La production de protéines recombinantes, d’anticorps, de vaccins, … est de plus en plus réalisée par culture de cellules animales. Le bioréacteur classiquement utilisé en industrie pour réaliser ces cultures est le bioréacteur à cuve agitée. Ce bioréacteur présente un volume important ce qui rend difficile le développement d’un bioréacteur à usage unique dans l’optique de réduire les risques de contaminations entre deux cultures consécutives. L’intensification du procédé et le développement de bioréacteur à usage unique sont donc deux défis intéressants dans la réalisation de cultures cellulaires à l’échelle industrielle. Un bioréacteur particulièrement prometteur pour l’intensification de culture cellulaire est le bioréacteur lit-fixe. Dans cette thèse, nous étudions le bioréacteur lit-fixe à usage unique iCELLis développé par Artelis S.A.<p>Le lit-fixe du bioréacteur iCELLis est composé d’un empilement de porteurs maintenu entre deux grilles perforées. Ces porteurs sont utilisés comme support par les cellules au cours de la culture. Le bioréacteur est équipé d’un système de transfert gaz-liquide par film tombant afin d’oxygéner le milieu de culture en continu. Une pompe centrifuge plongée dans un bac d’immersion assure la circulation du milieu de culture à travers l’ensemble du bioréacteur. Les cultures se déroulent en trois phases :une phase d’adhérence des cellules aux porteurs du lit-fixe, une phase de croissance cellulaire et une phase de production.<p>Les avantages d’un bioréacteur lit-fixe sont nombreux :une concentration cellulaire élevée impliquant une productivité élevée, un petit volume de bioréacteur, une faible exposition des cellules aux contraintes de cisaillement, Les bioréacteurs lits-fixes présentent cependant certains inconvénients qui freinent leur développement à l’échelle industrielle. Le lit-fixe se présente comme un réacteur piston ce qui implique l’apparition de gradients de concentrations de cellule et d’espèces extracellulaires (nutriments et produits) le long du lit-fixe. L’intérieur du lit-fixe est également difficilement accessible au cours de la culture. Le suivi des concentrations de cellules et d’espèces dans cette zone est donc problématique.<p>Une modélisation globale du bioréacteur lit-fixe nous permet de mieux comprendre les différents phénomènes qui prennent place dans le bioréacteur. Grâce à cette modélisation, nous sommes donc capables d’identifier les phénomènes clés contrôlant le procédé et ainsi fournir des pistes de travail pour l’optimisation et la montée en échelle du bioréacteur, ceci sur base de critères rationnels.<p>Nous choisissons de développer un modèle à compartiments du bioréacteur lit-fixe. Dans ce type de modèle, le bioréacteur est représenté par un réseau de compartiments interconnectés. Nous définissons trois compartiments :un premier pour la pompe, un deuxième pour les cellules et le lit-fixe, et un troisième pour le système de transfert gaz-liquide.<p>Pour le premier compartiment, nous souhaitons caractériser divers paramètres identifiés comme pertinents pour une sélection adéquate de la pompe. Dans cette thèse, nous présentons une méthode pour caractériser ces paramètres pour une pompe de référence (celle du bioréacteur iCELLis) et pour une pompe en similitude géométrique à la pompe de référence (dans le but d’étudier la montée en échelle).<p>La pompe de référence est étudiée numériquement (grâce aux logiciels Gambit 2.4 et Fluent 6.3) et expérimentalement. Nous mettons en évidence les liens entre les paramètres de la pompe déterminés numériquement et ceux déterminés expérimentalement. Ces liens définissent notre modèle. En intégrant au modèle les résultats de la simulation numérique de l’écoulement du milieu de culture dans le bac d’immersion contenant la pompe en similitude géométrique à la pompe de référence, nous déterminons entièrement les paramètres recherchés de la seconde pompe sans avoir recours à un prototype. Ceci permet donc de tester différentes échelles avant de choisir la version finale de la seconde pompe.<p>Le deuxième compartiment du modèle caractérise les cellules et le lit-fixe. La sélection de certains paramètres opératoires dépend du métabolisme cellulaire. Nous souhaitons développer un outil de surveillance en ligne de l’évolution des concentrations de certaines espèces extracellulaires sur base de la connaissance de la concentration cellulaire dans le bioréacteur. Cet outil est développé sur base d’un modèle structuré du métabolisme des cellules animales. Dans un tel modèle, nous établissons des bilans de matière sur les espèces extra- et intracellulaires en considérant les voies métaboliques intracellulaires. Un paramètre requis pour l’emploi de cet outil est la connaissance de la concentration cellulaire au cours de la culture. Or, la surveillance de cette concentration est l’un d’un problème évoqué dans les bioréacteurs lits-fixes. Nous développons donc un modèle ségrégé de culture cellulaire en bioréacteur lit-fixe. Dans ce modèle, nous considérons l’entièreté du lit-fixe. Le modèle comprend différentes populations de cellules :les cellules en suspension dans le milieu au début de la culture et les cellules adhérentes au lit-fixe. Le modèle inclut une distribution spatiale de la concentration d’espèces extracellulaires dans le lit-fixe. Par conséquent, le modèle rapporte les gradients potentiels de concentration de cellules et d’espèces extracellulaires dans le lit-fixe.<p>Le troisième compartiment du modèle du bioréacteur caractérise le système de transfert gaz-liquide. L’oxygénation est très souvent un paramètre clé dans la conception d’un bioréacteur. Dans le bioréacteur iCELLis, le système de transfert gaz-liquide est un film liquide tombant turbulent. Dans cette thèse, nous proposons une méthode pour caractériser le transfert d’oxygène à travers ce type de film tombant. Notre méthode, basée sur une approche numérique (grâce à Gambit 2.4 et Fluent 6.3), est scindée en deux parties. Premièrement, nous calculons la forme de l’interface gaz-liquide. Une simulation de l'écoulement est réalisée avec le modèle Volume of Fluid (VOF). A partir de cette simulation, la forme de l'interface est traquée. Deuxièmement, la forme de l'interface est générée dans un nouveau domaine de calcul afin de simuler le transfert d’oxygène. Grâce à cette seconde simulation, le coefficient de transfert d’oxygène de la phase gazeuse vers le milieu de culture est déterminé. Grâce à notre méthode, nous caractérisons ce coefficient pour différentes conditions opératoires. Nous étudions notamment l’influence du débit et de la température du milieu de culture sur le coefficient de transfert d’oxygène. / Doctorat en Sciences de l'ingénieur / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Ligninolytic fungi are well known for their ability to degrade a wide range of xenobiotics contaminating the environment, including synthetic industrial dyes. In this work Pleurotus ostreatus was used for decolorization of a synthetic textile dye Remazol Brilliant Blue R (RBBR). To set up a model fungal "fixed-bed" bioreactor the fungus was immobilized on a polyurethane foam and artificially contaminated with a model bacterium Rhodococcus erythropolis. The development of bacterial contamination can be expected during a real application of fungal bio filters in wastewater treatment. The main aim of the work was to study interspecies interactions in the model bioreactors during the dye decolorization. Ligninolytic enzyme activities were followed in the bioreactor cultures as markers of fungal biodegradation ability. In contrast to the controls, no bacterial growth was observed in the P. ostreatus bioreactor culture liquid. The results showed that fungal laccase, pH of the culture liquid, and glucose consumption by the fungus had no effect on the bacterial growth. However, 4*105 - 1,3*106 CFU/ml of R. erythropolis was detected to be associated with the fungal solid support. The presence of these bacteria had no effect on the decolorization performance of the bioreactors. Dye decolorization efficiency...

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Sugarcane bagasse is an abundant lignocellulosic residue in traditional regions of sugar and ethanol production in Brazil. It is not only a potential substrate for second generation ethanol production but also have structural features to be classified as good inducer for cellulases production by microorganisms. However, the high cost of cellulases industrial production is the major bottleneck in the hydrolysis of this raw material for subsequent fermentation, which makes unfeasible in large scale the ethanol production using this process. In this context, the development of more efficient and less expensive fermentation processes for industrial cellulases production, as well as better alternatives of enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material is crucial to achieve economic feasibility in this process. For this purpose, this work aims to develop a cellulase production process using Trichoderma reesei, as well as assessing the use of produced enzymatic extract in sugarcane bagasse hydrolysis, in order to evaluate the ultrasound effects in the hydrolysis process. The optimized process of cellulases production consisted in five days of grow in pre-inoculum Petri dishes, followed by two days of grow in optimized liquid medium and four days of solid state fermentation, using sugarcane bagasse supplemented with 1% of soybean bran and 15% (v/w) of corn steep liquor as substrate, moisture of 65%, 28±1°C and 0.5 mL of inoculum per gram of substrate. This experimental condition in bench scale (5 g) resulted in a production of 1.4 FPU/g of cellulases, and the production was approximately three-fold high in a fixed-bed bioreactor with forced aeration for 70 g of substrate capacity. For ultrasound assisted enzymatic hydrolysis using an ultrasound bath, the condition that achieved higher efficiencies were 43.4±2°C and 18.5% (v/v) of enzyme concentration, resulting in a maximal hydrolysis efficiency of 229 grams of reducing sugar per kilogram of used substrate, achieving an average increase of 12% in efficiency in those experiments where the hydrolysis was assisted by ultrasound compared with those without sonication. Regarding the saccharification using the ultrasonic probe, results using the indirect sonication during process were, on average, 158% higher than those using the direct sonication. Thus, it can be concluded that indirect sonication is more suitable to be used as an auxiliary in the hydrolysis, since the direct sonication can cause denaturation of the enzyme, reducing the process efficiency. / O bagaço de cana-de-açúcar (BC) é um resíduo lignocelulósico abundante em regiões sucroalcooleiras no Brasil e é um potencial substrato para produção de etanol de segunda geração, além de possuir características estruturais que o classificam como bom indutor para produção de celulases por microrganismos. O alto custo da produção industrial de celulases, no entanto, é um grande empecilho na hidrólise desse tipo de material para posterior fermentação, o que inviabiliza a utilização desse processo na produção de etanol em larga escala. Nesse contexto, o desenvolvimento de processos de fermentação mais eficientes e de menor custo para a produção de celulases em escala industrial, bem como alternativas mais eficazes de hidrólise enzimática desse material são necessários a fim de viabilizar economicamente o processo. Para essa finalidade, esse trabalho tem como proposta o desenvolvimento de um processo para produção de celulases utilizando uma cepa do fungo filamentoso Trichoderma reesei, bem como a utilização do extrato enzimático produzido na hidrólise enzimática de bagaço a fim de avaliar os efeitos do ultrassom no processo. O processo otimizado de produção das celulases consistiu em cinco dias de crescimento do pré-inóculo em placas de Petri, seguido de dois dias de crescimento em meio líquido otimizado, e quatro dias de FES de BC suplementado com 1% de farelo de soja (FS) e 15% de água de maceração de milho (AMM), 65% de umidade, 28±1°C e densidade de 0,5 mililitros de inóculo por grama de substrato. Essa condição experimental em escala de bancada (5 g) resultou em uma produção de 1,4 FPU/g, valor esse que aumentou aproximadamente três vezes com o aumento de escala de produção em um biorreator de leito fixo com aeração forçada com capacidade para 70 g de substrato. Para hidrólise enzimática assistida por banho de ultrassom, a condição que atingiu melhores eficiências foi de 43,4±2°C e 18,5% (v/v) de concentração de enzima, atingindo um máximo de 229 gramas de açúcares redutores por quilograma de substrato utilizado, e foi observado um aumento médio de 12% na eficiência de hidrólise naqueles experimentos em que a hidrólise foi assistida por ultrassom. Já nas sacarificações utilizando a sonda ultrassônica, os resultados utilizando sonicação indireta durante a sacarificação foram, em média, 158% maiores que aqueles utilizando sonicação direta. Dessa forma, conclui-se que a utilização de sonicação indireta é mais indicada como auxiliar nas hidrólises, uma vez que a sonicação direta pode causar desnaturação da enzima e diminuir a eficiência do processo.