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Mécanismes par lesquels la recombinaison homologue prévient les défauts mitotiques induits par le stress réplicatif / Mechanisms by which homologous recombination prevents mitotic defects in response to replication stress

Ait Saada, Anissia 26 June 2018 (has links)
Des stress réplicatifs sont rencontrés à chaque phase S du cycle cellulaire et différents mécanismes permettent leur prise en charge. La recombinaison homologue (RH) tient un rôle important dans le maintien de la stabilité du génome au cours de la réplication. En effet, la RH escorte la progression des fourches et prévient les défauts mitotiques. Toutefois, le lien moléculaire entre le stress réplicatif et les défauts mitotiques n’est pas élucidé. De façon générale, les fourches de réplication bloquées peuvent être sauvées grâce à leur fusion avec la fourche convergente ou au redémarrage de fourche par la RH. Le laboratoire a développé un essai génétique reposant sur l’utilisation d’une barrière de réplication conditionnelle afin d’étudier le mécanisme par lequel la RH contribue au sauvetage des fourches de réplication bloquées. L’équipe a montré que le redémarrage des fourches bloquées par la RH est conditionné par l’exposition d’un ADNsb et non d’une cassure double-brin. Ainsi, les fonctions de la RH au cours de la gestion du stress réplicatif peuvent être adressées indépendamment de sa fonction de réparation des cassures (fonction relativement bien documentée). Les travaux décrits dans ce manuscrit s’inscrivent autour des mécanismes que la RH engage afin d’assurer la stabilité génétique en réponse au stress réplicatif. Plus précisément, je me suis intéressée à l’implication des facteurs de la RH dans la protection des fourches de réplication bloquées au niveau moléculaire et cellulaire. En absence de la recombinase Rad51 ou de son chargeur Rad52, le blocage d’une seule fourche de réplication est suffisant pour induire des défauts mitotiques, incluant des ponts anaphasiques (lien physique entre chromatides sœurs). Il s’avère que les fourches bloquées sont extensivement dégradées par la nucléase Exo1 en absence de Rad51/Rad52. De manière intéressante, l’accumulation excessive d’ADNsb à la fourche est à l’origine de la non-disjonction des chromatides sœurs en mitose et ce malgré l’arrivée de fourches convergente. Ainsi, les fourches de réplication non protégées sont le siège de terminaison pathologique mettant à mal la ségrégation des chromosomes. La RH étant impliquée dans la protection et le redémarrage des fourches de réplication, l’utilisation du mutant de séparation de fonction Rad51-3A a permis de montrer que ces deux fonctions sont génétiquement séparables. Les fourches de réplication protégées et incapables d’être redémarrées par la RH ne présentent pas de symptômes de terminaison pathologique. Ainsi, au-delà de sa capacité à redémarrer les fourches inactivées, les facteurs de la RH assurent la complétion de de la réplication en maintenant les fourches de réplication dans une conformation propice à une fusion avec la fourche convergente. Ces résultats contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires invoqués par la RH afin de maintenir la stabilité génétique au cours du stress réplicatif. / At each cell cycle, cells undertaking the DNA replication process face several sources of replication stress (RS) compromising the progression of the replicating forks and threatening both chromosome duplication fidelity and their correct segregation during mitosis. Replication stresses emerged as a major source of genetic instability and cancer development. Several mechanisms, among which homologous recombination (HR), operate to buffer the deleterious effects of RS. HR acts as an escort to fork progression and prevents mitotic defects. Nonetheless, the molecular connection between replication stress and mitotic defects remains elusive. A conditional replication fork barrier (RFB) acting in a polar manner was developed in the lab to terminally-arrest fork progression. In this system, HR functions handling replication stress can be assessed independently of its well-known function in double strand break repair. The work described here aims to understanding the mechanism that HR performs to ensure genetic stability in response to replication stress. In general, blocked replication forks can be rescued either by fork convergence or by active HR-mediated fork restart. However, in absence of Rad51 recombinase or it loader Rad52, a single activated RFB is sufficient to induce mitotic abnormalities including anaphase bridges. The involvement of HR factors in fork protection was explored at the molecular and cellular levels. It turns out that terminally-arrested forks are extensively resected by the Exo1 nuclease in the absence of Rad51/Rad52. Interestingly, the excess of ssDNA accumulation at the fork triggers sister chromatid non-disjunction in mitosis despite the arrival of an uncorrupted converging fork to rescue replication. Thus, unprotected replication forks are prone to pathological termination threatening chromosome segregation. HR being involved in fork protection and restart, the use of a Rad51 mutant showed that these two functions are genetically separable. Indeed, protected forks unable to restart by HR do not show any pathological termination. Thus, beyond their ability to restart inactivated forks, HR factors ensure replication completion by maintaining the forks in a suitable conformation for a fusion with the converging fork. Overall, these results shed light on the molecular events engaged by RH to ensure genome stability in response to replication stress.
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A Study of Single-stranded DNA Gaps in the Response to Replication Stress and Synthetic Lethality

Cong, Ke 03 January 2022 (has links)
Mutations in the hereditary breast/ovarian cancer genes BRCA1/2 were shown to be synthetic lethal with poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors (PARPi). This toxicity is assumed to derive from PARPi-induced DNA double strand breaks (DSBs) that necessitate BRCA function in homologous recombination (HR) and/or fork protection (FP). However, PARPi accelerates replication forks. While high-speed replication could cause DSBs, the finding that PARPi leads to single-stranded DNA (ssDNA) gaps/nicks suggests replication gaps could also or alone be the cause of synthetic lethality. Here, we demonstrate that PARPi toxicity derives from replication gaps. Isogenic cells deficient in BRCA1 or the BRCA1-associated FANCJ, with common DNA repair defects in HR and FP, exhibit opposite responses to PARPi. Deficiency in FANCJ, a helicase also mutated in hereditary breast/ovarian cancer and Fanconi anemia, causes aberrant accumulation of fork remodeling factor HLTF and limits unrestrained DNA synthesis with ssDNA gaps. Thus, we predict replication gaps as a distinguishing factor and further uncouple HR, FP and fork speed from PARPi response. BRCA-deficient cells display excessive gaps that are diminished upon resistance, restored upon re-sensitization and when targeted augment synthetic lethality with PARPi. Furthermore, we define the source of gaps to defects in Okazaki fragment processing (OFP). Unchallenged BRCA1-deficient cells have elevated poly(ADP-ribose) and chromatin-associated PARP1 but aberrantly low XRCC1 indicating a defective backup OFP pathway. Remarkably, 53BP1 loss resuscitates OFP by restoring XRCC1-LIG3 that suppresses the sensitivity of BRCA1-deficient cells to drugs targeting OFP or generating gaps. Collectively, our study highlights unprotected lagging strand gaps as a determinant of synthetic lethality, providing a new paradigm and biomarker for PARPi toxicity.

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