In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich die kohärente mehrdimensionale Femtosekunden- Spektroskopie zu einem leistungsstarken und vielseitigen Instrument zur Untersuchung der chemischen Dynamik einer Vielzahl von Quantensystemen entwickelt. Die Kombination von transienten Informationen, die der Anrege-Abrage-Spektroskopie entsprechen, mit Informationen zur Kopplung zwischen energetischen Zuständen und der Systemumgebung ermöglicht einen umfassenden Einblick in atomare und molekulare Eigenschaften. Viele experimentelle 2D-Aufbauten verwenden den kohärenzdetektierten Ansatz, bei dem nichtlineare Systemantworten als kohärente elektrische Felder emittiert und räumlich getrennt von den Anregungspulsen detektiert werden. Als Alternative zu diesem experimentell anspruchsvollen Ansatz wurde die populationsbasierte 2D-Spektroskopie etabliert. Hier wird die kohärente Information in den Phasen einer kollinearen Anregungspulsfolge codiert und aus inkohärenten Signalen wie Fluoreszenz über Phase Cycling extrahiert. Grundsätzlich kann durch die Verwendung von Fluoreszenz als Observable eine Sensitivität bis zum Einzelmolekülniveau erreicht werden. Ziel dieser Arbeit war die Realisierung eines pulsformergestützten vollständig kollinearen fluoreszenzdetektierten 2D-Aufbaus und die Durchführung von Proof-of- Principle-Experimenten in der Flüssigphase. Dieser inhärent phasenstabile und kompakte Aufbau wurde in Kapitel 3 vorgestellt. Der verwendete Pulsformer ermöglicht eine Amplituden- und Phasenmodulation von Schuss zu Schuss. Zwei verschiedene Arten von Weißlichtquellen wurden angewendet und hinsichtlich ihrer jeweiligen Vorteile für die 2D-Fluoreszenzspektroskopie bewertet. Eine Vielzahl von Artefaktquellen, die mit dem vorliegenden Aufbau auftreten können, wurden diskutiert und Korrekturschemata und Anweisungen zur Vermeidung dieser Artefakte bereitgestellt. In Kapitel 4 wurde der Aufbau anhand einer Vierpulssequenz mit Cresylviolett in Ethanol demonstriert. Es wurde ein detailliertes Datenerfassungs- und Datenanalyseverfahren vorgestellt, bei dem Phase Cycling zur Extraktion der nichtlinearen Beiträge verwendet wird. Abhängig vom Phase Cycling-Schema ist es möglich, alle nichtlinearen Beiträge in einer einzigen Messung aufzudecken. Literaturbekannte Oszillationen von Cresylviolett während der Populationszeit konnten reproduziert werden. Aufgrund der Messung in einer Umgebung im Rotating Frame und einer 1 kHz Schuss-zu-Schuss Pulsinkrementierung war es möglich, ein 2D-Spektrum für eine Populationszeit in 6 s zu erhalten. Eine Fehlerevaluierung hat gezeigt, dass eine zehnfache Mittelwertbildung (1 min) ausreicht, um eine mittlere quadratische Abweichung von < 0:05 gegen� uber einer 400-fachen Mittelwertbildung zu erhalten, was beweist, dass das verwendete Messschema gut geeignet ist. Die Realisierung des ersten experimentellen fluoreszenzdetektierten 2Q-2D-Experiments und der erste experimentelle Zugang zum theoretisch vorhergesagten 1Q-2Q-Beitrag wurden in Kapitel 5 vorgestellt. Zu diesem Zweck wurde eine Dreipulssequenz auf Cresylviolett in Ethanol angewendet und die experimentellen Ergebnisse wurden mit Simulationen eines einfachen Sechs-Level-Systems verglichen. Im Gegensatz zur kohärenzdetektierten 2Q-2D-Spektroskopie sind bei dem vorgestellten Aufbau keine nichtresonanten Lösungsmittelsignale und Streuungsbeiträge sichtbar und es ist kein zusätzliches Phasing-Verfahren erforderlich. Durch eine Kombination aus Experimenten und systematischen Simulationen wurden Informationen über die Relaxation der Lösungsmittelhülle und die Korrelationsenergie gewonnen. Auf der Basis von Simulationen wurden Effekte der Pfadauslöschung diskutiert, die darauf schließen lassen, dass die 1Q-2Q-2D-Spektroskopie möglicherweise die quantitative Analyse für molekulare Systeme erleichtert, die eine starke nichtstrahlende Relaxation aus höheren elektronischen Zuständen aufweisen. Zusammenfassend ist es mit der vorgestellten Methode möglich, alle nichtlinearen Beiträge mit einer schnellen Datenaufnahme und einem einfach einzurichtenden Aufbau zu erfassen. Die gezeigten Proof-of-Principle-Experimente stellen eine Erweiterung der 2D-Spektroskopie-Werkzeugpalette dar und bieten eine fundierte Grundlage für zukünftige Anwendungen wie mehrdimensionale Spektroskopie, mehrfarbige 2D-Spektroskopie oder die Kombination von simultanen Flüssig- und Gasphasen-2D-Experimenten. / In the last two decades, coherent multidimensional femtosecond spectroscopy has become a powerful and versatile tool to investigate chemical dynamics of a broad variety of quantum systems. The combination of transient information, equivalent to pumpprobe spectroscopy, with information about coupling between energetic states and the system environment allows an extensive insight into atomic and molecular properties. Many experimental 2D setups employ the coherence-detected approach, where nonlinear system responses are emitted as coherent electric _elds which are detected after spatial separation from the excitation pulses. As an alternative to this experimentally demanding approach, population-based 2D spectroscopy has been established. Here, the coherent information is encoded in the phases of a collinear excitation-pulse train and extracted from incoherent signals like uorescence via phase cycling. In principle, the use of uorescence as observable can boost the sensitivity down to the single-molecule level. The aim of this work was the realization of a pulse-shaper assisted fully collinear uorescence-detected 2D setup and the conducting of proof-of-principle experiments in the liquid phase. This inherently phase-stable and compact setup has been presented in chapter 3, with the utilized pulse shaper granting amplitude and phase modulation on a shot-to-shot basis. Two di_erent types of white-light sources have been applied and evaluated with regard to their respective advantages for 2D uorescence spectroscopy. A variety of artifact sources that can occur with the present setup have been discussed, and correction schemes and instructions for avoiding these artifacts have been provided. In chapter 4, the setup has been demonstrated by employing a four-pulse sequence on cresyl violet in ethanol. A detailed data-acquisition and data-analysis procedure has been presented, where phase cycling is used for extraction of the nonlinear contributions. Depending on the phase-cycling scheme, it is possible to recover all nonlinear contributions in a single measurement. Well-known quantum-beating behavior of cresyl violet during the population time could be reproduced. Due to measuring in a rotating-frame environment and 1 kHz shot-to-shot pulse incrementation, it was possible to obtain a 2D spectrum for one population time in 6 s. Via error evaluation it has been shown that 10_ averaging (1 min) is su_cient to obtain a root-mean-square error of < 0:05 compared to 400_ averaging, proving that the utilized acquisition scheme is well suited. The realization of the _rst experimental uorescence-detected 2Q 2D experiment and the _rst experimental access to the theoretically predicted 1Q-2Q contribution

Im Forschungsfeld der Proteindynamik häufen sich in den letzten Jahren Untersuchungen an einzelnen Molekülen. Damit können molekulare Ereignisse, die in konventioneller Spektroskopie durch stochastische Prozesse unentdeckt bleiben, durch direkte Beobachtung identifiziert und analysiert werden, was zu tieferem mechanistischem Verständnis des untersuchten Systems beitragen kann. Die Implikation des molekularen Chaperons Hsp90 in die korrekte Faltung und Aktivierung einer Vielzahl davon abhängiger Klientenproteine machen es zu einem zentralen Knotenpunkt der zellulären Proteinhomöostase, allerdings ist der Mechanismus seiner breiten Klientenerkennung und -prozessierung bisher nur lückenhaft untersucht. Mit der Erkenntnis, dass Hsp90 ATP abhängig große, ratenlimitierende Umstrukturierungen erfährt, wurden Reportersysteme entwickelt, die auf dem Förster-Resonanzenergietransfer mit einer räumlichen Auflösung von ca. 2-10 nm basieren. Diese dokumentieren einen Klammerschluss des Chaperons und prognostizieren einen intermediatbbasierten Konformations-Zyklus. Details über den Mechanismus der Umstrukturierungen wurden mit der Entwicklung von Reportersystemen ermittelt, die auf dem photoinduzierten Elektronentransfer zwischen der Aminosäure Tryptophan und einem organischen Farbstoff basieren. Die Technik beruht auf kontaktinduzierter Fluoreszenzlöschung und damit verbundenen digitalen Intensitätsübergängen, dabei ermöglicht die räumliche Sensitivität von < 1 nm die Beobachtung von lokalen Umstrukturierungen. In Hsp90 wurden damit mittels konventioneller Spektroskopie drei kritische lokale Umlagerungen untersucht und daraus ein Modell mit heterogenen apo-Konformationen sowie ein kooperativer Konformationszyklus abgeleitet, der dem intermediatbasierten Modell gegenübersteht. Im Rahmen dieser Dissertation wurde anhand des Hsp90-Chaperons eine Methode entwickelt, die eine bildgebende PET Fluoreszenzspektroskopie von mehreren Umstrukturierungen gleichzeitig an einzelnen Molekülen erlaubt. Ein umfangreiches Farbstoffscreening führte zur Identifizierung eines Farbstoffpaars, das die PET-basierte simultane Aufzeichnung zweier Konformations-Koordinaten ermöglicht. Über verschiedene Modifikationen des Chaperons konnten einzelmolekültaugliche Oberflächen hergestellt werden, auf denen zweifach markierte Hsp90-Proteine immobilisiert sind. Fluoreszenzintensitätszeitspuren einzelner Chaperone und entsprechende Kontrollkonstrukte bestätigen qualitativ den Erfolg der Methode, für die quantitative Analyse wurde eine Routine in der Programmiersprache Python entwickelt, mit welcher kinetische Informationen ermittelt werden konnten. Diese legen eine enge wechselseitige Abhängigkeit der drei lokalen Elemente nahe, wobei der Großteil der Konformationsübergänge zweier simultan aufgezeichneter Umstrukturierungen Synchronität innerhalb von zwei Sekunden zeigt. Im Vergleich zur Hydrolyse von einem ATP in mehreren Minuten deutet das auf eine enge Kopplung hin. Weiter konnte eine Beschleunigung der Dynamiken durch aromatische Modifikation des N-Terminus von Hsp90 beobachtet werden, zudem erlaubt der Einzelmolekülansatz die Verwendung des nativen Nukleotids ATP, wodurch auch die lokalen Öffnungsdynamiken zugänglich werden. Die zur Bestimmung der Zeitkonstanten durchgeführte Analyse unterstützt die Ansicht heterogener apo-Zustände und einer einheitlich geschlossenen Konformation. Die bildgebende Zweifarben-Einzelmolekül-PET-Spektroskopie konnte insgesamt zu einem Komplement der Einzelmolekül-FRET-Spektroskopie entwickelt werden, um damit lokale Konformationsdynamiken zu untersuchen. Der bildgebende Ansatz erlaubt eine einfache Implementierung in einen experimentellen Einzelmolekül-FRET Aufbau bei gleichzeitiger Erweiterung der beobachteten Koordinaten und wird so zu einem breit anwendbaren Werkzeug multidimensionaler Dynamikuntersuchungen einzelner Proteine. / Over the past years, the number of investigations of single molecules has risen in the field of protein dynamics studies. Direct observation of molecular events that are obscured by stochastic processes in bulk measurements can provide a deeper mechanistic understanding of the systems under study. The molecular chaperone Hsp90, as being involved in the correct folding and activation of client proteins, thereby acting at late-stage folding, is a central node of cellular protein homeostasis. The mechanistic understanding of its broad client recognition and processing capability still remains elusive. The discovery of large conformational changes that drive the chaperone through a rate limiting conformational cycle as a reaction of ATP binding led to the development of reporter systems that probe the global rearrangement. As the reporters are based on Förster resonance energy transfer, they are active on a spatial scale of 2-10 nm and report on the molecular clamp closure. The predicted conformational cycle implicates several intermediate states. Details of the underlying rearrangements were obtained by the development of reporter systems based on photoinduced electron transfer between the amino acid tryptophan and an organic dye. As the technique relies on contact-induced quenching of fluorescence, which is accompanied by digital intensity transitions, the resulting spatial resolution of < 1 nm enables probing of local conformational rearrangements. In bulk experiments, three critical local dynamics were probed in Hsp90, leading to the assumption of heterogeneous apo conformations and an associated cooperative cycle which faces the intermediate-based model. Within the scope of this doctoral thesis, two color single-molecule PET fluorescence imaging spectroscopy was developed using the Hsp90 chaperone to study multiple conformational rearrangements simultaneously on individual proteins. Extensive dye screening identified a dye pair suitable for the PET-based investigation of two different conformational coordinates simultaneously. Modifications on the chaperone protein enabled the immobilization of double-labeled Hsp90 molecules on glass surfaces that are suited for single-molecule studies. Fluorescence intensity time traces of single chaperones and related control constructs validated qualitatively the success of the method. For quantitative analysis, a routine was developed in the programming language Python to obtain kinetic information. Derived kinetics pointed to a close interdependence between the three local elements. Furthermore, the majority of state transitions of rearrangements studied at the same time occurred simultaneously within a two-second window, thereby suggesting synchronicity. Compared to the hydrolysis of one ATP molecule taking minutes, this suggests a tight coupling of motions. Further, an aromatic modification of the Hsp90 N-Terminus resulted in accelerated local dynamics. Besides investigating the dynamics accompanying clamp closure, clamp opening kinetics also became accessible through the use of native nucleotide ATP. The analysis performed as part of the determination of time constants supports the view of a heterogeneous apo and a uniformly closed conformation. Two-color single-molecule PET fluorescence imaging spectroscopy was developed into a technique complement to single-molecule FRET spectroscopy that enables the probing of local conformational dynamics in immobilized proteins. The imaging approach allows for easy implementation in a single-molecule FRET setup while expanding the observed coordinates, making the PET-based technique a widely applicable tool for multidimensional dynamics studies of single proteins.

Die vorliegende Dissertation leistet einen Beitrag zur spektroskopischen Messmethodik nanoskaliger Strukturen. Im Mittelpunkt der Arbeit steht die Entwicklung und Erprobung eines spektrofluorimetrischen Aufbaus, mit dessen Hilfe ein aus Kohlenstoffnanoröhren und DNA-Oligomeren bestehendes supramolekulares Modellsystem einer optischen Untersuchung zugänglich gemacht wird. Die Vielseitigkeit der Messeinheit aus Mikroskop und Spektrometer wird an einer weiteren Substanzklasse untermauert. So wird das Emissionsverhalten von in Siliziumcarbidkristallen induzierten Defektzentren einer räumlich, spektral und zeitlich aufgelösten Charakterisierung unterzogen. Die zentrale Komponente des Spektrofluorimetrieaufbaus stellt eine Superkontinuumlichtquelle dar. In Verbindung mit einem elektronisch geregelten Filtermodul zur Wellenlängenselektion erlaubt sie die Durchführung von Photolumineszenz-Anregungsexperimenten. Im Gegensatz zu kommerziell erhältlichen Systemen, die überwiegend auf eine spektroskopische Charakterisierung gelöster oder kolloidal stabilisierter Substanzen abzielen, erlaubt der hier realisierte Aufbau auch die PL- mikroskopische Untersuchung kondensierter Proben, was durch die Epi-Bauweise auch opake Substrate einschließt. Der Einsatz von InGaAs-Sensoren weitet das Detektionsfenster auf den Nahinfrarotbereich aus, sowohl hinsichtlich des Kamera- als auch des Spektroskopiekanals. Anhand verschiedenartiger Kohlenstoffnanorohrproben, die entweder in flüssiger Phase dispergiert oder in festem Zustand als Film abgeschieden vorliegen, wird die Leistungsfähigkeit des PLE-Experiments unter Beweis gestellt. Neben der Zuordnung der Chiralitäten in polydispersen SWNT-Suspensionen wird dies auch durch die Untersuchung von Energietransferprozessen und die Studie von Umgebungseinflüssen demonstriert. Die Charakterisierung des DNA-SWNT-Modellsystems in mikrofluidischer Umgebung macht von der fluoreszenzmikroskopischen Detektionseinheit Gebrauch. Während die intrinsische Photolumineszenz der Nanoröhren sicherstellen soll, dass Letztere in ausreichender Anzahl auf den mikrostrukturierten Substraten vorhanden sind, wird die extrinsische Photolumineszenz der funktionalisierten Oligonukleotide als spektroskopisches Maß für die DNA-Konzentration herangezogen. Das hierbei beobachtete Agglomerationsverhalten der farbstoffmarkierten Oligomere geht mit einer lokal erhöhten Fluoreszenzintensität einher und erlaubt damit die quantitative Auswertung der auf PL-Einzelbildern basierenden Zeitserien. Zugleich wird damit eine Abschätzung der DNA-Belegung auf den Nanoröhren möglich. Im Falle der aus 16 alternierenden Guanin-Thymin-Einheiten bestehenden Basensequenz lösen sich nach Initiieren des Desorptionsvorgangs ein Großteil der Oligomere von der Nanorohroberfläche ab. Lediglich ein Fünftel bleibt in adsorbierter Form zurück, was sich jedoch für die Hybridstabilität als ausreichend erweist. Die Freisetzung weiterer Oligomere bleibt bei der Versuchstemperatur von 20 °C trotz der hohen Verdünnung aus, da aufgrund des größeren Interadsorbatabstands und der damit verbundenen Abnahme repulsiver Wechselwirkungen die Aktivierungsbarriere für ihre Desorption steigt. Die Stabilität der DNA-SWNT-Konjugate liegt demnach in ihrer kinetischen Inertheit begründet, die sie vor einer Reaggregation bewahrt. Die Studie der in Siliziumcarbid induzierten Fehlstellendefekte kann als Beleg für die breite Anwendbarkeit des spektrofluorimetrischen Aufbaus gelten. PL-Mikroskopaufnahmen zeigen hierbei, dass die Anzahl der Defektzentren mit der Bestrahlungsintensität kontrolliert werden kann – von einer kontinuierlichen Verteilung bei hohen Strahlungsintensitäten über heterogene Defektansammlungen bis hin zu Einzeldefektstellen bei niedrigen Strahlungsdosen. Letztere resultieren in beugungsbegrenzten Signaturen und erlauben damit eine Charakterisierung des abbildenden Systems sowie des Anregungsfokus. Anhand der PLE-Analyse lässt sich das Absorptionsmaximum abschätzen. Aussagen zur zeitlichen Entwicklung des Emissionsverhaltens werden durch TCSPC-Messungen erhalten. Die abschließende Untersuchung des Photonenflusses mit Hilfe von Korrelationsexperimenten nach Hanbury Brown-Twiss zeigt bei Raumtemperatur kein Auftreten von Photonantibunching. / Within the scope of this dissertation, a contribution towards the spectroscopic investigation of nanomaterials has been made. The approach applied here is a spectrofluorometric one, which allows the optical characterization of an oligonucleotide/single-wall carbon nanotube comprised supramolecular model system. The flexibility of the developed setup is demonstrated by studying another class of nanoscale samples, that is defect centers in silicon carbide crystals. Their emission behavior is subject to a spacial, spectral and temporal analysis. The key role in the combined microscope and spectrograph assembly is held by a supercontinuum light source. With the help of this device, excitation measurements can be conducted by shifting the wavelength with an electronically driven filter accessory. In contrast to commercially available systems, which predominantly focus on a spectroscopic characterization of substances in solution or in colloidal suspension, it is also possible to carry out PL microscopic studies of condensed matter. Because of an epifluorescence configuration, the samples to be measured imply opaque substrates as well. Using complementary sensor materials including InGaAs arrays enlarges the accessible range of emission for both imaging and spectroscopy. Differently processed carbon nanotube samples, occurring in either dispersed or deposited form, serve as a benchmark in assessing the capability of the PLE setup established here. For instance, it can be used to assign chiralities in heterogeneous SWNT suspensions or to analyze energy transfer as well as the impact of varying colloidal conditions. The studies of the DNA-SWNT model system are accomplished through the use of fluorescence microscopy under microfluidic control. The intrinsic photoluminescence of carbon nanotubes can be exploited to estimate, to what extent they cover the lithographically treated silicon wafers. The extrinsic photoluminescence of functionalized oligonucleotides is used as a spectroscopic probe for DNA concentration measurements. Bright spots with distinct shape are observed and attributed to an agglomeration of dye-labeled oligomers. By recording time series of PL images, the locally enhanced emission signal in these discrete sites can be quantitatively analyzed, representing the progress of DNA adsorption on SWNTs. Based on a DNA sequence consisting of 16 alternating guanine-thymine moieties, the present experiments reveal the release of most of the oligonucleotides, when starting off the desorption process. Only one fifth of the initially adsorbed amount remains attached to the nanotube surface, without the modified environment affecting hybrid stability. Remarkably, an ongoing desorption does not take place at the test temperature of 20 °C in spite of the vast dilution applied. This circumstance can be explained by an increased distance between the residually adsorbed oligonucleotides, resulting in less pronounced repulsive forces between them. Consequently, the activation energy barrier for inducing further detachment is raised. In case of sufficiently long base compositions, this suggests that the stability of conjugates is founded in their kinetic inertness. The absence of continued desorption eventually prevents these DNA-SWNT hybrids from reaggregating. The investigation of vacancy defects in silicon carbide proves the broad applicability of the spectrofluorimetric setup. PL microscopic studies show that the amount of defect sites can be controlled by tuning electron irradiance. The corresponding defect pattern evolves from a continuous distribution towards discrete clusters. By lowering the exposure dose even more, single defects emerge showing diffraction-limited signatures, which can help to elucidate the imaging system as well as the excitation focus in more detail. PLE mapping and time-correlated single photon counting of the fluorescence decay provide insight in photophysical parameters, including the absorption maxium and the lifetime of the excited state. Studying the photon flux by means of correlation measurements according to Hanbury Brown-Twiss does not give rise to photon antibunching under ambient conditions.

Univ., Diss., 2009--Kassel.

Regensburg, University, Diss., 2005.

Regensburg, Univ., Diss., 2003. / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2003.

University, Diss., 2003--Jena. / Text engl.

Universiẗat, Diss., 1999--Tübingen.

Universiẗat, Diss., 2002--Dortmund.

Universiẗat, Diss., 2004--Kiel.