Les microscopies optiques super-résolues aident à mieux comprendre certains mécanismes biomoléculaires, notamment au sein des neurones. Nous avons construit un tel microscope de type STED (STimulated Emission Depletion) pour observer des défauts azote-lacune (NV) fluorescents dans le diamant, et avons atteint une résolution de 50 nm. À plus long terme, cet instrument permettra d’étudier l’organisation macromoléculaire de protéines impliquées dans la plasticité synaptique, et marquées avec des nanodiamants (ND) fluorescents. Dans cette perspective, nous avons étudié la limite de résolution du STED pour des ND de tailles sub-longueur d’onde. Nos expériences, menées avec l’équipe de Stefan Hell (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry) ont montré que la taille du spot STED d’un NV dans un ND pouvait atteindre 10 nm, performance similaire à celle obtenue dans un diamant macroscopique. Nous pouvons aussi résoudre plusieurs centres NV dans un ND séparés de seulement ~15 nm. Ces résultats sont en accord avec les simulations numériques faites par l’équipe de Jean-Jacques Greffet (Laboratoire Charles Fabry). En parallèle, nous avons démontré l’internalisation spontanée de ND fluorescents dans des neurones corticaux d’embryons de souris en culture primaire, et étudié leur colocalisation avec des vésicules du réseau trans-Golgi. Enfin, nous avons débuté l’étude du trafic des vésicules contenant les ND et montré qu’il dépend du réseau de microtubules. Les paramètres du mouvement sont compatibles avec ceux des moteurs moléculaires, mais nous nous attendons à ce qu’ils soient différents dans le cas de la surexpression de protéines impliquées dans le trafic (travail en cours). / Super resolution microscopy techniques are a useful tool to understand some biomolecular mechanisms, particularly in neurons. We have built such a STED (STimulated Emission Depletion) microscope for observing Nitrogen-Vacancy (NV) fluorescent defect in diamond, and have reached a resolution of 50 nm. In the longer term, this instrument will study the macromolecular organization of proteins involved in synaptic plasticity and marked with fluorescent nanodiamonds (ND). In this context, we studied the resolution limit of STED for ND of subwavelength size. Our experiments, conducted with the team of Stefan Hell (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry) showed that the STED spot size of an NV in ND could reach 10 nm, which is similar to performances obtained in a macroscopic diamond. We can also resolve several NV centers, which are separated from only ~15 nm in the same ND. These results are in agreement with numerical simulations carried out by the team of Jean-Jacques Greffet (Laboratoire Charles Fabry). In parallel, we have demonstrated the spontaneous internalization of fluorescent ND in primary culture of cortical neurons from mouse embryos, and studied their colocalization with vesicles of the trans-Golgi network. Finally, we started the study of trafficking vesicles containing ND and showed that it depends on the microtubule network. The motion parameters are compatible with those of molecular motors, but we expect them to be different in the case of overexpression of proteins involved in traffic (work in progress).

Nanodiamanty (250 nm) boli podrobené oxidácií, a tiež separované podľa veľkosti. Následne bola na povrch nanodiamantov adsorbovaná rozvetvená vrstva polyglycerolu. Táto vrstva vzniká kyslo katalyzovanou ,,ring opening“ polymeráciou glycidolu s hydroxylovými a karboxylovými skupinami povrchu nanodiamantov. Vzniknutá polyglycerolová vrstva zvyšuje stabilitu a biokompatibilitu nanodiamantov. Po vytvorení polyglycerolovej vrstvy bol do reakcie pridaný glycidyl propargyl éter, čím došlo k terminácií polymerácie, v dôsledku zavedenia propargylu do reakcie. Prítomná trojná väzba umožňuje nové modifikácie povrchu, napr. prostredníctvom CuAAC reakcie. S využitím CuAAC reakcie je možné na povrch fluorescenčných nanodiamantov pripojiť manózu (so spojkou obsahujúcou azidoskupinu). Pripravené nanočastice boli charakterizované použitím fyzikálno chemických metód. Distribúcia veľkosti častíc bola meraná pomocou dynamického rozptylu svetla (DLS), a taktiež bola potvrdená obrazovou analýzou mikrografov z elektrónového transmisného mikroskopu (TEM). Vyhodnotené bolo aj správanie sa nanodiamantov v biologických podmienkach (stabilitné testy v 1xPBS, 10xPBS a 100 % FBS) a bol meraný aj zeta potenciál. Nakoniec boli pripravené fluorescenčné diamanty (250 nm) s naviazanou manózou. Vzhľadom k výsledkom termogravimetrie, meraniam DLS a pozorovania pomocou TEM môžeme povedať, pripravené nanodiamanty sú pokryté tenkou vrstvou polyglycerolu. Prítomnosť manózy bola zistená na základe FTIR spektier. Nami pripravené fluorescenčné nanodiamanty obalené vrstvou polyglycerolu sú vhodné pre ďalšie testovanie in vitro a in vivo vďaka ich stabilite v médiách s vysokým obsahom solí ako napr. fosfátový pufor (PBS) a nízkemu viazaniu proteínov vo fetalnom bovinnom sere (FBS).

Manipulating light by controlling surface plasmons on metals is being discussed as a means for bridging the size gap between micrometer-sized photonic circuits and nanometer-sized integrated electronics. Plasmonic waveguides based on metal nanoparticles are of particular interest for circumventing the diffraction limit, thereby enabling high-speed communication over short-range distances in miniaturized micro-components. However, scalable, inexpensive fine-tuning of particle assemblies remains a challenge and near-field probing is required to reveal plasmonic interactions. In this thesis, self-assembled waveguides should be produced on DNA scaffolds. DNA origami is an extremely versatile and robust self-assembly method which allows scalable production of nanostructures with a fine control of assemblies at the nanoscale. To form the plasmonic waveguides, six-helix bundle DNA origami nanotubes are used as templates for attachment of highly monodisperse and monocrystalline gold nanoparticles with an inter-particle distance of 1-2 nm. In the first part of this thesis, the effects of parameters which are involved in assembly reactions are systematically investigated. The assembly yield and binding occupancy of the gold nanoparticles are determined by an automated, high-throughput image analysis of electron micrographs of the formed complexes. As a result, unprecedented binding site occupancy and assembly yield are achieved with the optimized synthesis protocol. In addition, waveguides with different sizes of gold nanoparticles and different inter-particle distances, quantum dots attachments to the waveguides and multimerization of the waveguides are successfully realized. In the second part of this thesis, direct observation of energy transport through a self-assembled waveguide towards a fluorescent nanodiamond is demonstrated. High-resolution, near-field mapping of the waveguides are studied by electron energy loss spectroscopy and cathodoluminescence imaging spectroscopy. The experimental and simulation results reveal that energy propagation through the waveguides is enabled by coupled surface plasmon modes. These surface plasmon modes are probed at high spatial and spectral resolutions. The scalable self-assembly approach presented here will enable the construction of complex, sub diffraction plasmonic devices for applications in high-speed optical data transmission, quantum information technology, and sensing. / Die Manipulation des Lichts durch die Kontrolle von Oberflächenplasmonen auf metallischen Oberflächen und Nanopartikeln gilt als vielversprechende Methode zur Überbrückung der Größen-Lücke zwischen Mikrometer-großen photonischen und nanometer-großen elektronischen Schaltkreisen. Plasmonische Wellenleiter basierend auf metallischen Nanopartikeln sind vom besonderen Interesse, da sie die Umgehung des Beugungslimits und somit eine Hochgeschwindigkeitskommunikation über kurze Distanzen in immer kleiner werdenden Schaltkreisen ermöglichen könnten. Allerdings ist die skalierbare und kostengünstige Anordnung von Partikeln eine große Herausforderung und es werden Nahfelduntersuchungen benötigt um plasmonische Interaktionen detektieren zu können. Das Ziel dieser Arbeit ist die Selbstassemblierung von multi-partikel Wellenleitern auf DNA Gerüsten. Die Verwendung von DNA-Origami bietet eine äußerst vielseitige Plattform zur skalierbaren Herstellung von Nanostrukturen mittels Selbstassemblierung und ermöglicht eine präzise Kontrolle der Anordnungen im Nanobereich. Für den Aufbau der plasmonischen Wellenleiter werden DNA-Origami Nanoröhren, bestehend aus sechs Helices als Templat für die Anbindung von monodispersen und monokristallinen Goldnanopartikeln mit einem interpartikulären Abstand von 1-2 nm verwendet. Im ersten Abschnitt dieser Arbeit werden die beeinflussenden Faktoren dieser Assemblierungsreaktion systematisch untersucht. Die Ausbeute der assemblierten Strukturen und die Besetzung der Bindungsstellen werden durch eine automatisierte und effiziente Bildanalyse von Elektronenmikroskopieaufnahmen ausgewertet. Durch die Entwicklung eines optimierten Syntheseprotokolls werden bisher unerreichte Assemblierungsausbeuten ermöglicht. Zusätzlich erfolgen die experimentelle Realisierung von Strukturen mit verschieden großen Goldnanopartikeln und unterschiedlichen interpartikulären Abständen, sowie die Anbindung von Quantenpunkten an die Wellenleiter und eine Verknüpfung der assemblierten Strukturen. Der zweite Abschnitt dieser Dissertation befasst sich mit der Untersuchung des Energietransports in selbstassemblierten Wellenleitern über einen fluoreszierenden Nanodiamanten. Dazu erfolgen hochaufgelöste Nahfeldmessungen der Wellenleiter mittels Elektronenenergieverlustspektroskopie und Kathodolumineszenz-mikroskopie. Die experimentellen Ergebnisse und zusätzlich durchgeführte Simulationen bestätigen eine durch gekoppelte Oberflächenplasmonenmoden induzierte Weitergabe der Energie innerhalb des Wellenleiters. Diese Oberflächenplasmonenmoden werden bei hoher räumlicher und spektraler Auflösung untersucht. Das hier umgesetzte Konzept der Selbstassemblierung wird den Aufbau komplexer plasmonischer Geräte für Anwendungen im Bereich der optischen Hochgeschwindigkeitsdatenübertragung, der Quanteninformations-technolgie und der Sensorik ermöglichen.

Manipulating light by controlling surface plasmons on metals is being discussed as a means for bridging the size gap between micrometer-sized photonic circuits and nanometer-sized integrated electronics. Plasmonic waveguides based on metal nanoparticles are of particular interest for circumventing the diffraction limit, thereby enabling high-speed communication over short-range distances in miniaturized micro-components. However, scalable, inexpensive fine-tuning of particle assemblies remains a challenge and near-field probing is required to reveal plasmonic interactions. In this thesis, self-assembled waveguides should be produced on DNA scaffolds. DNA origami is an extremely versatile and robust self-assembly method which allows scalable production of nanostructures with a fine control of assemblies at the nanoscale. To form the plasmonic waveguides, six-helix bundle DNA origami nanotubes are used as templates for attachment of highly monodisperse and monocrystalline gold nanoparticles with an inter-particle distance of 1-2 nm. In the first part of this thesis, the effects of parameters which are involved in assembly reactions are systematically investigated. The assembly yield and binding occupancy of the gold nanoparticles are determined by an automated, high-throughput image analysis of electron micrographs of the formed complexes. As a result, unprecedented binding site occupancy and assembly yield are achieved with the optimized synthesis protocol. In addition, waveguides with different sizes of gold nanoparticles and different inter-particle distances, quantum dots attachments to the waveguides and multimerization of the waveguides are successfully realized. In the second part of this thesis, direct observation of energy transport through a self-assembled waveguide towards a fluorescent nanodiamond is demonstrated. High-resolution, near-field mapping of the waveguides are studied by electron energy loss spectroscopy and cathodoluminescence imaging spectroscopy. The experimental and simulation results reveal that energy propagation through the waveguides is enabled by coupled surface plasmon modes. These surface plasmon modes are probed at high spatial and spectral resolutions. The scalable self-assembly approach presented here will enable the construction of complex, sub diffraction plasmonic devices for applications in high-speed optical data transmission, quantum information technology, and sensing. / Die Manipulation des Lichts durch die Kontrolle von Oberflächenplasmonen auf metallischen Oberflächen und Nanopartikeln gilt als vielversprechende Methode zur Überbrückung der Größen-Lücke zwischen Mikrometer-großen photonischen und nanometer-großen elektronischen Schaltkreisen. Plasmonische Wellenleiter basierend auf metallischen Nanopartikeln sind vom besonderen Interesse, da sie die Umgehung des Beugungslimits und somit eine Hochgeschwindigkeitskommunikation über kurze Distanzen in immer kleiner werdenden Schaltkreisen ermöglichen könnten. Allerdings ist die skalierbare und kostengünstige Anordnung von Partikeln eine große Herausforderung und es werden Nahfelduntersuchungen benötigt um plasmonische Interaktionen detektieren zu können. Das Ziel dieser Arbeit ist die Selbstassemblierung von multi-partikel Wellenleitern auf DNA Gerüsten. Die Verwendung von DNA-Origami bietet eine äußerst vielseitige Plattform zur skalierbaren Herstellung von Nanostrukturen mittels Selbstassemblierung und ermöglicht eine präzise Kontrolle der Anordnungen im Nanobereich. Für den Aufbau der plasmonischen Wellenleiter werden DNA-Origami Nanoröhren, bestehend aus sechs Helices als Templat für die Anbindung von monodispersen und monokristallinen Goldnanopartikeln mit einem interpartikulären Abstand von 1-2 nm verwendet. Im ersten Abschnitt dieser Arbeit werden die beeinflussenden Faktoren dieser Assemblierungsreaktion systematisch untersucht. Die Ausbeute der assemblierten Strukturen und die Besetzung der Bindungsstellen werden durch eine automatisierte und effiziente Bildanalyse von Elektronenmikroskopieaufnahmen ausgewertet. Durch die Entwicklung eines optimierten Syntheseprotokolls werden bisher unerreichte Assemblierungsausbeuten ermöglicht. Zusätzlich erfolgen die experimentelle Realisierung von Strukturen mit verschieden großen Goldnanopartikeln und unterschiedlichen interpartikulären Abständen, sowie die Anbindung von Quantenpunkten an die Wellenleiter und eine Verknüpfung der assemblierten Strukturen. Der zweite Abschnitt dieser Dissertation befasst sich mit der Untersuchung des Energietransports in selbstassemblierten Wellenleitern über einen fluoreszierenden Nanodiamanten. Dazu erfolgen hochaufgelöste Nahfeldmessungen der Wellenleiter mittels Elektronenenergieverlustspektroskopie und Kathodolumineszenz-mikroskopie. Die experimentellen Ergebnisse und zusätzlich durchgeführte Simulationen bestätigen eine durch gekoppelte Oberflächenplasmonenmoden induzierte Weitergabe der Energie innerhalb des Wellenleiters. Diese Oberflächenplasmonenmoden werden bei hoher räumlicher und spektraler Auflösung untersucht. Das hier umgesetzte Konzept der Selbstassemblierung wird den Aufbau komplexer plasmonischer Geräte für Anwendungen im Bereich der optischen Hochgeschwindigkeitsdatenübertragung, der Quanteninformations-technolgie und der Sensorik ermöglichen.