The principal aim of this study was to discover, through virtual screening, new nonimmunosuppressive inhibitors for the human immunophilin FKBP12, a target of the immunosuppressant drugs rapamycin and FK506. The enzyme acts as peptidyl-prolyl isomerase catalysing protein folding in the cell. Structurally similar isomerase domains are important for molecular recognition in multi-domain chaperone proteins. FKBP inhibitors have been shown to have protective effects against nerve damage and are therefore interesting targets for the treatment of neurodegenerative diseases. Virtual screening has been used to discover novel inhibitors for protein drug targets. Recent advances in computational power and the availability of large virtual libraries, such as the EDULISS database at Edinburgh University, have enhanced the appeal of this approach. X-ray structures of known protein-ligand complexes were examined to obtain an understanding of the key non-covalent interactions in the FKBP12 binding pocket. Virtual screening hits were selected using macromolecular docking and programs that employed a ligand-based approach. The bulk of the virtual screening in this study used Edinburgh University’s in-house program LIDAEUS. In the course of this study nearly three hundred compounds were screened in the laboratory using biophysical and biochemical binding assays. Thirty four compounds were found to have an affinity for FKBP12 of less than one hundred micromolar. To test virtual hits, it was necessary to select the most appropriate medium-throughput biophysical assay. The aim was to employ methods with sufficient sensitivity to detect compounds with affinity in the order of one hundred micromolar, coupled with the capacity to screen hundreds of compounds in a week. This study used a wide variety of biophysical techniques, these including: electrospray ionisation mass spectrometry, surface plasmon resonance and isothermal titration calorimetry. There was a particular emphasis on the quality of data from electrospray ionisation mass spectrometry. A correlation was found between the cone voltages that gave 50 % dissociation of the complex with the enthalpic contribution to the free energy of binding. From the careful examination of the differences in charge-state distributions between a pure protein and a protein-ligand mixture, it was possible to determine if a protein-ligand complex had been present in solution prior to dissociation during the electrospray process. This observation provides the basis for an assay that could be of general utility in detecting very weak inhibitors.

Trypanosoma brucei est un parasite africain unicellulaire, responsable chez l’homme de la maladie du sommeil et chez les bovins de la Nagana. Il passe par différents stades lors de son cycle de vie, les deux principaux étant la forme sanguicole qui prolifère dans le sang des mammifères infectés, et la forme procyclique qui colonise le tube digestif du vecteur, la mouche glossine. Les trypanosomes sont extracellulaires, ils possèdent un flagelle qui leur permet de se mouvoir dans les différents milieux qu’ils infestent. La structure de celui-ci contient des éléments conservés au cours de l’évolution. Il constitue donc un excellent modèle de base pour en étudier l’architecture. D’autre part, le flagelle du parasite contient des structures propres à certains kinétoplastides, offrant ainsi une cible thérapeutique aux traitements anti-trypanosomiaux. Le flagelle est véritablement un organite plurifonctionnel nécessaire à la survie du parasite au sein des divers environnements qu’il rencontre lors de son cycle de développement. Outre son rôle moteur, il permet à la cellule d’échapper au système immunitaire de son hôte mammifère et de s’attacher à l’épithélium des glandes salivaires de l’insecte. Il est également requis pour le bon positionnement des organites, la morphogenèse et la division cellulaire. Enfin, il serait impliqué dans l’activité sensorielle du trypanosome. A ce jour, on ne connait quasiment rien des potentielles voies de « sensing ». Elles doivent pourtant exister, permettant l’appréhension de l’environnement, l’interaction avec les hôtes et la réception de signaux induisant la différenciation. Cet intérêt pour les voies de signalisation du parasite a abouti à l’étude des composantes de la voie TOR. TOR-Target of Rapamycin est un contrôleur central de la croissance cellulaire qu’il régule en fonction de différents stimuli externes. Il a été démontré depuis que chez T.brucei aussi, TOR régulerait la croissance temporelle et spatiale de la cellule. La kinase TOR est inhibée par sa liaison avec le complexe rapamycine-FKBP12. Nous avons identifié cette peptidyl-prolyl cis-trans isomérase chez le parasite : TbFKBP12. Elle y serait localisée au niveau du cytosquelette/flagelle. Contrairement à ce qui est observé chez la levure S.cerevisiae, l’isomérase est essentielle chez le trypanosome. Son invalidation par RNAi bloque la cytocinèse des parasites sanguicoles et provoque l’apparition d’axes de clivage internes à la cellule. Chez les formes procycliques par contre, la disparition de la protéine entraîne un défaut sévère de motilité du flagelle qui se traduit par une immobilisation partielle du parasite. TbFKBP12 est donc impliquée dans l’homéostasie du flagelle chez le trypanosome africain, organite nécessaire à la motilité et à la division cellulaire.

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Trypanosoma brucei est un parasite africain unicellulaire, responsable chez l’homme de la maladie du sommeil et chez les bovins de la Nagana. Il passe par différents stades lors de son cycle de vie, les deux principaux étant la forme sanguicole qui prolifère dans le sang des mammifères infectés, et la forme procyclique qui colonise le tube digestif du vecteur, la mouche glossine. <p>Les trypanosomes sont extracellulaires, ils possèdent un flagelle qui leur permet de se mouvoir dans les différents milieux qu’ils infestent. La structure de celui-ci contient des éléments conservés au cours de l’évolution. Il constitue donc un excellent modèle de base pour en étudier l’architecture. D’autre part, le flagelle du parasite contient des structures propres à certains kinétoplastides, offrant ainsi une cible thérapeutique aux traitements anti-trypanosomiaux.<p>Le flagelle est véritablement un organite plurifonctionnel nécessaire à la survie du parasite au sein des divers environnements qu’il rencontre lors de son cycle de développement. Outre son rôle moteur, il permet à la cellule d’échapper au système immunitaire de son hôte mammifère et de s’attacher à l’épithélium des glandes salivaires de l’insecte. Il est également requis pour le bon positionnement des organites, la morphogenèse et la division cellulaire. Enfin, il serait impliqué dans l’activité sensorielle du trypanosome. A ce jour, on ne connait quasiment rien des potentielles voies de « sensing ». Elles doivent pourtant exister, permettant l’appréhension de l’environnement, l’interaction avec les hôtes et la réception de signaux induisant la différenciation.<p><p>Cet intérêt pour les voies de signalisation du parasite a abouti à l’étude des composantes de la voie TOR. TOR-Target of Rapamycin est un contrôleur central de la croissance cellulaire qu’il régule en fonction de différents stimuli externes. Il a été démontré depuis que chez T.brucei aussi, TOR régulerait la croissance temporelle et spatiale de la cellule.<p>La kinase TOR est inhibée par sa liaison avec le complexe rapamycine-FKBP12. Nous avons identifié cette peptidyl-prolyl cis-trans isomérase chez le parasite :TbFKBP12. Elle y serait localisée au niveau du cytosquelette/flagelle. Contrairement à ce qui est observé chez la levure S.cerevisiae, l’isomérase est essentielle chez le trypanosome. Son invalidation par RNAi bloque la cytocinèse des parasites sanguicoles et provoque l’apparition d’axes de clivage internes à la cellule. Chez les formes procycliques par contre, la disparition de la protéine entraîne un défaut sévère de motilité du flagelle qui se traduit par une immobilisation partielle du parasite. <p>TbFKBP12 est donc impliquée dans l’homéostasie du flagelle chez le trypanosome africain, organite nécessaire à la motilité et à la division cellulaire. <p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(工学) / 甲第20764号 / 工博第4416号 / 新制||工||1686(附属図書館) / 京都大学大学院工学研究科合成・生物化学専攻 / (主査)教授 浜地 格, 教授 跡見 晴幸, 教授 秋吉 一成 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy (Engineering) / Kyoto University / DFAM

FKBP12 est une protéine ubiquitaire, principalement cytosolique, qui est au carrefour de plusieurs voies signalétiques. Son abondance naturelle dans les tissus nerveux peut être reliée à son implication dans les maladies neurodégénératives telles que les maladies d'Alzheimer et de Parkinson ainsi que dans les neuropathies périphériques et diabétiques ou dans des blessures des cordons spinaux. De nombreuses études ont montré que des molécules exogènes (ligands) venant se fixer sur cette protéine permettent la régénération d'un grand nombre de connexions neuronales endommagées. Une difficulté provient cependant du fait que, pour un ligand donné, il n'existe aucune relation claire entre sa structure et sa capacité de liaison à FKBP12. Notre étude vise ainsi à rationaliser la relation entre la structure d'un ligand et son affinité pour cette protéine. Deux complexes modèles, formés entre FKBP12 et chacun des deux ligands 8 et 308, ont été utilisés. Ces deux ligands de haute affinité ont des structures différentes. Notre travail s'est appuyé sur des simulations de dynamique moléculaire pour caractériser l'état intermédiaire qui est formé transitoirement lors du processus de complexation entre la protéine et son ligand. Dans cet état particulier, l'identification des interactions naissantes entre les partenaires a permis (i) de comprendre l'implication des différentes parties du ligand dans le mécanisme de reconnaissance avec FKBP12 et (ii) de rationaliser les affinités de certains ligands apparentés. / FKBP12 is an ubiquitous, mostly cytosolic, protein found at the crossroads of several signaling pathways. Its natural abundance in the nervous tissues can be related to its implication in neurodegenerative diseases like Alzheimer's and Parkinson's as well as in peripheral neuropathies and diabetes or in injuries of the spinal cords. Several studies have demonstrated that exogenous molecules (ligands) that can bind to FKBP12 allow the regeneration of many damaged neuron connections. However, there is no clear relationship between the structure of a ligand and its ability to bind to FKBP12. Our study aims at rationalizing the relationship between the structure of a ligand and its affinity to FKBP12. Two model complexes, formed between FKBP12 and each of the two high-affinity ligands 8 and 308, were studied. These two ligands are structurally different. We used molecular dynamics simulations to characterize the intermediate state that is transiently formed during the binding process between the protein and its ligand. In this state, the analysis of the nascent interactions allowed (i) to unravel the role played by the various ligand moieties in the recognition process with FKBP12 and (ii) to rationalize the affinities of related ligands.