Le statut ganglionnaire a la valeur pronostique la plus importante chez les patientes atteintes d’un cancer du sein, le taux de survie étant corrélé au nombre de ganglions envahis. Dans le traitement des cancers du sein opérables d'une taille inférieure à 3 cm, la technique du ganglion sentinelle (GS) remplace le curage ganglionnaire de stadification. Toutefois, cette technique nécessite l’emploi simultané de radioisotopes et de colorants physiologiques présentant divers effets secondaires. Ainsi, notre stratégie a été de tester, sur modèle pré-clinique de nouveaux traceurs fluorescents, les Quantum Dots (QDs), pour la technique du GS. Une étude sur la détection in vivo du ganglion axillaire (GA) par spectrofluorimétrie fibrée après injection sous-cutanée (s.c.) de QDs émettant dans le rouge a été réalisée et leur quantification ex vivo a été effectuée par spectrofluorimétrie jusqu’à 24 h. Ce travail a montré l’accumulation rapide et sélective des QDs dans le GA chez la souris. Une étude sur la localisation in vivo de 2 ganglions régionaux par imagerie de fluorescence a été réalisée suite à l’administration s.c. de QDs émettant dans le proche infrarouge (PIR) ainsi qu’une étude de biodistribution ex vivo par spectrométrie de masse (ICP-MS). Les résultats obtenus ont montré que l’imagerie de fluorescence pouvait être utilisée après injection de QDs pour localiser et suivre leur accumulation dans les ganglions superficiels chez la souris saine. Pour se rapprocher de la clinique, le repérage in vivo du GS axillaire a été investi sur modèle tumoral murin de cancer du sein par imagerie de fluorescence après administration s.c. de QDs émettant dans le PIR. Deux techniques de détection des métastases ganglionnaires ont été utilisées puis comparées : l’histologie conventionnelle et la RT-PCR. Tous les GS axillaires ont été détectés in vivo par imagerie, sauf un GS qui était complètement envahi par les cellules tumorales et la meilleure incidence de métastases ganglionnaire a été observée avec la RT-PCR. Ainsi, les QDs pourraient être utilisés comme substitut des marqueurs actuellement employés dans la technique du GS pour les cancers du sein. / Lymph node (LN) status is the most important prognostic factor in breast cancer patients and a determinant predictor of recurrence and survival. In the treatment of operable breast cancers with a size inferior of 3 cm, the sentinel lymph node biopsy (SLNB) substitutes the axillary LN dissection. However, this technique requires the simultaneous use of a radiocolloid and a physiologic dye, which present several secondary effects. Thus, our strategy was to test in preclinical model the new fluorescent markers, Quantum Dots (QDs) for SLNB. A study on in vivo axillary LN (ALN) mapping by light induced fluorescence was performed after subcutaneous (s.c.) injection of red-emitting QDs and their ex vivo quantification was realized by spectrofluorimetry for up to 24 h. We showed a fast and selective accumulation of QDs in ALN in healthy mice. An in vivo study on localization of 2 regional LNs by fluorescence imaging was carried out after the s.c. administration of near-infrared (NIR) emitting QDs along with ex vivo biodistribution study by mass spectroscopy (ICP-MS). Obtained results shown that fluorescence imaging can be used after QDs injection to map and follow their accumulation in superficial LNs in healthy mice. To approach the human clinic in a best possible way, sentinel ALN mapping was investigated after s.c. delivery of NIR emitting QDs in murine breast cancer model by fluorescence imaging. Two techniques for LN metastasis detection were used and compared: conventional histology and RT-PCR. All sentinel ALNs were located in vivo by imaging except one ALNs which was completely invaded by cancer cells and best incidence of LN metastasis was registered by RT-PCR (60 %). Thus, QDs could be used as a substitute for the markers currently employed in SLNB in breast cancers.

Le statut ganglionnaire a la valeur pronostique la plus importante chez les patientes atteintes d'un cancer du sein, le taux de survie étant corrélé au nombre de ganglions envahis. Dans le traitement des cancers du sein opérables d'une taille inférieure à 3 cm, la technique du ganglion sentinelle (GS) remplace le curage ganglionnaire de stadification. Toutefois, cette technique nécessite l'emploi simultané de radioisotopes et de colorants physiologiques présentant divers effets secondaires. Ainsi, notre stratégie a été de tester, sur modèle pré-clinique de nouveaux traceurs fluorescents, les Quantum Dots (QDs), pour la technique du GS. Une étude sur la détection in vivo du ganglion axillaire (GA) par spectrofluorimétrie fibrée après injection sous-cutanée (s.c.) de QDs émettant dans le rouge a été réalisée et leur quantification ex vivo a été effectuée par spectrofluorimétrie jusqu'à 24 h. Ce travail a montré l'accumulation rapide et sélective des QDs dans le GA chez la souris. Une étude sur la localisation in vivo de 2 ganglions régionaux par imagerie de fluorescence a été réalisée suite à l'administration s.c. de QDs émettant dans le proche infrarouge (PIR) ainsi qu'une étude de biodistribution ex vivo par spectrométrie de masse (ICP-MS). Les résultats obtenus ont montré que l'imagerie de fluorescence pouvait être utilisée après injection de QDs pour localiser et suivre leur accumulation dans les ganglions superficiels chez la souris saine. Pour se rapprocher de la clinique, le repérage in vivo du GS axillaire a été investi sur modèle tumoral murin de cancer du sein par imagerie de fluorescence après administration s.c. de QDs émettant dans le PIR. Deux techniques de détection des métastases ganglionnaires ont été utilisées puis comparées : l'histologie conventionnelle et la RT-PCR. Tous les GS axillaires ont été détectés in vivo par imagerie, sauf un GS qui était complètement envahi par les cellules tumorales et la meilleure incidence de métastases ganglionnaire a été observée avec la RT-PCR. Ainsi, les QDs pourraient être utilisés comme substitut des marqueurs actuellement employés dans la technique du GS pour les cancers du sein.

Le diagnostic précis et précoce des tumeurs, ainsi que le développement de thérapies ciblées sont deux axes principaux de recherche en cancérologie. La génération de vecteurs spécifiques capables d'adresser un agent de contraste et/ou un médicament au niveau de la tumeur primaire et des métastases serait un atout majeur pour le diagnostic précoce et la thérapie des cancers. Dans une double optique de diagnostic et de thérapie, les nanoparticules sont apparues comme des candidats prometteurs pour la mise en place de protocoles thérapeutiques incluant le ciblage de la tumeur, son diagnostic par des techniques d'imagerie optique, ainsi que sa thérapie. Dans ce contexte notre laboratoire développe des appareils d'imagerie optique du petit animal (2D et 3D), afin de permettre le suivi de la biodistribution à long terme et de manière non invasive de sondes fluorescentes et de nanoparticules in vivo. La caractérisation du comportement de différentes nanoparticules (nanocapsules lipidiques, nanoparticules d'oxyde de Gadolinium et nanoparticules d'or) présentant différentes fonctionnalisations de surface a été réalisée in vitro et in vivo sur différents modèles tumoraux. Les résultats obtenus montrent l'influence de la fonctionnalisation et de la taille des nanoparticules sur leur biodistribution in vivo et sur leur voie d'élimination. D'autre part, la fonctionnalisation des nanoparticules par le motif RGD permet le ciblage spécifique des cellules exprimant l'intégrine alpha v beta3 in vitro et améliore l'accumulation tumorale in vivo.

La thérapie photodynamique (PDT) repose sur l'interaction entre une substance accumulée au sein d'un tissu pathologique et une excitation lumineuse à une longueur d'onde adaptée en présence d'oxygène à l'origine de la nécrose tumorale. La protoporhyrine IX (PpIX) est un photosensibilisanteur endogène présent à l'état basal dans la plupart des tissus. L'administration exogène d'un précurseur de la PpIX, comme le 5-acide amino-lévulinique (5-ALA) ou l'hexaminolévulinate (He-ALA), induit une accumulation de PpIX plus conséquente et ce de manière prépondérante dans les tissus néoplasiques, à l'origine du caractère sélectif de l'effet photodynamique. L'excitation de la PpIX à 532 nm entraîne une réponse tissulaire qui se traduit par une nécrose des tissus néoplasiques. Le principe fondamental de la thérapie photodynamique repose sur l'exploitation du caractère sélectif de l'effet photodynamique au niveau des tissus cancéreux ou précancéreux (péritoine d'une carcinose ovarienne, dysplasie cervicale). Contrairement à d'autres spécialités comme la dermatologie, la gastro-entérologie et l'urologie, la thérapie photodynamique est peu développée en gynécologie. Concernant la thérapie photodynamique des micro métastases péritonéales d'origine ovarienne, l'utilisation de l'effet photodynamique en adjuvant de la chirurgie pourrait permettre d'optimiser la prise en charge thérapeutique actuelle des cancers ovariens à un stade avancé. En effet, l'injection intrapéritonéale d'ALA ou d'He-ALA permet, associée à l'utilisation d'une longueur d'onde adéquate (lumière verte à 532 nm) et un protocole d'illumination fractionnée à 45 J.cm-2 d'améliorer l'efficacité de la thérapie photodynamique d'un modèle murin de carcinose ovarienne. En outre, l'utilisation du photobleaching comme marqueur de l'efficacité de la PDT constitue un moyen d'évaluation fiable de l'effet photodynamique puisqu'il est directement corrélé à la réponse tissulaire. Ces résultats justifient le développement de la thérapie photodynamique en pratique clinique. Enfin, l'intérêt de la thérapie photodynamique dans le traitement des dysplasies cervicales de bas grade est actuellement évalué dans une étude clinique de faisabilité.

La fluorescence d'assemblées de dérivés de Bodipy a été étudiée afin de réaliser des nanocapteurs. Les nanoobjets envisagés sont soit des nanocristaux soit des particules de polystyrène en suspension dans l'eau, i.e. des nanolatex. Dans un premier temps, des molécules encombrées ont été synthétisées afin de limiter les interactions entre fluorophores à l'état solide. Les résultats obtenus à l'état amorphe montrent que cette stratégie est prometteuse. Les propriétés de fluorescence de cryptobodipy ont aussi été étudiées. L'étude des structures cristallographiques de certaines de ces molécules a permis de mieux comprendre la fluorescence à l'état solide des Bodipy. Enfin, pour l'iodophénylbodipy, la formation d'agrégats de type J dans le solide a été démontrée et il est possible de préparer des nanoparticules fluorescentes à partir de cette molécule. La fluorescence de certains Bodipy en matrice polymère a aussi été étudiée. La fluorescence de films de PMMA contenant du PM597 a pu être modulée par transfert d'¤énergie vers une molécule photochrome. D'¤autre part, la fluorescence de nanolatex contenant du trimésitylbodipy à été éteinte de manière très efficace par du bleu de cibacron, ce qui montre l'intérêt de développer des nanocapteurs à partir de ces particules.

La fluorescence d'assemblées de dérivés de Bodipy a été étudiée afin de réaliser des nanocapteurs. <br />Les nanoobjets envisagés sont soit des nanocristaux soit des particules de polystyrène en suspension dans l'eau, i.e. des nanolatex.<br /><br />Dans un premier temps, des molécules encombrées ont été synthétisées afin de limiter les interactions entre fluorophores à l'état solide. Les résultats obtenus à l'état amorphe<br />montrent que cette stratégie est prometteuse. Les propriétés de fluorescence de cryptobodipy ont aussi été étudiées. L'étude des structures cristallographiques de certaines de ces <br />molécules a permis de mieux comprendre la fluorescence à l'état solide des Bodipy. Enfin, pour l'iodophénylbodipy, la formation d'agrégats de type J dans le solide a <br />été démontrée et il est possible de préparer des nanoparticules fluorescentes à partir de cette molécule.<br /><br />La fluorescence de certains Bodipy en matrice polymère a aussi été étudiée. La fluorescence de films de PMMA contenant du PM597 a pu être modulée par transfert d'énergie<br /> vers une molécule photochrome. D'autre part, la fluorescence de nanolatex contenant du trimésitylbodipy a été éteinte de manière très efficace par du bleu de cibacron, ce qui montre <br /> l'intérêt de développer des nanocapteurs à partir de ces particules.

L'utilisation de la microscopie confocale et biphotonique de fluorescence est de plus en plus répandue dans le domaine biomédical. En effet, l'imagerie d'intensité, de spectre et de durée de vie de fluorescence permettent de détecter, quantifier et imager les composants fluorescents intrinsèques d'un milieu biologique ainsi que les sondes extrinsèques. Dans le cadre du dépistage précoce de cancer, les modes de détection non-invasifs actuellement mis en place manquent de sensibilité pour permettre d'établir de manière fiable un diagnostic. Les médecins ont alors recours à des examens complémentaires, invasifs, comme la biopsie. Dans le cas de notre étude, différentes techniques de microscopie ont été exploitées pour mettre en place une méthode de diagnostic précoce non-invasive de cancer. Nous avons ainsi utilisé conjointement la microscopie confocale résolue spectralement et la microscopie biphotonique pour les images de durée de vie de fluorescence (FLIM). Cette dernière technique a d'ailleurs été récemment optimisée avec la mise en place d'un système d'excitation biphotonique multipoint qui permet d'accélérer significativement la vitesse d'acquisition des images. Il s'agit d'un système optique générant une matrice de 64 faisceaux excitateurs ce qui réduit considérablement le temps d'exposition des échantillons biologiques, les préservant ainsi des photodégradations. Ces techniques, largement complémentaires, ont permis de différencier, sur différents types de cytologies, les cellules présentant une faible malignité des cellules saines en utilisant comme facteur de contraste la fluorescence des entités intracellulaires. Grâce à cette méthode, les cellules de bas grades de malignité ont pu ainsi être identifiées sur des cytologies du col de l'utérus. En s'appuyant sur une démarche expérimentale similaire, un nouveau test a également été élaboré permettant de déceler avant traitement chez un patient une résitance à des polychimiothérapies usuellement utilisées dans le traitement des cancers urothéliaux tel que M-VAC. A l'issu de ce travail, une signature spectroscopique permettant de discriminer les cellules résistantes des cellules sensibles à la polychimiothérapie a pu être identifiée.

La biopsie du ganglion sentinelle (GS) est actuellement la technique de référence pour le diagnostic des métastases ganglionnaires du cancer du sein. Cependant, les traceurs utilisés pour la cartographie du GS (colorant bleu et radiocolloïde) ne sont pas idéaux et peuvent occasionner des réactions allergiques et engendrer des coûts importants. Une alternative à l'utilisation de ces traceurs repose sur le repérage du GS par imagerie de fluorescence proche infrarouge à l'aide de nanoparticules. Deux types de nanoparticules ont été étudiés : les Quantum Dots (QDs) à base d'indium et les nanoparticules de silice (NPSi) renfermant de la cyanine 7. Notre étude s'est basée sur des QDs-indium, dont la toxicité est supposée être plus faible que celle des QDs à base de cadmium. La visualisation du GS par les traceurs actuels étant altérée par l'envahissement métastatique du ganglion, un modèle murin de carcinome mammaire présentant des métastases ganglionnaires a été utilisé. La présence de cellules métastatiques dans le ganglion n'affecte pas la migration des QDs puisqu'aucune différence d'intensité de fluorescence n'a pu être détectée entre les ganglions sains et les ganglions envahis. L'étude de biodistribution a mis en évidence une capture majeure des QDs au point d'injection et dans les ganglions ainsi qu'une plus faible concentration dans le foie et la rate. La toxicité des QDs a été évaluée in vitro et a démontré une toxicité fortement réduite des QDs-indium par rapport aux QDs-cadmium. Les NPSi ont été largement appliquée à l'imagerie tumorale mais les études portant sur la visualisation du GS sont peu nombreuses. Les avantages de l'encapsulation de la cyanine 7, fluorophore hydrophobe émettant dans le proche infrarouge, dans des NPSi comprennent notamment une meilleure rétention dans le GS et une toxicité in vitro considérablement limitée par rapport au fluorophore libre. Les souris ont été suivies pendant 3 mois après injection de NPSi et aucun signe de toxicité générale ou hépatique n'a pu être décelé. Ces deux types de nanoparticules fluorescentes sont particulièrement bien adaptés à la cartographie du GS et pourraient avantageusement remplacer les traceurs employés actuellement.

L'utilisation de la microscopie confocale et biphotonique de fluorescence est de plus en plus répandue dans le domaine biomédical. En effet, l'imagerie d'intensité, de spectre et de durée de vie de fluorescence permettent de détecter, quantifier et imager les composants fluorescents intrinsèques d'un milieu biologique ainsi que les sondes extrinsèques. Dans le cadre du dépistage précoce de cancer, les modes de détection non-invasifs actuellement mis en place manquent de sensibilité pour permettre d'établir de manière fiable un diagnostic. Les médecins ont alors recours à des examens complémentaires, invasifs, comme la biopsie. Dans le cas de notre étude, différentes techniques de microscopie ont été exploitées pour mettre en place une méthode de diagnostic précoce non-invasive de cancer. Nous avons ainsi utilisé conjointement la microscopie confocale résolue spectralement et la microscopie biphotonique pour les images de durée de vie de fluorescence (FLIM). Cette dernière technique a d'ailleurs été récemment optimisée avec la mise en place d'un système d'excitation biphotonique multipoint qui permet d'accélérer significativement la vitesse d'acquisition des images. Il s'agit d'un système optique générant une matrice de 64 faisceaux excitateurs ce qui réduit considérablement le temps d'exposition des échantillons biologiques, les préservant ainsi des photodégradations. Ces techniques, largement complémentaires, ont permis de différencier, sur différents types de cytologies, les cellules présentant une faible malignité des cellules saines en utilisant comme facteur de contraste la fluorescence des entités intracellulaires. Grâce à cette méthode, les cellules de bas grades de malignité ont pu ainsi être identifiées sur des cytologies du col de l'utérus. En s'appuyant sur une démarche expérimentale similaire, un nouveau test a également été élaboré permettant de déceler avant traitement chez un patient une résitance à des polychimiothérapies usuellement utilisées dans le traitement des cancers urothéliaux tel que M-VAC. A l'issu de ce travail, une signature spectroscopique permettant de discriminer les cellules résistantes des cellules sensibles à la polychimiothérapie a pu être identifiée.

L’imagerie de fluorescence est une technique d’imagerie médicale permettant de visualiser l’émission d’un traceur, ou fluorophore, à l’aide d’une excitation de type Laser ou LED. Les domaines d’application de la technologie sont la chirurgie oncologique, la chirurgie reconstructive ou encore la chirurgie cardiaque. Bien que les besoins en chirurgie ouverte soient importants, l’évolution des pratiques tend à démocratiser la chirurgie dite minimalement invasive. La chirurgie endoscopique va dans ce sens, le but étant de limiter les traumatismes opératoires rencontrés en chirurgie ouverte. Parmi les avantages de cette techniques on note une diminution des saignements et de la douleur, ou encore une réduction de la durée d’hospitalisation.Lors d’une intervention de type chirurgie ouverte, le praticien peur se contenter de la seuls information de fluorescence fournie par le système d’imagerie. Cependant, tout l’enjeu de l’imagerie de fluorescence pour la chirurgie mini-invasive est de venir greffer ne information relative au fluorophore sur une image couleur de très bonne qualité, essentielle au chirurgien. Pour une première évaluation, un système deux caméras a été réalisé. Un capteur est dédié à l’acquisition de l’image couleur et un autre à l’information de fluorescence. Cependant, notamment pour conserver pour conserver un système compact et proposer la meilleure ergonomie possible au chirurgien, l’endoscope final ne devra comporter qu’un seul imageur. Le principe de base est d’utiliser des impulsions de lumière d’excitation et de lumière blanche afin de séquentiellement acquérir les données de fluorescence et les images couleur. Il convient ensuite de traiter les informations recueillies pour reconstruire l’image désirée en temps réel. / Fluorescence image-guided surgery is a medical imaging modality which allows the surgeon to visualize a fluorescent probe previously injected to the patient. The probe could be specific or not and the technology is useful in a wide range of application from oncologic procedures to reconstructive surgeries or cardiac procedures. Despite the important needs of this technology in open-procedures, the surgery in general is more and more minimally invasive. The goal of mini-invasive surgery is to limit patient's per and post operation trauma. The advantages of the technique are a decrease of bleeding and pain and a decreasing hospitalization time.During an open surgery, the B&W fluorescence information given by the fluorescence image-guided surgery system is enough for the surgeon. For mini-invasive procedures, the in-game is to overlay the fluorescence information to high quality color image, compulsory for the surgeon to perform his procedure. As a first evaluation, a 2-sensors system has been rapidly developed. One sensor is dedicated to the acquisition of the color image and the other to the fluorescence information. In order to make the system more compact and improve the quality of the color image furnished to the surgeon, the final system should be composed of only one sensor. To create the color image and collect the fluorescence information with one sensor, the technique involved pulsed white light and excitation light in a sequential acquisition mode. The two information are combined and a real-time color plus fluorescence video is displayed to the surgeon.