付記する学位プログラム名: 充実した健康長寿社会を築く総合医療開発リーダー育成プログラム / 京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(工学) / 甲第23915号 / 工博第5002号 / 新制||工||1781(附属図書館) / 京都大学大学院工学研究科物質エネルギー化学専攻 / (主査)教授 大江 浩一, 教授 近藤 輝幸, 教授 浜地 格 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy (Engineering) / Kyoto University / DGAM

Le tricyanofurane est un groupement extrêmement électro-attracteur grâce à trois groupements nitriles conjugués. Cette caractéristique électronique nous a permis de synthétiser de nouvelles sondes fluorescentes intéressantes pour l’imagerie biologique : de petites molécules possédant un caractère dipolaire très marqué qui leur confère une fluorescence très décalée vers le rouge.Une première application de ce genre de molécules est la détection du pH intracellulaire à l’aide de groupement phénol conjugué au tricyanofurane. Grâce à une rétro-synthèse judicieuse, il a été possible de développer une famille complète possédant une très large gamme de pKa couvrant tous les pH intracellulaires possibles. En fonctionnalisant ces sondes, il est possible de cibler certains organites tels les mitochondries. En remplaçant le groupement hydroxyle par un ester pinacolboronique, ces sondes sont sensibles au peroxyde d’hydrogène. Ce type de sondes est appelé OFF/ON car la sonde est initialement non-fluorescente et la fluorescence est restaurée par l’action du peroxyde d’hydrogène. Une étude de la fluorescence à l’état solide a aussi été menée sur des molécules présentant une émission intense dans le rouge. Celles-ci ont été utilisées pour créer des sondes enzymatiques solubles en milieu physiologique qui libèrent un fluorophore insoluble après activité enzymatique. Ce fluorophore, après précipitation émet une fluorescence non présente avant activation. / Tricyanofuran is a strong electro-withdrawing group due to its three conjugated nitrile groups. This electronic characteristic was used to synthetize new fluorescent probes for biological imaging: small molecules owing a strong dipolar behavior that strongly shifts the fluorescence to the red. A first application of this kind of molecules is intracellular pH detection with a phenol moiety conjugated to the tricyanofuran. Thanks to a convenient retro-synthesis, a large family was developed displaying a large range of pKa spanning all the possible intracellular pHs. When these probes are functionalized, it is possible to target organelles such as mitochondria. When the hydroxyl group is replaced by a pinacolboronic ester, it is possible to detect hydrogen peroxide. This kind of probe is called turn-on probe because the probe is initially non-fluorescent and emission is restored by the reaction with hydrogen peroxide.Solid-state fluorescence was also studied on molecules presenting a strong and red fluorescence. This kind of molecules has then been used to design enzymatic probes soluble in physiological medium. After enzymatic cleavage, a non-soluble fluorophore is liberated and, after precipitation, leads to a strong emission.

Ce travail a consisté en la recherche et l’exploitation de nouveaux motifs structuraux sensibles à des médiateurs chimiques. Pour cela, une approche chimiométrique a été développée dans le but d’obtenir des profils de réactivité pouvant être classés dans un tableau avec un code de couleur afin de pouvoir mettre en évidence visuellement les motifs présentant un potentiel intéressant. Les motifs d’intérêt ont été intégrés dans des sondes pro-fluorescentes qui ont ensuite été testées en milieux biologiques afin d’observer leur activité. Cette méthodologie a permis de révéler un nouveau type de quencher biologiquement et chimiquement désactivable. Ainsi, même en l’absence du médiateur étudié, ce quencher incorporé dans une sonde de type FRET sera réactivé par ajout d’un agent chimique exogène afin de révéler les sondes non-activées dans la cellule. / The main topic of this work was the research and the use of new structural patterns sensitive to chemical mediators. A chimiometric approach was developped to obtain reactivity profiles which will be filed in a table with a color code in order to visually highlight the patterns having interessant potential. Then, the patterns of interest were integrated in FRET-based probes which were tested in cell experiments. This profiling led to a new type of biologically and chemically deactivatable quencher. Thus, even in the absence of the studied mediator, this quencher incorporated in a FRET probe will be activated by adding an exogenous chemical agent to reveal inactivated probes in the cell.

Cette étude a consisté au développement et à l’utilisation de fonctions chimiques clivables en milieux biologiques. Dans le domaine de la protéomique chimique, ce travail a abouti à la conception d’une sonde d’enrichissement clivable en conditions non-dénaturantes. Appliquée à l’étude de topoisomérases, cette sonde a permis l’extraction et l’analyse de complexes fonctionnels A2B2 de gyrase. Dans un second temps, un nouveau concept de quencheur chimiquement désactivable a étéintroduit. Incorporé dans une sonde pro-fluorescente de type FRET, ce type de quencheur permet notamment de visualiser la présence de sondes non-activées dans des cellules. Enfin, une méthode a été développée pour permettre l’évaluation de la labilité d’une liaison chimique en milieux biologiques natifs. Basée sur l’utilisation de sondes pro-fluorescentes, cette méthodologie a plus particulièrement été appliquée à l’étude de la bio-labilité de groupements acido-labiles. / The general main topic of this work was the use and the development of cleavable linkers in biological systems. This study led to the design of a cleavable enrichment probe in non-denaturing conditions for chemical proteomic applications. In a topoisomerase analysis, this probe allowed the extraction and analysis of a functional DNA gyrase A2B2 complex. For fluorescence imaging, a new concept of chemically deactivatable quencher was introduced. This quencher was used to revealinactivated FRET-based probe in cell experiments. Finally, a methodology based on biolability measurements of acid-sensitive molecules was developed for the evaluation of chemical bond lability in native biological environments. This work was focused on biolability measurements of acidsensitive molecules.