SOUZA, Carlos Eduardo Azevedo. Análise proteômica do plasma seminal e secreções do epidídimo em ruminantes: potenciais associações com o desenvolvimento sexual, parâmetros seminais e função espermatica. 2007. 185 f. Tese (doutorado em zootecnia)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2007. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-04-07T19:20:05Z No. of bitstreams: 1 2007_tese_ceasouza.pdf: 1841396 bytes, checksum: 739bf3cd94874396bf0fb93e6971b775 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-05-25T19:34:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_tese_ceasouza.pdf: 1841396 bytes, checksum: 739bf3cd94874396bf0fb93e6971b775 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-25T19:34:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_tese_ceasouza.pdf: 1841396 bytes, checksum: 739bf3cd94874396bf0fb93e6971b775 (MD5) Previous issue date: 2007 / This research includes three different studies, evaluating distinct aspects about the composition of proteins expressed in the ruminant reproductive tract fluids. The first study describes variations in the seminal plasma protein profile of Santa Inês rams. The second identifies proteins present in the cauda epididymal fluid of Holstein bulls, and the third study details the binding pattern of BSPs and osteopontin to bovine sperm membrane. In Study 1, semen samples of sixteen rams were collected and centrifuged to obtain seminal plasma. A volume containing 150 μg of proteins was used to prepare the 2D gels, which were scanned and electronically analyzed. The quantification of the protein spots was given as PPM of the total integrated optical density. We detected 186 ± 10 spots in the gels prepared with the 48 weeks samples, similar to the amount found in the gels obtained from samples of 34 (183) and 30 (179) weeks of age. Maps representing 34 and 48 weeks showed a train of spots with 63 kDa (pI 4.2 to 5.0) that was not present in early ages. New proteins were detected in the gels as the rams matured. In the maps of 20 weeks, high molecular weight trains (158 to 160 kDa) were detected compared to other gels obtained before that age. Quantitative changes in the spots with age were more evident before puberty. We also described a relationship between the intensity of some spots in the 48-week maps and semen scores. We conclude that protein secretion in the seminal plasma of hairy rams is synchronized with a series of complex changes during the sexual development of the males. The objective of Study 2 was to describe the binding pattern of OPN and BSP proteins to the membrane of ejaculated bovine sperm and after in vitro exposure of these cells to bovine oviductal fluid. Semen samples of five Holstein bulls were obtained and subjected to the following treatments: 1. Ejaculated sperm; 2. Ejaculated sperm incubated with isthmus oviductal fluid; 3. Ejaculated sperm incubated sequentially with isthmus and ampullary oviductal fluid. From each of these treatments, sperm samples were subjected to immunocytochemistry and confocal microscopy. Positive reaction for BSP-A1/A2 was detected in the midpiece, equatorial and post-equatorial regions and acrosome, in all treatments. The signal was higher in the midpiece compared to the rest of the cells, irrespective of the treatment. The binding pattern of BSP-30kDa was similar to that observed for BSP-A1/A2. Additionally, sperm with a reacted acrosome showed a reduction in the signal of 4.9 and 3.6 times, after exposure to isthmic and ampullary fluids, respectively. OPN binding was detected in the post-equatorial region and acrosome of ejaculated sperm, with higher intensity in the acrosome. A greater amount of capacitated sperm and capable of acrosome reaction in response to LPC was seen after exposure to isthmic (39.8% and 79%) and ampullary (20.5% and 69.3%, respectively) compared to sperm exposed to MTMS alone (12.3% and 49.3%) or heparin (23.7% and 38.9%). We conclude that sperm exposure to oviductal fluids influences interactions between seminal plasma proteins and sperm membrane, possibly modulating sperm function. In Study 3, we used a proteomic approach to identify the proteins present in cauda epididymal fluid (CEF) of Holstein bulls. CEF samples were obtained from 11 bulls and used to prepare 2D gels. The spots were cut and identified using mass spectrometry. This first analysis showed that albumin composed almost 21% of the total intensity of the spots, interfering with the identification of low abundance proteins. To improve resolution, we depleted albumin from the samples using affinity spin columns and new maps were prepared. Spots detected after depletion not seen before were also identified. We observed 114 ± 3 spots before albumin detection. We identified 55 of them, comprising 23 different proteins. Based on the optical density, the most abundant proteins in the CEF samples were albumin (21.1%), cholesterol binding proteins (6 low molecular weight isoforms; 10.5%), prostaglandin D synthase (7.6%) and gelsolin (6%), accounting for 45.2% of the proteins. Another 36 spots were also identified, corresponding to 13 different proteins. After albumin depletion, the intensity of the albumin spot in the gels was reduced to 10%, and the number of spots in the maps increased to 137 ± 4. Also, 48 spots were at least 3 times more abundant after depletion. The identity of those proteins suggest a wide range of functions, including sperm metabolism regulation, changes in membrane and sperm protection against oxidative damage during epididymal storage. / Este trabalho se compõe de três estudos distintos, avaliando diferentes enfoques da composição das proteínas expressas nos fluidos reprodutivos de ruminantes. O primeiro estudo descreve as variações no perfil protéico do plasma seminal de ovinos Santa Inês. O segundo avalia as proteínas presentes no fluido da cauda do epidídimo de touros Holandês maduros. A terceira parte mostra detalhes da distribuição topográfica e intensidade de ligação das BSPs e da osteopontina à membrana de espermatozóides bovinos. No estudo 1, amostras de sêmen de dezesseis cordeiros da raça Santa Inês foram colhidas. As amostras foram centrifugadas para obtenção do plasma seminal. Um volume contendo 150 µg de proteínas foi utilizado para a preparação de géis bidimensionais, que foram digitalizados e analisados. A quantificação das proteínas nos géis foi dada como PPM da densidade óptica total integrada de todas as proteínas, de acordo com o programa. Foram encontrados 186 ± 10 spots protéicos nos géis oriundos de amostras coletadas às 48 sem., semelhante ao encontrado às 34 (183) e 30 (179) semanas de idade. Os mapas representando 34 e 48 semanas apresentaram uma seqüência de spots de 63 kDa (pI 4,2 a 5,0) que não estava presente nas idades mais jovens. À medida que os animais amadureceram, novas proteínas foram detectadas no plasma seminal. Nos mapas de 20 semanas de idade, seqüências de elevada massa molecular (158 a 160 kDa) foram detectadas, diferentemente dos mapas obtidos em idades mais jovens. Mudanças quantitativas na secreção dos spots em função da idade foram mais evidentes durante a fase pré-púbere. Detectaram-se também relações entre a intensidade de alguns spots nos mapas protéicos de amostras obtidas às 48 sem. de idade e parâmetros espermáticos. Portanto, a secreção de proteínas no plasma seminal em cordeiros Santa Inês ocorre de forma sincronizada com uma série de alterações complexas no desenvolvimento sexual como um todo. Estas mudanças foram mais marcantes na fase de pré-puberdade, justamente quando os espermatozóides começaram a adquirir motilidade progressiva. O objetivo do estudo 2 foi avaliar a distribuição topográfica e a intensidade de ligação das proteínas BSP A1/A2, BSP-30kDa e OPN à membrana de espermatozóides ejaculados e após exposição destas células in vitro às secreções do oviduto. O padrão de ligação das proteínas BSP-A1/A2, BSP-30kDa e osteopontina foi avaliado em espermatozóides obtidos de sêmen fresco e exposto seqüencialmente aos fluidos do istmo (IODF) e da ampola (AODF) do oviduto. Foram utilizadas amostras de sêmen de cinco touros Holandês, submetidos às seguintes condições: 1. Espermatozóides ejaculados; 2. Espermatozóides ejaculados incubados com IODF; 3. Espermatozóides ejaculados + IODF incubados com AODF. De cada um desses tratamentos foram colhidas alíquotas de células espermáticas para o procedimento de imunocitoquímica e análise por microscopia confocal. Uma reação positiva para BSP-A1/A2 foi detectada na peça intermediária, regiões equatorial e pós-equatorial e acrossomo dos espermatozóides, em todos os tratamentos. A análise dos diferentes planos de várias células mostrou fluorescência significativamente mais intensa na peça intermediária, em comparação com o restante das células, independente das condições de incubação. O modelo de ligação da BSP-30kDa aos espermatozóides foi semelhante àquele observado para a BSP-A1/A2. Além disso, nos espermatozóides com acrossomo reagido, a fluorescência apresentou redução de 4,9 e 3,6 vezes após exposição aos fluidos do istmo e da ampola, respectivamente. A ligação da osteopontina foi identificada na região pós-equatorial e na extremidade do acrossomo em espermatozóides ejaculados, apresentando fluorescência mais intensa no acrossomo em comparação com o segmento pós-equatorial. A maior percentagem de células capacitadas e capazes de reação acrossômica em resposta ao LPC ocorreu após exposição das células aos fluidos do istmo (39,8% e 79%) e ampola (20,5% e 69,3%, respectivamente) em comparação aos espermatozóides expostos apenas ao MTMS (12,3% e 49,3%) e à heparina (23,7% e 38,9%). Conclui-se que a exposição dos espermatozóides aos fluidos do oviduto modifica as interações entre as BSPs, a osteopontina e a membrana espermática, sendo potencialmente um mecanismo modulatório da função espermática. No estudo 3, o objetivo foi utilizar uma abordagem proteômica para identificar detalhadamente as proteínas presentes no fluido epididimal de touros sexualmente maduros. Foram obtidas amostras de fluido da cauda do epidídimo (CEF) de 11 touros Holandês maduros, canulados nos ductos deferentes. As amostras foram utilizadas para a preparação de mapas protéicos, através de eletroforese 2D, os quais foram analisados pelo software PDQuest, sendo os spots identificados por espectrometria de massa. Esta primeira análise do CEF mostrou que cerca de 21% da intensidade de todos os spots dos géis era composta por albumina, prejudicando a identificação de proteínas menos abundantes. Para contornar esse obstáculo, a albumina foi parcialmente removida das amostras utilizando-se cromatografia de afinidade e foram preparados novos mapas bidimensionais, novamente sujeitos à análise computadorizada. Os spots detectados nesses novos géis, não identificados nos mapas anteriores foram também sujeitos a espectrometria de massa. Foram detectados 114 ± 3 spots, nas amostras antes da depleção de albumina, dos quais foram identificados 55, representando 23 proteínas. Com base na densidade óptica integrada dos spots, as proteínas mais abundantes no CEF foram albumina (21,1%), proteínas ligadoras de colesterol (6 isoformas de baixa massa molecular; 10,5%), prostaglandina D sintetase (PGDS; 7,6%), e gelsolina (6%), totalizando quase a metade (45,2%) do total de proteínas. Outros 36 spots também foram identificados, correspondendo a 13 diferentes proteínas. Após a depleção da albumina, o número de spots detectados nos mapas passou para 137 ± 4 spots. Comparação dos géis antes e após o procedimento de depleção, mostrou que a intensidade da albumina foi reduzida para 1/10 da intensidade nos géis não submetidos à depleção. Além do aumento no número de spots, 48 deles tiveram sua intensidade aumentada em 3X, pelo menos, nos géis depletados em comparação aos originais. A identidade dessas proteínas sugere que elas apresentam uma enorme gama de funções, incluindo a modulação do metabolismo espermático, participação na modificação superficial da membrana e proteção dos espermatozóides durante seu armazenamento na cauda epididimal.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Este trabalho se compÃe de trÃs estudos distintos, avaliando diferentes enfoques da composiÃÃo das proteÃnas expressas nos fluidos reprodutivos de ruminantes. O primeiro estudo descreve as variaÃÃes no perfil protÃico do plasma seminal de ovinos Santa InÃs. O segundo avalia as proteÃnas presentes no fluido da cauda do epidÃdimo de touros HolandÃs maduros. A terceira parte mostra detalhes da distribuiÃÃo topogrÃfica e intensidade de ligaÃÃo das BSPs e da osteopontina à membrana de espermatozÃides bovinos. No estudo 1, amostras de sÃmen de dezesseis cordeiros da raÃa Santa InÃs foram colhidas. As amostras foram centrifugadas para obtenÃÃo do plasma seminal. Um volume contendo 150 Âg de proteÃnas foi utilizado para a preparaÃÃo de gÃis bidimensionais, que foram digitalizados e analisados. A quantificaÃÃo das proteÃnas nos gÃis foi dada como PPM da densidade Ãptica total integrada de todas as proteÃnas, de acordo com o programa. Foram encontrados 186  10 spots protÃicos nos gÃis oriundos de amostras coletadas Ãs 48 sem., semelhante ao encontrado Ãs 34 (183) e 30 (179) semanas de idade. Os mapas representando 34 e 48 semanas apresentaram uma seqÃÃncia de spots de 63 kDa (pI 4,2 a 5,0) que nÃo estava presente nas idades mais jovens. à medida que os animais amadureceram, novas proteÃnas foram detectadas no plasma seminal. Nos mapas de 20 semanas de idade, seqÃÃncias de elevada massa molecular (158 a 160 kDa) foram detectadas, diferentemente dos mapas obtidos em idades mais jovens. MudanÃas quantitativas na secreÃÃo dos spots em funÃÃo da idade foram mais evidentes durante a fase prÃ-pÃbere. Detectaram-se tambÃm relaÃÃes entre a intensidade de alguns spots nos mapas protÃicos de amostras obtidas Ãs 48 sem. de idade e parÃmetros espermÃticos. Portanto, a secreÃÃo de proteÃnas no plasma seminal em cordeiros Santa InÃs ocorre de forma sincronizada com uma sÃrie de alteraÃÃes complexas no desenvolvimento sexual como um todo. Estas mudanÃas foram mais marcantes na fase de prÃ-puberdade, justamente quando os espermatozÃides comeÃaram a adquirir motilidade progressiva. O objetivo do estudo 2 foi avaliar a distribuiÃÃo topogrÃfica e a intensidade de ligaÃÃo das proteÃnas BSP A1/A2, BSP-30kDa e OPN à membrana de espermatozÃides ejaculados e apÃs exposiÃÃo destas cÃlulas in vitro Ãs secreÃÃes do oviduto. O padrÃo de ligaÃÃo das proteÃnas BSP-A1/A2, BSP-30kDa e osteopontina foi avaliado em espermatozÃides obtidos de sÃmen fresco e exposto seqÃencialmente aos fluidos do istmo (IODF) e da ampola (AODF) do oviduto. Foram utilizadas amostras de sÃmen de cinco touros HolandÃs, submetidos Ãs seguintes condiÃÃes: 1. EspermatozÃides ejaculados; 2. EspermatozÃides ejaculados incubados com IODF; 3. EspermatozÃides ejaculados + IODF incubados com AODF. De cada um desses tratamentos foram colhidas alÃquotas de cÃlulas espermÃticas para o procedimento de imunocitoquÃmica e anÃlise por microscopia confocal. Uma reaÃÃo positiva para BSP-A1/A2 foi detectada na peÃa intermediÃria, regiÃes equatorial e pÃs-equatorial e acrossomo dos espermatozÃides, em todos os tratamentos. A anÃlise dos diferentes planos de vÃrias cÃlulas mostrou fluorescÃncia significativamente mais intensa na peÃa intermediÃria, em comparaÃÃo com o restante das cÃlulas, independente das condiÃÃes de incubaÃÃo. O modelo de ligaÃÃo da BSP-30kDa aos espermatozÃides foi semelhante Ãquele observado para a BSP-A1/A2. AlÃm disso, nos espermatozÃides com acrossomo reagido, a fluorescÃncia apresentou reduÃÃo de 4,9 e 3,6 vezes apÃs exposiÃÃo aos fluidos do istmo e da ampola, respectivamente. A ligaÃÃo da osteopontina foi identificada na regiÃo pÃs-equatorial e na extremidade do acrossomo em espermatozÃides ejaculados, apresentando fluorescÃncia mais intensa no acrossomo em comparaÃÃo com o segmento pÃs-equatorial. A maior percentagem de cÃlulas capacitadas e capazes de reaÃÃo acrossÃmica em resposta ao LPC ocorreu apÃs exposiÃÃo das cÃlulas aos fluidos do istmo (39,8% e 79%) e ampola (20,5% e 69,3%, respectivamente) em comparaÃÃo aos espermatozÃides expostos apenas ao MTMS (12,3% e 49,3%) e à heparina (23,7% e 38,9%). Conclui-se que a exposiÃÃo dos espermatozÃides aos fluidos do oviduto modifica as interaÃÃes entre as BSPs, a osteopontina e a membrana espermÃtica, sendo potencialmente um mecanismo modulatÃrio da funÃÃo espermÃtica. No estudo 3, o objetivo foi utilizar uma abordagem proteÃmica para identificar detalhadamente as proteÃnas presentes no fluido epididimal de touros sexualmente maduros. Foram obtidas amostras de fluido da cauda do epidÃdimo (CEF) de 11 touros HolandÃs maduros, canulados nos ductos deferentes. As amostras foram utilizadas para a preparaÃÃo de mapas protÃicos, atravÃs de eletroforese 2D, os quais foram analisados pelo software PDQuest, sendo os spots identificados por espectrometria de massa. Esta primeira anÃlise do CEF mostrou que cerca de 21% da intensidade de todos os spots dos gÃis era composta por albumina, prejudicando a identificaÃÃo de proteÃnas menos abundantes. Para contornar esse obstÃculo, a albumina foi parcialmente removida das amostras utilizando-se cromatografia de afinidade e foram preparados novos mapas bidimensionais, novamente sujeitos à anÃlise computadorizada. Os spots detectados nesses novos gÃis, nÃo identificados nos mapas anteriores foram tambÃm sujeitos a espectrometria de massa. Foram detectados 114  3 spots, nas amostras antes da depleÃÃo de albumina, dos quais foram identificados 55, representando 23 proteÃnas. Com base na densidade Ãptica integrada dos spots, as proteÃnas mais abundantes no CEF foram albumina (21,1%), proteÃnas ligadoras de colesterol (6 isoformas de baixa massa molecular; 10,5%), prostaglandina D sintetase (PGDS; 7,6%), e gelsolina (6%), totalizando quase a metade (45,2%) do total de proteÃnas. Outros 36 spots tambÃm foram identificados, correspondendo a 13 diferentes proteÃnas. ApÃs a depleÃÃo da albumina, o nÃmero de spots detectados nos mapas passou para 137  4 spots. ComparaÃÃo dos gÃis antes e apÃs o procedimento de depleÃÃo, mostrou que a intensidade da albumina foi reduzida para 1/10 da intensidade nos gÃis nÃo submetidos à depleÃÃo. AlÃm do aumento no nÃmero de spots, 48 deles tiveram sua intensidade aumentada em 3X, pelo menos, nos gÃis depletados em comparaÃÃo aos originais. A identidade dessas proteÃnas sugere que elas apresentam uma enorme gama de funÃÃes, incluindo a modulaÃÃo do metabolismo espermÃtico, participaÃÃo na modificaÃÃo superficial da membrana e proteÃÃo dos espermatozÃides durante seu armazenamento na cauda epididimal / This research includes three different studies, evaluating distinct aspects about the composition of proteins expressed in the ruminant reproductive tract fluids. The first study describes variations in the seminal plasma protein profile of Santa InÃs rams. The second identifies proteins present in the cauda epididymal fluid of Holstein bulls, and the third study details the binding pattern of BSPs and osteopontin to bovine sperm membrane. In Study 1, semen samples of sixteen rams were collected and centrifuged to obtain seminal plasma. A volume containing 150 μg of proteins was used to prepare the 2D gels, which were scanned and electronically analyzed. The quantification of the protein spots was given as PPM of the total integrated optical density. We detected 186  10 spots in the gels prepared with the 48 weeks samples, similar to the amount found in the gels obtained from samples of 34 (183) and 30 (179) weeks of age. Maps representing 34 and 48 weeks showed a train of spots with 63 kDa (pI 4.2 to 5.0) that was not present in early ages. New proteins were detected in the gels as the rams matured. In the maps of 20 weeks, high molecular weight trains (158 to 160 kDa) were detected compared to other gels obtained before that age. Quantitative changes in the spots with age were more evident before puberty. We also described a relationship between the intensity of some spots in the 48-week maps and semen scores. We conclude that protein secretion in the seminal plasma of hairy rams is synchronized with a series of complex changes during the sexual development of the males. The objective of Study 2 was to describe the binding pattern of OPN and BSP proteins to the membrane of ejaculated bovine sperm and after in vitro exposure of these cells to bovine oviductal fluid. Semen samples of five Holstein bulls were obtained and subjected to the following treatments: 1. Ejaculated sperm; 2. Ejaculated sperm incubated with isthmus oviductal fluid; 3. Ejaculated sperm incubated sequentially with isthmus and ampullary oviductal fluid. From each of these treatments, sperm samples were subjected to immunocytochemistry and confocal microscopy. Positive reaction for BSP-A1/A2 was detected in the midpiece, equatorial and post-equatorial regions and acrosome, in all treatments. The signal was higher in the midpiece compared to the rest of the cells, irrespective of the treatment. The binding pattern of BSP-30kDa was similar to that observed for BSP-A1/A2. Additionally, sperm with a reacted acrosome showed a reduction in the signal of 4.9 and 3.6 times, after exposure to isthmic and ampullary fluids, respectively. OPN binding was detected in the post-equatorial region and acrosome of ejaculated sperm, with higher intensity in the acrosome. A greater amount of capacitated sperm and capable of acrosome reaction in response to LPC was seen after exposure to isthmic (39.8% and 79%) and ampullary (20.5% and 69.3%, respectively) compared to sperm exposed to MTMS alone (12.3% and 49.3%) or heparin (23.7% and 38.9%). We conclude that sperm exposure to oviductal fluids influences interactions between seminal plasma proteins and sperm membrane, possibly modulating sperm function. In Study 3, we used a proteomic approach to identify the proteins present in cauda epididymal fluid (CEF) of Holstein bulls. CEF samples were obtained from 11 bulls and used to prepare 2D gels. The spots were cut and identified using mass spectrometry. This first analysis showed that albumin composed almost 21% of the total intensity of the spots, interfering with the identification of low abundance proteins. To improve resolution, we depleted albumin from the samples using affinity spin columns and new maps were prepared. Spots detected after depletion not seen before were also identified. We observed 114  3 spots before albumin detection. We identified 55 of them, comprising 23 different proteins. Based on the optical density, the most abundant proteins in the CEF samples were albumin (21.1%), cholesterol binding proteins (6 low molecular weight isoforms; 10.5%), prostaglandin D synthase (7.6%) and gelsolin (6%), accounting for 45.2% of the proteins. Another 36 spots were also identified, corresponding to 13 different proteins. After albumin depletion, the intensity of the albumin spot in the gels was reduced to 10%, and the number of spots in the maps increased to 137  4. Also, 48 spots were at least 3 times more abundant after depletion. The identity of those proteins suggest a wide range of functions, including sperm metabolism regulation, changes in membrane and sperm protection against oxidative damage during epididymal storage