Although F1-ATPase is extremely conserved among organisms, a putative subunit p18 was identified in Trypanosoma brucei F1-ATPase complex. To explore its function in the procylic, bloodstream and dyskinetoplastic trypanosomes, three different RNAi cell lines were created. Upon p18 silencing the F1-moiety structural integrity was impaired suggesting that p18 is indeed a bona fide subunit of this complex. Since F1-ATPase is crucial for the bloodstream form survival, its potential inhibitor from the 4-oxopiperidine-3,5-dicarboxylates class (JK-11) was examined. JK-11 inhibited growth of the bloodstream trypanosomes, decreased mitochondrial membrane potential and reduced ATPase and ATP synthase activity in mitochondrial lysates. Our results suggest that JK-11 may act on FoF1-ATP synthase/ATPase and its inhibition may contribute to the cytotoxicity of this drug.

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This thesis primarily focuses on the FoF1-ATP synthase/ATPase complex in the parasitic protist, Trypanosoma brucei. Instead of its normal aerobic function to synthesize ATP, it is required to hydrolyze ATP to maintain the m in the infective bloodstream stage of T. brucei and the related parasite, T. b. evansi. To better understand the composition, structure and function of this druggable target, my work focused on deciphering the function of three of the unique Euglenozoa specific subunits that comprise this complex molecular machine. Furthermore, the ADP/ATP carrier, which provides substrates for the FoF1-ATP synthase/ATPase, was functionally characterized and evaluated if it is physically associated with the complexes of the oxidative phosphorylation pathway.

Zu den Eigenschaften eukaryotischer Zellen gehört ihre Kompartimentierung, welche durch die Abtrennung verschiedener Reaktionsräume durch Lipiddoppelschichten erreicht wird. Verschiedene Vesikel-Transportwege verbinden diese Kompartimente miteinander, einer dieser Wege in der Hefe Saccharomyces cerevisiae ist der sogenannte ALP-Weg. Dieser gehört zu den biosynthetischen Wegen, über die neue Proteine an ihren Bestimmungsort gebracht werden, in diesem Falle die Vakuole. Ausgehend vom Golgi-Apparat werden die Vesikel dieses Weges mit Hilfe des Adaptorproteinkomplexes-3 (AP-3) gebildet. Ein weiteres Protein, das eine spezifische Funktion in diesem Weg übernimmt, ist Vps41. Ein aktuelles Modell beschreibt seine Funktion in der Aufnahme der Vesikel an der Vakuole. Es konnte gezeigt werden, das Vps41 mit der sogenannten ear-Domäne von Apl5, einer Untereinheit des AP-3- Komplexes, interagiert. In dieser Arbeit konnte ich nachweisen, dass die Interaktionsstelle im Vps41 innerhalb einer konservierten PEST-Domäne liegt. Eine Deletion dieser Domäne beeinflußte die Funktion des Proteins im ALP-Weg jedoch nicht die in der homotypischen Vakuolenfusion und im CPY-Weg. Eine weitere Eingrenzung des deletierten Bereiches zeigte, dass die PEST-Domäne eine Sequenz enthält, die einem Di-Leucin- Sortierungssignal ähnlich ist. Dieses konnte ich als minimal notwendigen Bereich für die Wechselwirkung mit der Apl5-ear-Domäne bestimmen. Meine Daten zeigen, dass dieser Bereich des Proteins notwendig ist für das Docking der AP-3-Vesikel an der Vakuole. Weiterhin konnte ich eine kompetitive Bindung von Liposomen und Apl5 an die N-terminale Hälfte von Vps41 zeigen. Zusammengefasst und mit aktuellen Veröffentlichungen in Zusammhang gebracht, ergänzen meine Daten das Modell der Funktion von Vps41 in der Vesikelaufnahme an der Vakuole: Vps41 wird durch die Rab-GTPase Ypt7, als deren Effektorprotein, an späte Endosomen gebunden. An dieser stark gekrümmten Membran taucht ein kürzlich identifiziertes ALPS (amphipathic lipid packing sensor)-Motiv im Vps41 in die Membran des Organells ein und zieht so den N-terminalen Bereich mit der Bindestelle für die AP-3-Vesikel an die Oberfläche des Organells wodurch eine verfrühte Fusion der AP-3-Vesikel mit dem Endosom verhindert wird. Erst nach der Reifung zur Vakuole wird die PEST-Domäne für die Bindung an Apl5 verfügbar, da sich die Membrankrümmung ändert. Zusätzlich wird das ALPS-Motiv phosphoryliert, so dass dieses nicht mehr in die Membran eintauchen kann. Erst jetzt ist eine Interaktion zwischen Apl5 und Vps41 und damit eine Fusion der AP-3-Vesikel mit der Vakuole möglich. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Protonentranslokation durch den Fo-Teil der ATP-Synthase aus Escherichia coli. Durch Mutagenese wurden ATP-Synthasen hergestellt, in denen die beiden für den Protonentransport essentiellen Aminosäurereste D61 in der Untereinheit c und R210 in der Untereinheit a in der α-Helix in der sie liegen, entweder einzeln oder beide zusammen, um je eine Helixwindung nach oben oder unten verschoben wurden. Dies führt zu einer Verlängerung bzw. Verkürzung der Protonenzu- und austrittskanäle. Durch die Untersuchung der Funktionalität dieser ATPasen auf sowohl aktives und passives Protonenpumpen, als auch ATP-Synthese konnte ich zeigen, daß die Position der beiden essentiellen Aminosäurereste cD61 und aR210 zueinander nicht entscheidend ist. Werden beide Reste in die gleiche Richtung verschoben, so daß ihre Position zueinander gleich bleibt, kommt es unabhängig von der Richtung immer zu einem kompletten Funktionsverlust. Weiterhin läßt sich aus meinen Daten folgern, daß die Position des Restes aR210 in der Mitte der Membran wichtig ist. Beim Verschieben des Restes auf die Position 206 (a-up) geht die gesamte Funktion des Fo-Teiles verloren, während das Verschieben auf die Position 214 (a-down) zu einem passiven Ausströmen der Protonen durch den Fo-Teil führt. Die Position des Restes cD61 in der Membran ist flexibler. Obwohl die Repositionierung des Aspartats auf die Position 57 (c-up) jegliche Funktionalität des Fo-Teiles beeinträchtigt, ermöglicht ein Verschieben auf die Position 65 (c-down) aktives und passives Protonenpumpen, sowie die Synthese von ATP.