Cette thèse traite de la conception de sondes fluorogènes incorporant des bras espaceurs auto-effondrables répondant à l’activité enzymatique.Ces travaux commencent par la synthèse d’une sonde modèle à trois composantes pour détecter l’activité de la Leucine AminoPeptidase (LAP). Le cœur de cette sonde est un espaceur cyclisant efficace (t1/2 cyclisation≈7sec) qui unit un substrat enzymatique à un fluorophore précipitant avec une stabilité exemplaire (pas de dégradation sur 15h d’incubation). Appliquée sur des cellules vivantes, cette sonde produit des précipités fluorescents qui marquent durablement les cellules. L’élaboration de sondes pour d’autres enzymes a cependant soulevé l’importance d’abaisser le seuil de solubilité du fluorophore.Cette thèse se penche également sur deux nouvelles conceptions de sondes à la spécificité améliorée. Alors que la première tente de réutiliser les efforts déployés pour obtenir des inhibiteurs hautement sélectifs, la seconde est basée sur deux transformations successives par deux enzymes indépendantes. Si la première solution a échoué jusqu’alors, la seconde nous a effectivement permis de différencier des populations cellulaires.Enfin, ce manuscrit détaille le développement d’une nouvelle génération d’espaceur permettant l’affinement de certaines propriétés des sondes. Focalisés sur l’amélioration de l’hydrosolubilité, les premiers exemples sont très prometteurs. Particulièrement, une sonde pour Péncilline G Amidase possède une hydrosolubilité 3500 fois supérieure à celle de son analogue commercial. Véritables multiprises chimiques, ces espaceurs devraient permettent de relever certains des grands défis de la chimie médicinale moderne. / This thesis concerns the design and evaluation of fluorogenic molecular probes that respond to enzyme activity via the help of self-immolative spacers.This work starts with the synthesis of a model three-component probe that detects the activity of Leucine AminoPeptidase (LAP). The heart of this probe is an efficient cyclizing spacer (t1/2 cyclization≈7sec) that links a specific enzyme substrate to a precipitating fluorophore with an exemplary stability (no false positive signal over 15h incubation). When incubated with live cells, this construct is processed by active LAP to yield fluorescent precipitates which lead to long-term cell-tagging. However, probes susceptible to other enzyme activity have indicated the interest in further reduction of the solubility threshold of ELF®97.This manuscript also describes two new strategies to improve the specificity of the probes. While the first tries to take advantage of the efforts made to develop highly selective inhibitors, the second is based on two consecutive transformations by two independent enzymes. The first strategy has not yet been successfully applied in our hands, but the second has led to a first prototype that allowed discriminating between different cell lines.Lastly, this thesis relates the design and synthesis of a new generation of cyclizing spacer which opens up a great number of possibilities to optimize probes’ properties. For example, a probe targeting Pencilline G Amidase and containing such a spacer possesses a hydrosolubility 3500 times higher than its commercial analogue. As true “molecular hubs”, these spacers may turn out to address the big challenges of modern imaging agent and prodrug development.

Le tricyanofurane est un groupement extrêmement électro-attracteur grâce à trois groupements nitriles conjugués. Cette caractéristique électronique nous a permis de synthétiser de nouvelles sondes fluorescentes intéressantes pour l’imagerie biologique : de petites molécules possédant un caractère dipolaire très marqué qui leur confère une fluorescence très décalée vers le rouge.Une première application de ce genre de molécules est la détection du pH intracellulaire à l’aide de groupement phénol conjugué au tricyanofurane. Grâce à une rétro-synthèse judicieuse, il a été possible de développer une famille complète possédant une très large gamme de pKa couvrant tous les pH intracellulaires possibles. En fonctionnalisant ces sondes, il est possible de cibler certains organites tels les mitochondries. En remplaçant le groupement hydroxyle par un ester pinacolboronique, ces sondes sont sensibles au peroxyde d’hydrogène. Ce type de sondes est appelé OFF/ON car la sonde est initialement non-fluorescente et la fluorescence est restaurée par l’action du peroxyde d’hydrogène. Une étude de la fluorescence à l’état solide a aussi été menée sur des molécules présentant une émission intense dans le rouge. Celles-ci ont été utilisées pour créer des sondes enzymatiques solubles en milieu physiologique qui libèrent un fluorophore insoluble après activité enzymatique. Ce fluorophore, après précipitation émet une fluorescence non présente avant activation. / Tricyanofuran is a strong electro-withdrawing group due to its three conjugated nitrile groups. This electronic characteristic was used to synthetize new fluorescent probes for biological imaging: small molecules owing a strong dipolar behavior that strongly shifts the fluorescence to the red. A first application of this kind of molecules is intracellular pH detection with a phenol moiety conjugated to the tricyanofuran. Thanks to a convenient retro-synthesis, a large family was developed displaying a large range of pKa spanning all the possible intracellular pHs. When these probes are functionalized, it is possible to target organelles such as mitochondria. When the hydroxyl group is replaced by a pinacolboronic ester, it is possible to detect hydrogen peroxide. This kind of probe is called turn-on probe because the probe is initially non-fluorescent and emission is restored by the reaction with hydrogen peroxide.Solid-state fluorescence was also studied on molecules presenting a strong and red fluorescence. This kind of molecules has then been used to design enzymatic probes soluble in physiological medium. After enzymatic cleavage, a non-soluble fluorophore is liberated and, after precipitation, leads to a strong emission.

L’objectif de cette thèse est l’élaboration de sondes organiques pour la microscopie optique non-linéaire par fluorescence excitée à deux photons (F2P) et génération de seconde harmonique (GSH). Dans une première partie, cette thèse décrit la synthèse de sondes pour l’imagerie de potentiels de membrane par GSH, comportant un ou plusieurs motifs sucres ainsi que leurs caractérisations spectroscopiques. Les premiers essais en imagerie biologique ont permis de démontrer une bonne affinité des sondes sucres pour la membrane cellulaire et un signal de GSH sur cellule neuronale a pu être observé sur une période de temps allant jusqu'à près de trois heures. La seconde approche a consisté à synthétiser et étudier des chromophores possédant des propriétés de fluorescence à l’état solide pour des applications dans la synthèse de nanoparticules fluorescentes pour l’imagerie biologique. 18 des 21 composés synthétisés ont pu être cristallisés et leur structure résolue par diffraction des rayons X et les propriétés spectroscopique en solution et à l’état solide ont été réalisées. Cette étude a permis de montrer que l’arrangement des molécules les unes par rapport aux autres avait une grande influence sur la fluorescence à l’état solide et donc que les substituants avaient une grande importance. Enfin, cette partie se termine sur les premiers essais effectués pour synthétiser des nanoparticules fluorescentes. / The objective of this thesis is the design of new organic probes for nonlinear optical microscopy by two-photon excited fluorescence (TPEF) and second harmonic generation (SHG). In the first part, we describe the synthesis of probes for voltage sensitive imaging by SHG, bearing one or more sugar units and their spectroscopic characterization. The first biological imaging tests have shown good affinity of the probes to the cell membrane and the SHG signal of neuronal cell was observed over a period of nearly three hours. The second part comprises the synthesis and the study of chromophores with solid state fluorescence properties for use in fluorescent nanoparticles for biological imaging. 18 of the 21 compounds synthesized have been crystallized, their crystal structures determined by X-ray diffraction and their spectroscopic properties studied in solution and in the solid state. These studies showed that the arrangement of molecules relative to each had a great influence on the solid state fluorescence and therefore that the substitution was very important. The chapter ends with the first tests of fluorescent nanoparticles synthesis.