Orientador: George G. Kleiman / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Fisica Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-07-14T22:09:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fracastoro-Decker_Maristella_D.pdf: 2427958 bytes, checksum: 16a19bd1104f9d801fc28cd998619bc5 (MD5) Previous issue date: 1980 / Resumo: Neste trabalho é estudado sistematicamente o modelo de Kleiman para o potencial criado por uma impureza isoeletrônica numa liga III-V. Este modelo atribui ao potencial de impureza uma componente de curto alcance e uma de longo alcance (20-25 Þ ), ambas atrativas. A presença desta última componente está em contraste com as interpretações tradicionais da física deste tipo de impurezas e obriga a uma revisão da origem deste potencial de alcance mais extenso, anteriormente atribuído à relaxação da rede. O modelo é aplicado ao caso de Ga(As,P):N, estudado em detalhe e comparado com a experiência. O acordo entre os resultados obtidos e os dados é muito bom / Abstract: In this work we present a systematic study of the Kleiman model for an isoelectronic impurity potential in a III-V alloy. The model attributes a short-range plus a long-range component to the impurity potential. The presence of this long-range part, which extends on a region of 20-25 Þ , is in contrast with traditional interpretations of the physics of this kind of impurity and forces to a revision of the origin of this more extended component of the potential, previously attributed to lattice relaxation around the impurity. The model was studied in detail, applied to Ga(As,P):N and compared to the data. The results of these calculations are in very good agreement with experience / Doutorado / Física / Doutor em Ciências

Neste trabalho foi desenvolvida pela primeira vez uma estratégia de purificação com duas etapas, uma cromatografia de troca iônica e uma cromatografia líquida de alta eficiência em fase-reversa (RP-HPLC), para obter um hTSH derivado de CHO (r-hTSH-IPEN), que mostrou-se rápida e prática, permitindo um rendimento de 70% e uma pureza > 99%. Um aumento de ~60% na produtividade de r-hTSH-IPEN foi observado quando condições de cultura celular foram alteradas de 5% de CO2 para ar (0,03% CO2). A qualidade dos produtos obtidos em ambas as condições foi avaliada com relação à estrutura dos N-glicanos, aos isômeros de carga e à atividade biológica em comparação com a única preparação comercial conhecida (Thyrogen®) e com uma preparação de referência de origem hipofisária (p-hTSH) do National Hormone and Pituitary Program (NIDDK, EUA). Os N-glicanos identificados nas preparações recombinantes foram do tipo complexo, apresentando estruturas bi-, tri- e tetra- antenárias, algumas fucosiladas, sendo 86-88% sialiladas com níveis variáveis. As três estruturas mais abundantes foram monosialiladas, representando ~69% de todas as formas identificadas nas três preparações. A principal diferença foi encontrada em termos de antenaridade, com 8-10% mais estruturas bi-antenárias na ausência de CO2 e 7-9% mais estruturas tri-antenárias na presença de CO2. No caso do p-hTSH foram identificadas estruturas do tipo complexo, com alta-manose e híbridas, a maioria delas contendo resíduos terminais de ácido siálico e/ou sulfato. As duas estruturas mais abundantes contem um ou dois resíduos de sulfato, sendo que no primeiro caso ele inesperadamente se liga a uma galactose. A porcentagem de ligação do ácido siálico à galactose nas conformações 2-3 e 2-6 foi de 68 ± 10% e 32 ± 10% respectivamente. Não foram observadas diferenças fundamentais nos isômeros de carga, nas três preparações recombinantes, os perfis da focalização isoelétrica mostrando seis bandas distintas no intervalo de pI de 5,39 a 7,35. Uma distribuição consideravelmente diferente, com várias formas na região ácida, foi observada, no entanto, para duas preparações hipofisárias. Uma bioatividade ligeiramente superior (p <0,02) foi encontrada para o r-hTSH-IPEN obtido na presença de CO2 quando as preparações foram analisadas com boa precisão por um simples bioensaio em dose única; esta atividade, no entanto, não é significativamente diferente da atividade do Thyrogen, as duas preparações sendo 1,6 e 1,8 vezes mais potentes do que a preparação de referência (p-hTSH). Podemos concluir que, pelo menos para o caso dos r-hTSH derivados de CHO, diferentes condições de cultivo não afetam significativamente as estruturas dos N-glicanos, distribuição de isómeros de carga ou atividade biológica. Thyrogen e r-hTSH-IPEN, quando comparados com p-hTSH-NIDDK, apresentaram cerca de 7% de aumento da massa molecular determinada por MALDI-TOF-MS. Esta técnica, que permite uma avaliação exata da massa do heterodímero, apresentou valores de MR de 29611, 29839 e 27829, respectivamente. Diferenças significativas foram encontradas entre o r-hTSH e o p-hTSH pelo que se refere às propriedades hidrofóbicas, avaliadas por RP-HPLC. Também foram observadas diferenças relacionadas à composição de carboidratos, principalmente de ácido siálico e galactose, tendo sido encontrado um menor teor destes resíduos no p-hTSH. / A novel, fast and practical two-step purification strategy, consisting of a classical ion exchange and a reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC), for rapidly obtaining CHO-derived hTSH, was set up providing r-hTSH with 70% yield and > 99% purity. A consistent increase of ~60% in the secretion yields of r-hTSH-IPEN was observed by changing cell culture CO2 conditions from 5% CO2 to air environment (0.03% CO2). The overall quality of the products obtained under both conditions was evaluated for what concerns N-glycan structure, charge isomers and biological activity in comparison with a well known recombinant biopharmaceutical (Thyrogen®) and with a pituitary reference preparation (p-hTSH) from National Hormone and Pituitary Program (NIDDK, USA). The N-glycans identified in the recombinant preparations were of the complex type, presenting bi-, tri- and tetra-antennary structures, sometimes fucosylated, 86-88% of the identified structures being sialylated at variable levels. The three most abundant structures were monosialylated glycans, representing ~69% of all identified forms in the three preparations. The main difference was found in terms of antennarity, with 8-10% more bi-antennary structures obtained in the absence of CO2 and 7-9% more tri-antennary structures in its presence. In the case of p-hTSH, complex, high-mannose and hybrid N-glycan structures were identified, most of them containing sialic acid and/or sulphate terminal residues. The two most abundant structures were shown to contain one or two sulphate residues, one of which unexpectedly bound to galactose. The sialic acid-galactose linkage was also determined, having found that 68 ± 10% was in the 2,6 and 32 ± 10% in the 2,3 conformation. No remarkable difference in charge isomers was observed between the three recombinant preparations, the isoelectric focusing profiles showing six distinct bands in the 5.39 - 7.35 pI range. A considerably different distribution, with more forms in the acidic region, was observed, however, for two native pituitary preparations. When analyzed via a simple and precise single-dose bioassay, a slightly higher bioactivity (p<0.02) was found for r-hTSH-IPEN obtained in the presence of CO2. This potency however, was not significantly different from that of Thyrogen, the two preparations being 1.6-1.8-fold more potent than the reference preparation of p-hTSH. We can conclude that, at least for the case of CHO-derived r-hTSH, different production processes do not greatly affect its N-glycan structures, charge isomer distribution or biological activity. Thyrogen and r-hTSH-IPEN, when compared to p-hTSH-NIDDK, presented about a 7% increased relative molecular mass (MR) determined by MALDI-TOF-MS analysis. This technique, allowing accurate heterodimer mass determinations, provided MR values of 29611, 29839 and 27829, respectively. Significant differences in hydrophobic properties, evaluated by RP-HPLC, were found for r-hTSH and p-hTSH. Also differences related to carbohydrate moiety, mainly in the amount of sialic acid and galactose, were found for these preparations, a much lower content of these sugar residues being observed in p-hTSH

Neste trabalho foi desenvolvida pela primeira vez uma estratégia de purificação com duas etapas, uma cromatografia de troca iônica e uma cromatografia líquida de alta eficiência em fase-reversa (RP-HPLC), para obter um hTSH derivado de CHO (r-hTSH-IPEN), que mostrou-se rápida e prática, permitindo um rendimento de 70% e uma pureza > 99%. Um aumento de ~60% na produtividade de r-hTSH-IPEN foi observado quando condições de cultura celular foram alteradas de 5% de CO2 para ar (0,03% CO2). A qualidade dos produtos obtidos em ambas as condições foi avaliada com relação à estrutura dos N-glicanos, aos isômeros de carga e à atividade biológica em comparação com a única preparação comercial conhecida (Thyrogen®) e com uma preparação de referência de origem hipofisária (p-hTSH) do National Hormone and Pituitary Program (NIDDK, EUA). Os N-glicanos identificados nas preparações recombinantes foram do tipo complexo, apresentando estruturas bi-, tri- e tetra- antenárias, algumas fucosiladas, sendo 86-88% sialiladas com níveis variáveis. As três estruturas mais abundantes foram monosialiladas, representando ~69% de todas as formas identificadas nas três preparações. A principal diferença foi encontrada em termos de antenaridade, com 8-10% mais estruturas bi-antenárias na ausência de CO2 e 7-9% mais estruturas tri-antenárias na presença de CO2. No caso do p-hTSH foram identificadas estruturas do tipo complexo, com alta-manose e híbridas, a maioria delas contendo resíduos terminais de ácido siálico e/ou sulfato. As duas estruturas mais abundantes contem um ou dois resíduos de sulfato, sendo que no primeiro caso ele inesperadamente se liga a uma galactose. A porcentagem de ligação do ácido siálico à galactose nas conformações 2-3 e 2-6 foi de 68 ± 10% e 32 ± 10% respectivamente. Não foram observadas diferenças fundamentais nos isômeros de carga, nas três preparações recombinantes, os perfis da focalização isoelétrica mostrando seis bandas distintas no intervalo de pI de 5,39 a 7,35. Uma distribuição consideravelmente diferente, com várias formas na região ácida, foi observada, no entanto, para duas preparações hipofisárias. Uma bioatividade ligeiramente superior (p <0,02) foi encontrada para o r-hTSH-IPEN obtido na presença de CO2 quando as preparações foram analisadas com boa precisão por um simples bioensaio em dose única; esta atividade, no entanto, não é significativamente diferente da atividade do Thyrogen, as duas preparações sendo 1,6 e 1,8 vezes mais potentes do que a preparação de referência (p-hTSH). Podemos concluir que, pelo menos para o caso dos r-hTSH derivados de CHO, diferentes condições de cultivo não afetam significativamente as estruturas dos N-glicanos, distribuição de isómeros de carga ou atividade biológica. Thyrogen e r-hTSH-IPEN, quando comparados com p-hTSH-NIDDK, apresentaram cerca de 7% de aumento da massa molecular determinada por MALDI-TOF-MS. Esta técnica, que permite uma avaliação exata da massa do heterodímero, apresentou valores de MR de 29611, 29839 e 27829, respectivamente. Diferenças significativas foram encontradas entre o r-hTSH e o p-hTSH pelo que se refere às propriedades hidrofóbicas, avaliadas por RP-HPLC. Também foram observadas diferenças relacionadas à composição de carboidratos, principalmente de ácido siálico e galactose, tendo sido encontrado um menor teor destes resíduos no p-hTSH. / A novel, fast and practical two-step purification strategy, consisting of a classical ion exchange and a reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC), for rapidly obtaining CHO-derived hTSH, was set up providing r-hTSH with 70% yield and > 99% purity. A consistent increase of ~60% in the secretion yields of r-hTSH-IPEN was observed by changing cell culture CO2 conditions from 5% CO2 to air environment (0.03% CO2). The overall quality of the products obtained under both conditions was evaluated for what concerns N-glycan structure, charge isomers and biological activity in comparison with a well known recombinant biopharmaceutical (Thyrogen®) and with a pituitary reference preparation (p-hTSH) from National Hormone and Pituitary Program (NIDDK, USA). The N-glycans identified in the recombinant preparations were of the complex type, presenting bi-, tri- and tetra-antennary structures, sometimes fucosylated, 86-88% of the identified structures being sialylated at variable levels. The three most abundant structures were monosialylated glycans, representing ~69% of all identified forms in the three preparations. The main difference was found in terms of antennarity, with 8-10% more bi-antennary structures obtained in the absence of CO2 and 7-9% more tri-antennary structures in its presence. In the case of p-hTSH, complex, high-mannose and hybrid N-glycan structures were identified, most of them containing sialic acid and/or sulphate terminal residues. The two most abundant structures were shown to contain one or two sulphate residues, one of which unexpectedly bound to galactose. The sialic acid-galactose linkage was also determined, having found that 68 ± 10% was in the 2,6 and 32 ± 10% in the 2,3 conformation. No remarkable difference in charge isomers was observed between the three recombinant preparations, the isoelectric focusing profiles showing six distinct bands in the 5.39 - 7.35 pI range. A considerably different distribution, with more forms in the acidic region, was observed, however, for two native pituitary preparations. When analyzed via a simple and precise single-dose bioassay, a slightly higher bioactivity (p<0.02) was found for r-hTSH-IPEN obtained in the presence of CO2. This potency however, was not significantly different from that of Thyrogen, the two preparations being 1.6-1.8-fold more potent than the reference preparation of p-hTSH. We can conclude that, at least for the case of CHO-derived r-hTSH, different production processes do not greatly affect its N-glycan structures, charge isomer distribution or biological activity. Thyrogen and r-hTSH-IPEN, when compared to p-hTSH-NIDDK, presented about a 7% increased relative molecular mass (MR) determined by MALDI-TOF-MS analysis. This technique, allowing accurate heterodimer mass determinations, provided MR values of 29611, 29839 and 27829, respectively. Significant differences in hydrophobic properties, evaluated by RP-HPLC, were found for r-hTSH and p-hTSH. Also differences related to carbohydrate moiety, mainly in the amount of sialic acid and galactose, were found for these preparations, a much lower content of these sugar residues being observed in p-hTSH

Neste trabalho é descrito um método prático e eficiente para dissociar, em subunidades &alpha; e &beta;, quantidades pequenas (da ordem de microgramas) dos hormônios foliculotrofina (hFSH), luteotrofina (hLH) e tireotrofina (hTSH) humana, nativos e recombinantes. A dissociação destes hormônios foi conseguida incubando-os, durante 16 horas, a 37ºC, com diferentes concentrações de ácido acético: 3M, 5M e 0,4M respectivamente para o hFSH, hLH e hTSH. Nestas condições, uma eficiência de dissociação acima de 98% foi obtida. Esta eficiência foi calculada com base nas determinações de massa dos heterodímeros e das subunidades, realizadas por MALDI-TOF-MS. Uma separação rápida e quantitativa das subunidades, com rendimentos da ordem de 80-90%, foi conseguida por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC) em uma coluna C4. As subunidades foram caracterizadas quanto à pureza, hidrofobicidade, massa molecular e distribuição de carga por HPLC de exclusão molecular e fase reversa, SDS-PAGE e focalização isoelétrica. Quando analisadas quanto à hidrofobicidade, as subunidades mostraram-se aproximadamente iguais, enquanto as subunidades &beta; dos três heterodímeros apresentaram a seguinte escala de hidrofobicidade: &beta;-hFSH < &beta;-hTSH < &beta;-hLH. Com relação à massa molecular relativa (Mr), as subunidades &alpha; e &beta; do hFSH apresentaram as maiores Mr enquanto as subunidades do hLH as menores. A distribuição dos isômeros de carga das subunidades dos três hormônios ocorreu em uma região ácida, para o hFSH, em uma região básica, para o hLH e em uma região intermediária, para o hTSH. As subunidades &alpha; dos três hormônios, quando analisadas via SDS-PAGE, apresentaram praticamente a mesma mobilidade eletroforética, enquanto as subunidades &beta; apresentaram diferentes taxas de migração (mR), sendo mR &beta;-hFSH < mR &beta;-hTSH < mR &beta;-hLH. Diferenças relativas à massa molecular, hidrofobicidade, migração eletroforética e distribuição de carga foram encontradas entre as preparações recombinantes e hipofisárias dos três hormônios. O método descrito é suave, prático e flexível e pode ser adaptado à dissociação de outras glicoproteínas heterodiméricas recombinantes ou nativas. Permite não só estudos e caracterização direta de cada subunidade, como também detectar a presença de subunidades livres em preparações farmacêuticas, que são contaminantes indesejáveis, sendo, portanto, uma ferramenta extremamente útil para o controle de qualidade de produtos farmacêuticos. / In this work a practical and efficient method for the dissociation into &alpha;-and &beta;-subunits of small amounts (microgram range) of pituitaryderived and recombinant human follicle-stimulating hormone (hFSH), human luteotropin (hLH) and human thyrotropin (hTSH) is described. Dissociation was achieved by overnight treatment of the glycoproteins, at 37ºC, with acetic acid in different concentrations: 3M, 5M and 0,4M for hFSH, hLH and hTSH respectively. In these conditions, a dissociation efficiency of > 98% was attained. This efficiency was calculated on the basis of relative mass determinations of the heterodimers and subunits carried out via mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). The &alpha;-and &beta;-subunits were rapidly and quantitatively separated by reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) on a C4 column with yields of the order of 80-90%. The isolated subunits were characterized concerning their purity, hidrophobicity, molecular mass and charge distribution, via size exclusion and RP-HPLC, SDS-PAGE and isoelectric focusing. When analyzed with relation to the hydrophobicity, the &alpha;-subunits presented approximately the same hydrophobicity, while &beta;-subunits showed the following scale: &beta-hFSH < &beta;-hTSH < &beta;-hLH. Concerning molecular mass, &alpha;- and &beta;-subunits of hFSH were shown to have the highest while hLH subunits the lowest. Charge isomers of the subunits of the three glycohormones were predominantly distributed in an acidic region for hFSH, in a basic region for hLH, and in a wider pH range (acidic and basic) for hTSH. Similar migration rates (mR), analyzed via SDS-PAGE, were observed for the &alpha;-subunits of the three hormones. A greater variation was found for the &beta;-subunits: mR &beta;-hFSH < mR &beta;-hTSH < mR &beta;-hLH. Differences between recombinant and pituitary preparations of three hormones were observed with relation to molecular mass, hydrophobicity, electrophoretic migration and charge distribution. The described method is mild, practical and flexible and can be adapted to dissociate any recombinant or native heterodimeric glycoprotein, allowing studies and direct characterization of each subunit as well as the detection of free subunits that are undesired contaminants in pharmaceutical preparations, being also an extremely useful tool for the quality control of pharmaceutical products.

Neste trabalho é descrito um método prático e eficiente para dissociar, em subunidades &alpha; e &beta;, quantidades pequenas (da ordem de microgramas) dos hormônios foliculotrofina (hFSH), luteotrofina (hLH) e tireotrofina (hTSH) humana, nativos e recombinantes. A dissociação destes hormônios foi conseguida incubando-os, durante 16 horas, a 37ºC, com diferentes concentrações de ácido acético: 3M, 5M e 0,4M respectivamente para o hFSH, hLH e hTSH. Nestas condições, uma eficiência de dissociação acima de 98% foi obtida. Esta eficiência foi calculada com base nas determinações de massa dos heterodímeros e das subunidades, realizadas por MALDI-TOF-MS. Uma separação rápida e quantitativa das subunidades, com rendimentos da ordem de 80-90%, foi conseguida por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC) em uma coluna C4. As subunidades foram caracterizadas quanto à pureza, hidrofobicidade, massa molecular e distribuição de carga por HPLC de exclusão molecular e fase reversa, SDS-PAGE e focalização isoelétrica. Quando analisadas quanto à hidrofobicidade, as subunidades mostraram-se aproximadamente iguais, enquanto as subunidades &beta; dos três heterodímeros apresentaram a seguinte escala de hidrofobicidade: &beta;-hFSH < &beta;-hTSH < &beta;-hLH. Com relação à massa molecular relativa (Mr), as subunidades &alpha; e &beta; do hFSH apresentaram as maiores Mr enquanto as subunidades do hLH as menores. A distribuição dos isômeros de carga das subunidades dos três hormônios ocorreu em uma região ácida, para o hFSH, em uma região básica, para o hLH e em uma região intermediária, para o hTSH. As subunidades &alpha; dos três hormônios, quando analisadas via SDS-PAGE, apresentaram praticamente a mesma mobilidade eletroforética, enquanto as subunidades &beta; apresentaram diferentes taxas de migração (mR), sendo mR &beta;-hFSH < mR &beta;-hTSH < mR &beta;-hLH. Diferenças relativas à massa molecular, hidrofobicidade, migração eletroforética e distribuição de carga foram encontradas entre as preparações recombinantes e hipofisárias dos três hormônios. O método descrito é suave, prático e flexível e pode ser adaptado à dissociação de outras glicoproteínas heterodiméricas recombinantes ou nativas. Permite não só estudos e caracterização direta de cada subunidade, como também detectar a presença de subunidades livres em preparações farmacêuticas, que são contaminantes indesejáveis, sendo, portanto, uma ferramenta extremamente útil para o controle de qualidade de produtos farmacêuticos. / In this work a practical and efficient method for the dissociation into &alpha;-and &beta;-subunits of small amounts (microgram range) of pituitaryderived and recombinant human follicle-stimulating hormone (hFSH), human luteotropin (hLH) and human thyrotropin (hTSH) is described. Dissociation was achieved by overnight treatment of the glycoproteins, at 37ºC, with acetic acid in different concentrations: 3M, 5M and 0,4M for hFSH, hLH and hTSH respectively. In these conditions, a dissociation efficiency of > 98% was attained. This efficiency was calculated on the basis of relative mass determinations of the heterodimers and subunits carried out via mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). The &alpha;-and &beta;-subunits were rapidly and quantitatively separated by reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) on a C4 column with yields of the order of 80-90%. The isolated subunits were characterized concerning their purity, hidrophobicity, molecular mass and charge distribution, via size exclusion and RP-HPLC, SDS-PAGE and isoelectric focusing. When analyzed with relation to the hydrophobicity, the &alpha;-subunits presented approximately the same hydrophobicity, while &beta;-subunits showed the following scale: &beta-hFSH < &beta;-hTSH < &beta;-hLH. Concerning molecular mass, &alpha;- and &beta;-subunits of hFSH were shown to have the highest while hLH subunits the lowest. Charge isomers of the subunits of the three glycohormones were predominantly distributed in an acidic region for hFSH, in a basic region for hLH, and in a wider pH range (acidic and basic) for hTSH. Similar migration rates (mR), analyzed via SDS-PAGE, were observed for the &alpha;-subunits of the three hormones. A greater variation was found for the &beta;-subunits: mR &beta;-hFSH < mR &beta;-hTSH < mR &beta;-hLH. Differences between recombinant and pituitary preparations of three hormones were observed with relation to molecular mass, hydrophobicity, electrophoretic migration and charge distribution. The described method is mild, practical and flexible and can be adapted to dissociate any recombinant or native heterodimeric glycoprotein, allowing studies and direct characterization of each subunit as well as the detection of free subunits that are undesired contaminants in pharmaceutical preparations, being also an extremely useful tool for the quality control of pharmaceutical products.