Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5322.pdf: 3668179 bytes, checksum: e3612c159bebd3f0a5be1640868316ae (MD5) Previous issue date: 2013-03-21 / Financiadora de Estudos e Projetos / The conversion of the hemicellulosic fraction in ethanol is a factor that impacts on the economic viability of the second generation ethanol production process from sugar cane bagasse. Hemicellulose from bagasse is a heteropolymer constituted by pentoses and glucose, being xylose the predominant sugar (~ 21 %). Among the available technological alternatives for ethanol production from xylose, SIF process (Simultaneous Isomerization and Fermentation), consisting of xylose conversion to xylulose by glucose isomerase (GI) enzyme and xylulose fermentation by the yeast S. cerevisiae, is considered a promising alternative. The main objectives of the present work were: i) evaluate the performance of different S. cerevisiae strains towards xylulose intake and ethanol productivity; ii) assess the influence of cultivation conditions (temperature, oxygen availability and initial xylose concentration) upon ethanol and xylitol production by the selected strains; iii) define the operation conditions for the continuous SIF process, using a system of fixed bed reactors associated in series. Preliminary experiments were conducted in 50 mL flasks, containing 4 g of pellets with a load of 20 % of immobilized GI, co-immobilized with yeast (load of 10 %) in alginate gel. For the screening of yeasts showing better performance on ethanol production from xylose, two commercial baker´s yeast strains (Itaiquara® e Fleischmann®), three industrial strains (BG-1, CAT-1 e PE-2) and one lab strain (CEN.PK113-7D) were evaluated. These experiments were performed at 35 oC, using a medium composed by xylose (60 g/L), urea (5 g/L), CaCl2 (1.9g/L) and several salts, at initial pH of 5.6. Additional SIF studies were carried out with the selected yeasts Itaiquara®, BG-1 or CEN.PK113-7D under different temperature conditions (40 oC), aeration (15 mL flasks) and initial xylose concentration (130 g/L) for comparison with the results obtained at the standard conditions. For SIF cultures, samples were withdrawal and the concentrations of reducing sugars were determined by DNS method while xylose, xylulose, ethanol and by-products (xylitol, glycerol etc) concentrations were assessed by liquid chromatography. Cell viability was also measured at the beginning and end of the experiment. When comparing the different yeasts, Itaiquara® strain presented the best performance, reaching ethanol concentrations of 22.4 g/L, with a productivity of 2.1 g/Lh. The conversion of xylose was similar for all studied industrial strains as well as among the baker s yeast and lab strains. Concerning the group of additional experiments, at 40 oC, a decrease of viability and ethanol selectivity was observed for Itaiquara®, whereas productivity and selectivity for CEN.PK113-7D. was improved. For the studies conducted under semianaerobic conditions, the yeast BG-1 showed an increase in selectivity and yield. However, the reaction time increased to app. 45 hours. On the other hand, the performance of strain Itaiquara® was not altered by the lower level of oxygen tested. In the experiment with 120 g/L of xylose, more than 40 g/L of ethanol was obtained in 24 hours of cultivation. Thus, we conclude that the SIF process proposed in the present work is a viable alternative for the production of ethanol from xylose or lignocellulosic residues. For the operation of the continuous system composed by fixed bed reactors associated in series, the recommended conditions include the Itaiquara® yeast with a temperature no higher than 35 oC, keeping the total residence time around 10 hours for a feeding supply containing 60 g/L of xylose. / A conversão da fração hemicelulósica da biomassa em etanol é um dos fatores que impactam a viabilidade econômica do processo de produção de etanol de segunda geração a partir do bagaço de cana-de-açúcar. A hemicelulose do bagaço é um heteropolímero constituído por pentoses e glicose, sendo a xilose o açúcar predominante (~ 21 %). Dentre as diversas alternativas tecnológicas para a produção de etanol a partir de xilose, o processo SIF (Simultânea Isomerização e Fermentação), consistindo na isomerização da xilose em xilulose pela enzima glicose-isomerase (GI) e na fermentação da xilulose pela levedura S. cerevisiae, é considerado uma alternativa promissora. Os principais objetivos do presente trabalho foram: i) avaliar o desempenho de diferentes cepas de S. cerevisiae em termos de assimilação de xilulose e produtividade em etanol; ii) estudar a influência das condições de cultivo (disponibilidade de oxigênio, temperatura e da concentração inicial de xilose) na produção de etanol e xilitol pelas cepas selecionadas; iii) definir as condições de operação para um processo SIF contínuo em sistema de reatores de leito fixo associados em série. Os experimentos preliminares foram conduzidos em frascos de 50 mL contendo 4 g de pelletes com carga de 20 % de glicose isomerase imobilizada, coimobilizada com levedura (carga de 10%) em gel de alginato. Para a seleção da levedura com melhor desempenho na produção de etanol a partir de xilose, foram avaliadas duas linhagens de levedura de panificação comercial (Itaiquara® e Fleischmann®), três cepas industriais (BG-1, CAT-1 e PE-2) e uma utilizada em laboratório (CEN.PK113-7D). Esses experimentos SIF foram conduzidos a 35ºC utilizando meio composto por xilose (60 g/L), ureia (5 g/L), CaCl2 (1,9 g/L) e sais diversos, em pH inicial 5,6. Experimentos SIF complementares foram realizados com as leveduras selecionadas Itaiquara®, BG-1 ou CEN.PK113-7D em diferentes condições de temperatura (40oC), aeração (frascos de 15 mL) e concentração inicial de xilose (130 g/L) para comparação com os resultados obtidos nas condições padrão. Em todos os experimentos SIF, amostras foram retiradas para determinação da concentração de açúcares redutores (método DNS) e de xilose, xilulose, etanol e subprodutos (xilitol, glicerol etc.) por cromatografia em fase líquida. Foi também acompanhada a viabilidade celular ao longo do cultivo. Na comparação entre as diferentes leveduras, destacou-se especialmente a levedura Itaiquara®, alcançando concentrações de etanol de 22,4 g/L, com produtividade em etanol de 2,1 g/Lh. A conversão de xilose foi semelhante entre as leveduras industriais e entre as leveduras de panificação e a de laboratório. Quanto ao conjunto de experimentos complementares, na temperatura de 40ºC houve diminuição de viabilidade e seletividade em etanol para a Itaiquara® e melhora na produtividade e seletividade para a CEN.PK113-7D. Nos experimentos realizados em condições semianaeróbias, a levedura BG-1 apresentou aumento de seletividade e rendimento em etanol, porém para um tempo de reação de 45 horas, aproximadamente. Já a levedura Itaiquara® não teve seu desempenho influenciado pela menor disponibilidade de oxigênio. No experimento realizado com 130 g/L de xilose, alcançou-se mais de 40 g/L de etanol em 24 horas de cultivo. Conclui-se, assim, que o processo SIF de xilose, proposto no presente trabalho, é uma alternativa viável para a produção de etanol a partir de xilose ou de resíduos lignocelulósicos. Para a operação em sistema contínuo composto por reatores de leito fixo associados em série recomenda-se a utilização de levedura Itaiquara® e de temperatura de, no máximo, 35ºC, mantendo-se o tempo de residência total em torno de 10 horas para uma alimentação contendo 60 g/L de xilose.

Submitted by Bruna Rodrigues (bruna92rodrigues@yahoo.com.br) on 2017-10-16T11:32:32Z No. of bitstreams: 1 TeseTSSM.pdf: 23662587 bytes, checksum: 4ef26b2b65e46560d905cc700258cd0d (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (producaointelectual.bco@ufscar.br) on 2017-10-31T16:29:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseTSSM.pdf: 23662587 bytes, checksum: 4ef26b2b65e46560d905cc700258cd0d (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (producaointelectual.bco@ufscar.br) on 2017-10-31T16:29:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseTSSM.pdf: 23662587 bytes, checksum: 4ef26b2b65e46560d905cc700258cd0d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-31T16:41:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseTSSM.pdf: 23662587 bytes, checksum: 4ef26b2b65e46560d905cc700258cd0d (MD5) Previous issue date: 2017-03-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / In ethanol production process from hemicellulosic fraction, the use of xylooligomers (XOS) as substrate reduce the contamination risk, favoring its application at industrial scale. Thus, a biocatalyst, containing xylanases, xylose isomerase (XI) and yeast co-immobilized in calcium alginate gel, was developed and XOS simultaneous hydrolysis, isomerization and fermentation (SHIF) process was studied. Firstly, xylanases from Multifect CX XL A03139 (XAS-5), a commercial enzyme preparation, and the recombinant xylanase from Bacillus subtilis (XynA) were selected to compose biocatalyst beads. XAS-5 presented better conversion (78.7%) and higher xylose production in the hydrolysis of beechwood xylan, while XynA showed exclusive endoxylanase activity. The immobilization and stabilization of XynA were performed in chitosan-glutaraldehyde, chitosan-glyoxyl and agarose-glyoxyl. Although the enzyme was efficiently immobilized on all supports, the agarose-glyoxyl-XynA derivative was notable for exhibiting remarkable stabilization under tested conditions (8600 times). Studies of SHIF process were carried out with birchwood xylan, leading to ethanol production (0.160 g/g and 0.092 g/L.h) and xylose accumulation, which indicated XI activity decrease. Further experiments were then performed to to identify possible inhibitors of XI (pH, Ca2+, Mg2+ and xylooligosaccharides). Ca2+ was identified as an inhibitor, while Mg2+ acts as an activator of the enzyme, and both actions are potentiated at acidic pHs. XI is also inhibited by XOS, with a decrease of 31.6% in XI activity in the presence of 7.0 g/L of xylobiose. For this reason, it was decided to evaluate SIF process with a recombinant yeast, capable of expressing XI. In batch runs, GSE16-T18 (T18) yeast encapsulated in alginate gel was capable to ferment xylose efficiently, consuming 40 g/L of xylose in 4 h and producing 14.4 g/L of ethanol, with yield of 0.422 g/g and productivity of 3.61 g/L.h. Calcium alginate gel encapsulation also contributed to protect yeast from the action of inhibitors, such as acetic acid. The encapsulated T18 was able to perform 10 consecutive cycles in repeated batch (yeast extract-peptone medium with 40 g/L of xylose), keeping the same productivity and high yields. It also fermented efficiently sugarcane bagasse hydrolysate, containing 60 g/L of fermentable sugars and high grade of inhibitors. The modified yeast to be more tolerant to acetic acid, GSE16-T18 HAA1, was also studied, exhibiting superior performance in comparison to T18 for hydrolysate fermentations. Continuous experiments were conducted in a fixed bed reactor using the T18-HAA1 yeast immobilized, with different xylose concentrations (40, 60, 80 and 120 g/L) in the feed medium. The reactor was operated up to 15 days, without bacterial contamination, with yield of 0.45 g/g, productivity of 4.8 g/L.h and selectivity of 31 gethanol/gxylitol (60 g/L of xylose in the feed). For the concentrations higher than 60 g/L, the conversion decreased after 4 days of continuous operation, indicating loss of cell viability due to hazardous effect of ethanol when present at 30 g/L or more, as well as limitation of oxygen and nutrients in the system. / No processo de produção de etanol a partir da fração hemicelulósica, a utilização de xilooligômeros como substrato reduz o risco de contaminação, favorecendo o emprego da tecnologia em escala industrial. Para isso, um biocatalisador contendo xilanases, xilose isomerase (XI) e levedura co-imobilizadas em gel de alginato de cálcio foi desenvolvido e o processo de hidrólise, isomerização e fermentação simultâneos (SHIF) de xilooligômeros foi estudado. Primeiramente, as xilanases presentes no produto Multifect CX XL A03139 (XAS- 5) e a xilanase recombinante de Bacillus subtilis (XynA) foram selecionadas para compor os beads do biocatalisador. XAS-5 apresentou melhor conversão (78,7%) e maior produção de xilose na hidrólise da xilana de faia, enquanto XynA apresentou exclusiva atividade de endoxilanase. Realizou-se a imobilização e estabilização da XynA em quitosanaglutaraldeído, quitosana-glioxil e agarose-glioxil. Apesar da enzima ser eficientemente imobilizada nos três suportes, o derivado agarose-glioxil-XynA se destacou por apresentar uma estabilização notável nas condições testadas (8600 vezes). Estudos do processo SHIF foram realizados com xilana de bétula, observando-se produção de etanol (0,160 g/g e 0,092 g/L.h) e acúmulo de xilose, indicando redução da atividade da XI. Realizou-se então, um estudo para identificar possíveis inibidores da XI (pH, Ca2+, Mg2+ e XOS), constatando-se que Ca2+ é um inibidor enquanto Mg2+ é um ativador da enzima, sendo suas ações potencializadas em pHs ácidos. Comprovou-se também que XI é inibida por XOS, observando-se queda da atividade de XI (31,6%) na presença de 7,0 g/L de xilobiose. Desta forma, tornou-se interessante avaliar o processo SIF com uma levedura recombinante, capaz de expressar XI. Em ensaios em batelada, a levedura GSE16-T18 (T18), encapsulada em gel de alginato, mostrou-se eficiente na fermentação de xilose, consumindo 40 g/L de xilose em 4 h e produzindo 14,4 g/L de etanol, com rendimento de 0,422 g/g e produtividade de 3,61 g/L.h. O encapsulamento em gel de alginato de cálcio também protegeu a levedura da ação de inibidores, como o ácido acético. A T18 encapsulada foi capaz de realizar 10 ciclos consecutivos em bateladas repetidas (meio contendo extrato de levedura, peptona e 40 g/L de substrato), mantendo mesma produtividade e elevado rendimento, além de fermentar eficientemente hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, contendo 60 g/L de açúcares fermentescíveis e alto teor de inibidores. A levedura GSE16-T18 HAA1, modificada geneticamente para ser mais tolerante ao ácido acético, foi também estudada, com resultados superiores a T18 nas fermentações de hidrolisado. Fermentações em modo contínuo foram realizadas em reator de leito fixo utilizando a levedura T18-HAA1 imobilizada, com diferentes concentrações de xilose na alimentação (40, 60, 80 e 120 g/L). O reator foi operado por até 15 dias, sem ocorrência de contaminação por bactérias, com rendimento 0,45 g/g, produtividade em etanol de 4,8 g/L.h e seletividade de 31 getanol/gxilitol (60 g/L de xilose na alimentação). Para as concentrações superiores a 60 g/L, a conversão diminuiu após 4 dias de operação contínua, indicando perda de viabilidade celular devido à ação do etanol quando presente em concentrações acima de 30 g/L e da limitação de oxigênio e nutrientes no sistema.