In an effort to achieve replicative immortality, human cancer cells must avoid the constant telomere attrition that accompanies DNA replication. Cancer cells accomplish this by employing mechanisms to lengthen their telomeres. Approximately 10 percent of all cancers utilize the Alternative Lengthening of Telomeres (ALT) pathway to maintain telomere length. Although ALT is known to rely on homologous recombination between two telomeric sequences, the exact mechanism and regulators of the ALT pathway remain elusive. As common fragile sites, telomeres pose a challenge to the replication machinery. This replication challenge is exacerbated in ALT cells due to defects in nucleosome assembly, suggesting the importance of managing replication stress at telomeres in these cells. ATR (ataxia telangiectasia and Rad3-related) is an important kinase in the response to replication stress. The work in this thesis demonstrates that ATR is also a key mediator of ALT activity. Due to the highly recombinogenic state of ALT telomeres, these cells depend on ATR activity. In fact, we illustrate that small molecule inhibition and siRNA mediated loss of ATR disrupts ALT activity and promotes cell death specifically in ALT positive cancer cells. Although we establish ATR as a critical regulator and effective therapeutic target in ALT cancers, the exact mechanism of ATR in this pathway remains elusive. Recently, the chromatin remodeling enzyme SMARCAL1 (SWI/SNF-related, matrix-associated, actin-dependent regulator of chromatin subfamily A-like protein 1) was identified as one of the most abundant proteins bound to sites of replication stress. We demonstrate by combined immunofluorescence-FISH and chromatin immunoprecipitation that SMARCAL1 associates with ALT telomeres to resolve replication stress and maintain telomere stability. Specifically, we illustrate that siRNA mediated loss of SMARCAL1 in ALT cancer cells results in persistently stalled replication forks that collapse into DNA double strand breaks, which promotes the formation of chromosome fusions. Ultimately, we illustrate that loss of SMARCAL1 in ALT cancer cells promotes genomic instability through telomere dysfunction. Although great strides have been made in defining the ALT mechanism, the drivers of this pathway remain elusive. These studies highlight the importance of replication stress in both activation and maintenance of the ALT pathway. Our data demonstrate chronic replication stress as a key feature at ALT telomeres. Importantly, we were able to exploit this feature to identify a novel therapeutic avenue for ALT positive cancers.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第21646号 / 医博第4452号 / 新制||医||1034(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 武田 俊一, 教授 萩原 正敏, 教授 滝田 順子 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

La kinase dépendante des cyclines 5 (Cdk5) est un facteur de sensibilité aux inhibiteurs de PARP et aux rayonnements ionisants (RI), elle est nécessaire pour le point de contrôle du cycle cellulaire en phase S. Cependant, elle n’est pas directement impliquée dans la réparation des cassures de brin d’ADN, suggérant un rôle dans les étapes plus précoces de la signalisation des dommages. Nous rapportons ici que des cellules HeLa déplétées pour Cdk5 (Cdk5 KD) montrent une grande sensibilité aux RI surtout lorsqu'elles sont irradiées en phase S, au 5-Fluoro-Uracile, à la 6-Thioguanine et à une exposition chronique à l'hydroxyurée (HU). Les cellules Cdk5 KD montrent une altération de la dynamique de la phase S causée par une vitesse de réplication plus lente et une réduction des origines actives par mégabase d'ADN. En revanche, après un traitement au HU, ces cellules sortent plus rapidement du blocage en phase S. Ceci s’accompagne d’une déficience de la phosphorylation de RPA-32 sur les sérines 29 et 33 et de SMC1 sur la sérine 966 ainsi que d’une réduction du niveau de dommages de l'ADN évalués par le test des comètes alcalines, de l’intensité du signal gamma-H2AX, des foyers RPA, Rad51 et RPA sur les sérines 4 et 8 ainsi que du niveau d'échanges de chromatides sœurs. Des essais kinase in vitro couplés à la spectrométrie de masse ont montré que Cdk5 peut phosphoryler RPA-32 sur ses sérines 23, 29, et 33. De plus, des niveaux inférieurs d’expression de Cdk5 ont été associés à une meilleure survie sans métastases chez des patientes atteintes d’un cancer du sein et à une réduction de la survie des cellules de tumeurs du sein déplétées pour Cdk5 après un traitement aux RI et en présence d’un inhibiteur de PARP. Globalement, ces résultats montrent que Cdk5 est nécessaire pour la réplication basale et l'activation du point de contrôle en phase S en réponse à un stress réplicatif, ouvrant des perspectives cliniques intéressantes pour améliorer la destruction des cellules tumorales dans certaines populations de patientes atteintes de cancer du sein grâce à des agents qui génèrent un stress réplicatif. / Cyclin dependent kinase 5 (Cdk5) is a determinant of sensitivity to PARP inhibitors and ionizing radiation (IR) and is required for the intra-S DNA damage checkpoint. It is not however directly implicated in strand break repair suggesting a role in the earlier steps of checkpoint activation. We report here that Cdk5-Depleted (Cdk5-KD) HeLa cells show higher sensitivity to IR when irradiated in S-Phase, and to chronic hydroxyurea (HU) exposure, 5-Fluorouracil and 6-Thioguanine. Cdk5-KD cells show altered basal S-Phase dynamics caused by a slower replication velocity and fewer active origins per megabase of DNA, however they show a faster recovery from an HU block. This was accompanied by impaired RPA-32 priming serine 29 and serine 33 phosphorylations and SMC1-Serine 966 phosphorylation as well as lower levels of DNA damage assessed by the alkaline Comet assay, gamma-H2AX signal intensity, RPA and Rad51 foci and RPA-32 serine 4 and serine 8 phosphorylation and levels of sister chromatid exchanges. In vitro kinase assays coupled with mass spectrometry showed that Cdk5 can phosphorylate RPA-32 on serines 23, 29, and 33. In addition lower Cdk5 levels were associated with longer metastasis free survival in breast cancer patients and lower cell survival in Cdk5 depleted breast tumor cells after treatment with IR and a PARP inhibitor. Taken together, these results show that Cdk5 is necessary for basal replication and replication stress checkpoint activation and opens up interesting clinical opportunities to enhance tumor cell killing in certain populations of breast cancer patients through agents that generate replication stress.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医科学) / 甲第21026号 / 医科博第87号 / 新制||医科||6(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医科学専攻 / (主査)教授 篠原 隆司, 教授 松田 道行, 教授 松本 智裕 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(人間・環境学) / 甲第24692号 / 人博第1065号 / 新制||人||250(附属図書館) / 2022||人博||1065(吉田南総合図書館) / 京都大学大学院人間・環境学研究科相関環境研究専攻 / (主査)教授 高田 穣, 教授 宮下 英明, 教授 川本 卓男, 教授 原田 浩 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Human and Environmental Studies / Kyoto University / DFAM

Jusqu'à présent, les modifications de la réplication de l'ADN entre cellules normales et cancéreuses ont été peu étudiées. Dans ce travail, nous avons utilisé le séquençage des fragments d'Okazaki, une technique récemment développée au laboratoire, pour déterminer la directionalité des fourches de réplication dans plusieurs lymphomes de Burkitt (LB), qui surexpriment l'oncoprotéine Myc à la suite de translocations chromosomiques spécifiques, ainsi que dans des lignées lymphoblastoides contrôles (LLC) et dans des léiomyosarcomes (LMS). Les profils de directionalité des fourches de réplication permettent de déduire la localisation et l'efficacité des sites d'initiation et de terminaison de la réplication le long du génome. Nous avons observé de nombreuses (~2000) différences de zones d'initiation entre les lignées Raji (LB) et GM06990 (LLC) ainsi qu'entre les lignées BL 79 et IARC385, une paire LB/LLC provenant d'un même patient. Nous avons détecté un nombre comparable de différences en comparant deux à deux les lignées étudiées. Cependant, les profils de BL79 et de Raji (deux LB) sont un peu plus proches l'un de l'autre que de la lignée contrôle GM06990. Ceci suggère l'existence de changements de la réplication récurrents dans les lignées LB. L'importance des différences observées entre les lignées IARC385 et GM06990 indique de façon surprenante une grande variabilité entre les LLC normales, provenant de différents individus. De façon intéressante, de nombreuses différences observées entre les lignées LB et LLC sont associées à des changements de l'expression des gènes ou de la liaison de l'oncoprotéine Myc. La comparaison des profils des deux LMS avec tous les profils disponibles au laboratoire montre que c'est à celui de fibroblastes normaux (IMR90) qu'ils ressemblent le plus. Ceci suggère que les cellules de tumeurs musculaires lisses auraient subi une transformation fibroblastique au cours de la tumorigénèse. Des données récentes suggèrent que les champs magnétiques peuvent perturber certains processus cellulaires comme l'assemblage du cytosquelette. Nous avons utilisé le séquençage de fragment d'Okazaki pour rechercher d'éventuels effets d'un champ magnétique sur la réplication de l'ADN chez la levure. Aucun effet du champ magnétique sur la directionalité des fourches de réplication n'a été détecté. / Changes in DNA replication profiles between cancer and normal cells have been poorly explored. In this work, sequencing of Okazaki fragments, a novel methodology developed in the laboratory, was used to determine replication fork directionality (RFD) in several Burkitt's lymphomas (BL), which overexpress the Myc oncoprotein due to specific chromosomal translocations, and control normal lymphoblastoid cell lines (LCL), and in leiomyosarcomas (LMC). RFD profiles allow to infer the location and efficiency of replication initiation and termination sites genome-wide. A larger number (~2000) of differences in replication initiation zones were observed genome-wide between Raji (BL) and GM06990 (LCL), and between BL79 and IAR385, a BL / LCL pair of cell lines established from a single patient. Comparably large numbers of changes were slightly more similar to each other than to GM06990. This suggests the occurrence of some recurrent replication changes in BL cell lines. The large number of changes observed between IARC385 and GM06990 also indicates an unexpectedly large variation between normal LCLs of different individuals. Interestingly, many changes in RFD profiles between BLs and and LCLs are associated with cell-type specific gene expression and differential binding of the Myc oncoprotein. Comparison of the two LMS profiles with all RFD profiles available in the laboratory reveals that they most resemble normal fibroblasts (IMR90). This suggests that the smooth muscle cancer cells might have undergone a fibroblastic transformation during tumorigenesis. Magnetic fields have been reported to perturb cellular processes such as cytoskeleton assembly. Sequencing of Okazaki fragments was used in a preliminary investigation of the possible effects of magnetic fields on DNA replication in yeast cells. No effect of magnetic fields on replication fork directionality were observed.

Les cellules sont constamment exposées à des agents endommageant de l'ADN d'origine exogène, notamment les rayons ultraviolets, les irradiations γ, et l'exposition aux agents chimiques génotoxiques, mais également d'origine endogène générés par le métabolisme cellulaire. De plus en plus d'évidences montrent que la transcription est un processus biologique qui peut mettre en péril l'intégrité du génome. Un mécanisme actuellement très étudié qui lie la transcription à l'instabilité génomique est la formation des boucles R (R-loops), des structures hybrides ARN:ADN qui exposent un ADN simple brin déplacé. Ces structures aberrantes se présentent en tant que sous-produits de la transcription et/ou lors de l'interférence entre la réplication et la transcription, et plus récemment ils ont été montrées s'accumuler lorsque la biogénèse de l'ARNm est perturbée. La persistance des boucles R est une source importante d'instabilité génomique car elle peut générer des cassures double brin de l'ADN et favoriser la recombinaison. Pour faire face aux conséquences néfastes des endommagements de l'ADN, les cellules activent une cascade élaborée de voies de signalisation qui permet de coordonner la prolifération cellulaire avec la réparation de l'ADN. L'ensemble de ces acteurs moléculaires constitue un réseau de réponse aux dommages de l'ADN qui est indispensable pour la stabilité génomique. Récemment chez la levure, l'activation transitoire de ce réseau a été également proposée être important dans la coordination de la transcription et de la réplication, afin d'éviter d'une part des contraintes topologiques et d'autre part la formation de structures aberrantes générées lors de conflits entre ces deux processus cellulaires essentiels. Dans la perspective d'identifier des nouveaux gènes impliqués dans ce réseau de signalisation, un crible fonctionnel in vitro précédemment établi au laboratoire a conduit à l'identification de Ddx19, une hélicase à motif DEAD-box, en tant que nouvel élément répondant à l'endommagement de l'ADN. Ddx19 interagit avec le pore nucléaire via CAN/Nup214, et il est impliqué dans l'export des ARNm grâce à son activité hélicase et ATPase, stimulé par les facteurs IP6 et Gle1. Le présent travail de thèse dévoile une nouvelle fonction de Ddx19 distincte de son rôle connu dans l'export de l'ARNm. Je pu montrer que, lors de l'induction des dommages à l'ADN par les rayons UV, Ddx19 se relocalise transitoirement de la face cytoplasmique du nucléopore vers le noyau de façon dépendant d'ATR. L'inactivation de Ddx19 entraîne des endommagements spontanées dépendant de la prolifération, démontré par l'activation de la voie de signalisation d'ATM-Chk2 et la formation de foyers nucléaires de γH2AX et 53BP1. Ces phénotypes sont concomitants avec le ralentissement des fourches de réplication qui ne peuvent plus redémarrer après leur blocage par la camptothécine. En outre, les cellules déplétées de Ddx19 présentent une forte accumulation des boucles R nucléaires, enrichi dans le compartiment nucléolaire, et aussi autour de la périphérie nucléaire. Par ailleurs, ces cellules présentent une viabilité réduite et une létalité synthétique lorsque la déplétion de Ddx19 est combinée avec l'inhibition de l'expression de la topoisomérase I. Je propose Ddx19 comme deuxième hélicase nécessaire pour la résolution des boucles R, et qui fonctionne à côté mais de façon indépendante de la Senataxin, l'hélicase précédemment connue pour résoudre ces structures in vivo chez les cellules de mammifères. Je démontre que cette nouvelle fonction de Ddx19 ne dépend pas de son interaction avec le pore nucléaire, mais plutôt de son activité hélicase et d'un résidu de sérine phosphorylée par Chk1 qui stimule sa relocalisation vers le noyau. Ces données proposent Ddx19 en tant que nouvelle ARN hélicase qui facilite la coordination de la réplication et la transcription, médiée par ATR à travers de la résolution des boucles R, préservant ainsi l'intégrité du génome. / Cells are continuously challenged by DNA damage resulting from external cues as UV light, γ-irradiation and exposure to genotoxic chemicals, as well as from endogenous stress caused by cellular metabolism. Growing evidence points to transcription as a biological process that could adversely affect genome integrity. One currently highly investigated mechanism by which transcription can induce genome instability is through the formation of R-loops, RNA:DNA hybrid structures exposing a displaced single-stranded DNA tract. These aberrant structures occur as byproducts of transcription and/or upon interference between replication and transcription, and more recently were also shown to accumulate upon disruption of mRNA biogenesis and processing. Persistent unresolved R-loops are a potent source of genomic instability as they ultimately generate double strand breaks and promote recombination events. To deal with the deleterious consequences of DNA damage, cells activate elaborate DNA damage response (DDR) pathways to delay cell division and stimulate repair of lesions, thus preserving genome stability. Recently in yeast transient DDR activation has also been proposed to be important in the coordination of transcription and replication, in order to avoid topological constraints and the formation of aberrant structures generated upon collision of their machineries. By means of an in vitro screen aimed at identifying new DDR genes, we isolated Ddx19, a DEAD-Box helicase known to be involved in mRNA export, as a novel DNA damage responsive gene. Ddx19 interacts with the nucleopore complex via nucleoporin CAN/Nup214, and is involved in mRNA remodelling and export through its ATPase and helicase activities, stimulated by IP6 and the Gle1 factor. My present thesis work unravels a novel function of Ddx19 in preserving genome stability in mammalian cells, distinct from its known role in mRNA export. I show that upon UV-induced damage, Ddx19 transiently relocalizes from the cytoplasmic face of the nucleopore to the nucleus in an ATR-dependent manner. Downregulation of Ddx19 gives rise to spontaneous, proliferation-dependent DNA damage, as determined by the specific activation of the ATM-Chk2 pathway and formation of γH2AX and 53BP1 nuclear foci. This is concomitant with the slowing down of replication forks that are unable to restart after being stalled with camptothecin. In addition, cells depleted of Ddx19 display strong accumulation of nuclear R-loops, enriched in the nucleolar compartment, and around the nuclear periphery. Moreover, these cells show low viability and exhibited synthetic lethality when combined with inhibition of topoisomerase I expression. I propose Ddx19 as a second helicase required for R-loops resolution, functioning alongside but independently of Senataxin, the first known RNA helicase to resolve these structures in vivo in mammalian cells. I provide evidence that this new function of Ddx19 does not depend on its interaction with the nuclear pore, but rather on its helicase activity and on a serine residue phosphorylated by Chk1 which promotes its relocalization into the nucleus upon damage. These data put forward Ddx19 as a novel RNA helicase that facilitates ATR-dependent coordination of DNA replication and transcription through R-loops resolution, thus preserving genome integrity.

Des stress réplicatifs sont rencontrés à chaque phase S du cycle cellulaire et différents mécanismes permettent leur prise en charge. La recombinaison homologue (RH) tient un rôle important dans le maintien de la stabilité du génome au cours de la réplication. En effet, la RH escorte la progression des fourches et prévient les défauts mitotiques. Toutefois, le lien moléculaire entre le stress réplicatif et les défauts mitotiques n’est pas élucidé. De façon générale, les fourches de réplication bloquées peuvent être sauvées grâce à leur fusion avec la fourche convergente ou au redémarrage de fourche par la RH. Le laboratoire a développé un essai génétique reposant sur l’utilisation d’une barrière de réplication conditionnelle afin d’étudier le mécanisme par lequel la RH contribue au sauvetage des fourches de réplication bloquées. L’équipe a montré que le redémarrage des fourches bloquées par la RH est conditionné par l’exposition d’un ADNsb et non d’une cassure double-brin. Ainsi, les fonctions de la RH au cours de la gestion du stress réplicatif peuvent être adressées indépendamment de sa fonction de réparation des cassures (fonction relativement bien documentée). Les travaux décrits dans ce manuscrit s’inscrivent autour des mécanismes que la RH engage afin d’assurer la stabilité génétique en réponse au stress réplicatif. Plus précisément, je me suis intéressée à l’implication des facteurs de la RH dans la protection des fourches de réplication bloquées au niveau moléculaire et cellulaire. En absence de la recombinase Rad51 ou de son chargeur Rad52, le blocage d’une seule fourche de réplication est suffisant pour induire des défauts mitotiques, incluant des ponts anaphasiques (lien physique entre chromatides sœurs). Il s’avère que les fourches bloquées sont extensivement dégradées par la nucléase Exo1 en absence de Rad51/Rad52. De manière intéressante, l’accumulation excessive d’ADNsb à la fourche est à l’origine de la non-disjonction des chromatides sœurs en mitose et ce malgré l’arrivée de fourches convergente. Ainsi, les fourches de réplication non protégées sont le siège de terminaison pathologique mettant à mal la ségrégation des chromosomes. La RH étant impliquée dans la protection et le redémarrage des fourches de réplication, l’utilisation du mutant de séparation de fonction Rad51-3A a permis de montrer que ces deux fonctions sont génétiquement séparables. Les fourches de réplication protégées et incapables d’être redémarrées par la RH ne présentent pas de symptômes de terminaison pathologique. Ainsi, au-delà de sa capacité à redémarrer les fourches inactivées, les facteurs de la RH assurent la complétion de de la réplication en maintenant les fourches de réplication dans une conformation propice à une fusion avec la fourche convergente. Ces résultats contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires invoqués par la RH afin de maintenir la stabilité génétique au cours du stress réplicatif. / At each cell cycle, cells undertaking the DNA replication process face several sources of replication stress (RS) compromising the progression of the replicating forks and threatening both chromosome duplication fidelity and their correct segregation during mitosis. Replication stresses emerged as a major source of genetic instability and cancer development. Several mechanisms, among which homologous recombination (HR), operate to buffer the deleterious effects of RS. HR acts as an escort to fork progression and prevents mitotic defects. Nonetheless, the molecular connection between replication stress and mitotic defects remains elusive. A conditional replication fork barrier (RFB) acting in a polar manner was developed in the lab to terminally-arrest fork progression. In this system, HR functions handling replication stress can be assessed independently of its well-known function in double strand break repair. The work described here aims to understanding the mechanism that HR performs to ensure genetic stability in response to replication stress. In general, blocked replication forks can be rescued either by fork convergence or by active HR-mediated fork restart. However, in absence of Rad51 recombinase or it loader Rad52, a single activated RFB is sufficient to induce mitotic abnormalities including anaphase bridges. The involvement of HR factors in fork protection was explored at the molecular and cellular levels. It turns out that terminally-arrested forks are extensively resected by the Exo1 nuclease in the absence of Rad51/Rad52. Interestingly, the excess of ssDNA accumulation at the fork triggers sister chromatid non-disjunction in mitosis despite the arrival of an uncorrupted converging fork to rescue replication. Thus, unprotected replication forks are prone to pathological termination threatening chromosome segregation. HR being involved in fork protection and restart, the use of a Rad51 mutant showed that these two functions are genetically separable. Indeed, protected forks unable to restart by HR do not show any pathological termination. Thus, beyond their ability to restart inactivated forks, HR factors ensure replication completion by maintaining the forks in a suitable conformation for a fusion with the converging fork. Overall, these results shed light on the molecular events engaged by RH to ensure genome stability in response to replication stress.

One of the most common infections of a human organism is an infection of stomach induced by pathogenic bacteria Helicobacter pylori (H. pylori). It is estimated that every second person is infected, with even higher prevalence in developing countries. As a quiet enemy, H. pylori can colonise a human stomach for decades without manifestation of infection-associated symptoms. However, chronic infection may cause severe damage to the stomach tissue, subsequently leading to the development of gastric diseases, including gastritis and ulcer disease. H. pylori infection is also a driving cause of gastric cancer, with 80% of gastric cancers being associated with chronic infection. H. pylori ensures its life-long persistence in a human host organism via the action of its virulence factors, which have a pleiotropic effect on multiple systems, mostly acting on the attenuation of a human immune system and the induction of atrophy of stomach tissue. The irreversible changes of stomach epithelium are induced by activation of an innate immune response in H. pylori-exposed epithelial cells through the stimulation of ALPK1/TIFA/NF-κB signalling pathway upon a recognition of β-ADP heptose, an intermediate product of bacterial lipopolysaccharide biosynthesis, and consequently leading to the formation of DNA...

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