5 e 60 a 65 ?C, respectivamente.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SHARLINEFMS.pdf: 1463401 bytes, checksum: ffe101fa6bbf11d2b6fe49f4d837a15c (MD5) Previous issue date: 2007-12-20 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Pectinolytic enzymes, or simply pectinases, are complex enzymes that degrade pectic polymers. They have many uses, such as fruit juice extraction and purification, textile fiber treatment and vegetal oil extraction. The aim of this work was to study the kinetics of pectinases production by solid-state fermentation, using dry cashew apple residue as substrate and the microorganism Aspergillus niger CCT 0916. The influence of the initial medium moisture and medium supplementation with a source of nitrogen and phosphorus was evaluated using the factorial experimental planning and response surface methodology. Ammonia sulphate and potassium phosphate were used as nitrogen and phosphorus source, respectively. The variables time of contact (T) and ratio volume solvent/fermented medium (RZ), in systems with and without agitation, were evaluated in order to study the best extraction condition of the produced enzyme. Washed and unwashed cashew apple residues were tested as the growth medium. The unwashed residue was obtained by drying the residue after the extraction of the juice, while the washed residue was obtained by water washing 5 times using the proportion of 1 kg pulp/2 liters of water. Samples were taken every 12 hours for moisture content, pH, protein, reducing sugars, polygalacturonase activity (PG) and viscosity reduction. The physical-chemical composition of the residues had different sugar and pectin levels. For the unwashed residue, the peak activity was reached with 40% of initial moisture content, 1% of nitrogen supplementation without phosphorus addition after 30 hours of process. These conditions led to 16 U/g of PG activity and 82% of viscosity reduction. The calculated models reached similar values to the experimental ones in the same process conditions: 15.55 U/g of PG and 79.57% of viscosity eduction. Similarly, the greatest enzyme production for washed residue was reached with 40% initial moisture content, 1% nitrogen supplementation without phosphorus addition after 22 hours of cultivation. In this condition it was obtained polygalacturonase activity of 9.84 U/g and viscosity reduction of 81.36%. These values are close to experimental values that were of 10.1 U/g and 81%, respectively. The conditions that led to the best PG activity results was the agitated one and the best extraction condition was obtained with 100 minutes of solvent/medium contact and RZ of 5 (mL/g) / As enzimas pectinol?ticas ou pectinases formam um grupo heterog?neo de enzimas que hidrolisam as subst?ncias p?cticas, s?o usadas na extra??o de suco de fruta e sua clarifica??o, tratamento de fibra t?xtil e extra??o de ?leo vegetal. O objetivo deste trabalho foi o estudo da produ??o de pectinases (cin?tica fermentativa) atrav?s da fermenta??o em estado s?lido, usando como substrato o ped?nculo de caju seco e como agente da fermenta??o o microrganismo Aspergillus niger CCT 0916. Utilizando a metodologia do planejamento experimental fatorial e an?lise de superf?cie de resposta estudou-se a influ?ncia da umidade inicial do meio, suplementa??o do meio com fonte de nitrog?nio e fonte de f?sforo. Como fonte de nitrog?nio foi utilizado o sulfato de am?nia e como fonte de f?sforo o fosfato de pot?ssio monob?sico. Estudou-se, tamb?m, a melhor condi??o de extra??o da enzima produzida do meio de fermenta??o. Neste caso, foram estudadas as vari?veis: raz?o volume de solvente/gramas de meio fermentado e tempo de contato entre as fases, utilizando-se dois sistemas de extra??o com e sem agita??o. Como meio de cultivo foram utilizados dois res?duos do ped?nculo de caju: res?duo sem lavar e res?duo lavado. Estes res?duos diferem devido ao tratamento dado antes da secagem. O sem lavar foi obtido secando o res?duo ap?s a extra??o do suco, enquanto que o lavado, foi obtido lavando-se com ?gua, cinco vezes, ap?s a extra??o do suco, na propor??o 1 kg de baga?o para 2 litros de ?gua. A caracteriza??o f?sico-qu?mica dos res?duos mostrou composi??es diferentes, principalmente em rela??o aos teores de a??cares redutores e pectina. Durante o cultivo foram analisados, em intervalos de aproximadamente 12 horas, umidade do meio, pH, teor de prote?na, a??cares redutores, atividade da poligalacturonase (PG) e o percentual de redu??o de viscosidade. Para o res?duo sem lavar o pico de atividade foi com 40% de umidade e 1% de nitrog?nio, sem adi??o de f?sforo, com 30 horas de cultivo sendo 16 U/g de atividade de PG e 82% de redu??o de viscosidade. As equa??es emp?ricas obtidas fornecem valores bem pr?ximos aos experimentais nas mesmas condi??es de processo, 15,55 U/g de PG e 79,57% de redu??o de viscosidade para o res?duo sem lavar. Assim como para o res?duo sem lavar, para o res?duo lavado os picos de produ??o da enzima ocorreram para as mesmas condi??es de processo: umidade de 40%, nitrog?nio de 1%, sem adi??o de f?sforo, com 22 horas de cultivo. Nesta condi??o, obteve-se atividade da poligalacturonase de 9,84 U/g e percentual de redu??o de viscosidade de 81,36%. Estes valores est?o bem pr?ximos aos valores experimentais que foram de 10,1 U/g de PG e 81%, respectivamente. Na extra??o da PG o sistema que apresentou os melhores resultados de atividade foi o operado com agita??o e a melhor condi??o de extra??o foi com o tempo de contato solvente com o meio de fermenta??o de 100 minutos e a raz?o volume de solvente com o meio fermentado 5 (mL/g)