Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T14:15:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Consonni_SilvioRoberto_D.pdf: 7954683 bytes, checksum: 766ce32e5bbb5a5c0b8cc78fd2735dc0 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Há um crescente avanço no desenvolvimento das tecnologias que permitam a localização de proteínas em células por microscopias de luz e eletrônica combinadas, com o uso das sondas moleculares miniSOG e Apex2, por exemplo. Adicionalmente busca-se compreender como proteínas são responsáveis pelas funções celulares e teciduais. A Quinase de Adesão Focal (FAK), proteína da cascata de sinalização das integrinas é considerada uma mediadora em potencial do estresse mecânico nos cardiomiócitos. Sabe-se que em cardiomiócitos submetidos a estímulos hipertróficos, ocorre rápida ativação da FAK e sua redistribuição subcelular, contudo são pouco conhecidos os mecanismos envolvidos nesses processos. Outra proteína de grande importância no coração é a Calsarcina-1 (CS1), regulador negativo da via de Calcineurina, crucial no desenvolvimento da hipertrofia cardíaca. Entretanto os mecanismos envolvidos nessa regulação negativa, assim como a distribuição subcelular de CS1 são pouco conhecidos. Visando à interação entre essas áreas para estudo da distribuição espaço-temporal dos componentes celulares e de proteínas, bem como a importância da FAK e CS1 no sarcômero e seu papel na sinalização hipertrófica sob estímulo mecânico, o objetivo geral desse trabalho foi explorar a capacidade das proteínas FAK e CS1 para incorporar geneticamente sondas moleculares que permitissem monitorar por meio de imagens o comportamento dessas moléculas-chave na biologia do disco Z em MVRNs submetida ao estiramento mecânico. Para isso, foram realizados ensaios de localização subcelular com uso de sondas moleculares aplicadas à microscopia correlativa, bem como ensaios bioquímicos, moleculares e de atividade enzimática. Os dados confirmaram a FAK associada às fibras de actina e adesões focais em células H9c2 e foi demonstrado à microscopia de luz que FAK wild-type (wt) translocou-se parcialmente para o compartimento nuclear após estimulação do agonista fenilefrina, enquanto que FAK Y397F (forma mutante inativa) não apresentou mesmo fenótipo. Por outro lado, apesar da padronização e expressão das construções com FAK e miniSOG ou Apex2 em células HEK 293T e H9c2, não foi conclusiva a localização subcelular da FAK, por meio do uso de microscopia eletrônica em MVRN. Provavelmente devido à distribuição difusa da maior parte das moléculas de FAK, não foi identificada uma região elétron-densa conclusiva à microscopia eletrônica de transmissão. No tocante à importância da CS1, observou-se que o estiramento cíclico não induziu o aumento na expressão proteica ou gênica relativa de CS1 e CnA, assim como não houve alteração na atividade fosfatase de CnA. No entanto houve redução da interação de CS1 e CnA, bem como alteração na localização de CS1 em MVRN sob estímulo mecânico. Dados de superexpressão e silenciamento de CS1 corroboram a regulação negativa de CS1 à CnA em MVRN sob estímulo mecânico. Baseando-se em dados estruturais, especulou-se que como o sítio de ligação de NFAT e CS1 à CnA são muito próximos e ao mesmo tempo distante do sítio ativo da fosfatase, é possível que o papel de CS1 na regulação negativa de CnA ocorra por impedimento espacial ao fator de transcrição NFAT. Portanto, esses resultados podem contribuir para uma possível inferência farmacológica, visto que a via de Calcineurina-NFAT é uma das principais mediadoras de hipertrofia em cardiomiócitos, mediante estímulos patológicos / Abstract: There is an increasing move towards the development of technologies that allow the localization of proteins in cells by combined electron and light microscopy, with the use of molecular probes such as miniSOG and APEX2. Additionally we seek to understand how proteins are responsible for the cellular and tissue functions. The Focal Adhesion Kinase (FAK) is protein of integrin signaling cascade considered as a potential mediator of mechanical stress in cardiomyocytes. It is known that in cardiomyocytes subjected to hypertrophic stimuli by rapid activation of FAK and its subcellular redistribution, however the mechanisms involved in these processes are poorly understood. Another very important protein in the heart is Calsarcin-1 (CS1), a negative regulator of the Calcineurin pathway which is crucial in the development of cardiac hypertrophy. However the mechanisms involved in the negative regulation as well as the subcellular distribution CS1 are poorly understood. Aiming at the interaction between these areas to study the spatial-temporal distribution of cellular and protein components, and the importance of FAK and CS1 in the sarcomere and its role in hypertrophic signaling under mechanical stimulation, the aim of this study was to explore the ability of FAK and CS1 to incorporate genetically molecular probes that allow monitoring through images the behavior of these key molecules in the Z disc biology in MVRNs subjected to mechanical stretch. To this end, we performed subcellular localization assays using molecular probes applied to the correlative microscopy, biochemical and molecular assays and enzymatic activity. These data confirm the FAK associated with actin and focal adhesions fibers in H9c2 cells and has been shown by light microscopy that FAK wild-type (wt) is partially translocated to the nuclear compartment after stimulation of the agonist phenylephrine, while FAK Y397F (inactive mutant form) did not show the same phenotype. Moreover, despite standardization and expression of FAK and miniSOG or APEX2 in HEK 293T cells and H9c2, it was inconclusive subcellular localization of FAK, through the use of electron microscopy, in MVRN. Probably due to the diffuse distribution of most FAK molecules, it has no conclusive electron-dense region in transmission electron microscopy. Regarding the importance of CS1, it was observed that the cyclic stretch did not induce an increase in protein expression or gene relative CS1 and CnA, as there was no change in the phosphatase activity of CnA. However there was less interaction CS1 and CnA and change in CS1 location in MVRN under mechanical stimulation. CS1 overexpression and silencing corroborate the negative regulation of the CS1 over CnA in MVRN under mechanical stimulation. Based on structural data, it has been speculated that as the NFAT and CS1 binding sites are very close in CnA and at the same time distant from the active site of the phosphatase, it is possible that the role of CS1 in the negative regulation of CnA occur by steric hindrance to the NFAT transcription factor. Therefore, these results may contribute to a possible pharmacological inference, whereas Calcineurin-NFAT pathway is a major mediator of hypertrophy in cardiac myocytes by pathologic stimuli / Doutorado / Biologia Tecidual / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: William Dias Belangero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-28T23:43:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Faria_LidiaDornelasde_M.pdf: 3066212 bytes, checksum: 6cb5506682740e2fcb2de4b1694998a3 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A Terapia por ondas de choque (TOC) é uma alternativa não invasiva utilizada como método de indução a formação óssea que consiste em pulsos sonoros de alta energia transmitidas de modo focal a um tecido específico. Artigos demonstram aumento de vascularização, que ativação de proteínas como BMP (bone morphogenic protein) e Erk (extracellular signal-regulated kinase) induzindo diferenciação osteogênica após sua utilização no tecido ósseo. O presente estudo visou avaliar os níveis das proteínas Erk e Akt (akutely transforming), envolvidas na cascata protéica responsiva a deformação celular gerada por estímulo mecânico e consequente transformação em estímulo bioquímico induzindo a osteogênese. Os animais selecionados para o estudo foram anestesiados e divididos em dois diferentes grupos, onde no dia 1, o primeiro grupo foi submetido a TOC em sessão única de 500 impulsos gerados por aparelho eletrohidráulico a 0,12mJ/mm²na tíbia intacta e o segundo não recebeu TOC. Na sequência, os animais foram divididos em 3 subgrupos para cada tempo de segmento de 7, 14 e 21 dias A determinação dos níveis das proteínas propostas foi realizada por meio de immunoblotting. A fosforilação das proteínas Erk e Akt dos tecidos ósseos das tíbias extraídas dos ratos aumentou nos grupos submetidos a TOC após 7, 14 e se manteve elevado até o 21° dia quando comparado ao controle / Abstract: Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) is a non-invasive alternative used as a method for inducing bone formation that consists of high-energy acoustic pulses transmitted in a focal way to a specific tissue. Studies show increase in vascularization which activate proteins such as BMP and Erk inducing osteogenic differentiation after its use in the bone tissue. The present study aimed at evaluating the levels of Erk and AKT proteins involved in the protein cascade responsive to cell deformation in biochemical stimulus inducing osteogenesis. The animals selected for the study were under anesthesia and divided in two different groups where on day 1 the first group was submitted to ESWT in one 500 pulse-session generated by an electrohydraulic device at 0,12mJ/mm² in intact tibia and fibula and the second did not receive ESWT. Then the animals were divided into 3 sub-groups, one for each segment times of 7, 14 and 21 days. Immunoblotting analysis was performed to determine the levels of the proposed proteins. The Erk and Akt protein phosphorylation of the bone tissues of extracted tibia from the animals increased in the groups submitted to ESWT and kept elevated until the 21st day when compared to the control group / Mestrado / Fisiopatologia Cirúrgica / Mestra em Ciências

Topographical and mechanical properties of adhesive substrates provide important biological cues that affect cell spreading, migration, growth, and differentiation. The phenomenon has led to the increased use of topographically patterned and flexible substrates in studying cultured cells. However, these studies may be complicated by various limitations. For example, the effects of ligand distribution and porosity are affected by topographical features of 3D biological constructs. Similarly, many studies of mechanical cues are compounded with cellular deformation from external forces, or limited by comparative studies of separate cells on different substrates. Furthermore, understanding cell responses to mechanical input is dependent upon reliable measurements of mechanical properties. This work addresses each of these issues. To determine how substrate topography and focal adhesion kinase (FAK) affect cell shape and movement, I studied FAK-null (FAK -/-) and wild type mouse 3T3 fibroblasts on chemically identical polystyrene substrates with either flat surfaces or micron-sized pillars, I found that, compared to cells on flat surfaces, those on pillar substrates showed a more branched shape, an increased linear speed, and a decreased directional stability, which were dependent on both myosin-II and FAK. To study the dynamic responses to changes in substrate stiffness without other confounding effects, I developed a UV-modulatable substrate that softens upon UV irradiation. As atomic force microscopy (AFM) proved inadequate to detect microscale changes in stiffness, I first developed and validated a microsphere indentation method that is compatible with fluorescence microscopy. The results obtained with this method were comparable to those obtained with AFM. The UV-modulatable substrates softened by ~20-30% with an intensity of irradiation that has no detectable effect on 3T3 cells on control surfaces. Cells responded to global softening of the substrate with an initial retraction followed by a gradual reduction in spread area. Precise spatial control of softening is also possible - while there was little response to posterior softening, anterior softening elicited a pronounced retraction and either a reversal of cell polarity or a significant decrease in spread area if the cells move into the softened region. In conclusion, these techniques provide advances in gaining mechanistic insight into cellular responses to topographical and mechanical cues. Additionally, there are various other potential applications of the novel UV-softening substrate, particularly in regenerative medicine and tissue engineering.