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Unlike RNA viruses, which typically encode their own RNA-dependent RNA polymerases, DNA viruses typically utilize host RNA Polymerase II (RNAPII) to transcribe their genes. Therefore, host factors that interact with RNAPII often maintain important regulatory roles during DNA virus infections. Senataxin (SETX) is a ubiquitously expressed 303 kDa RNA:DNA helicase that associates with RNAPII. It is involved in the resolution of R-loops and plays a role during the DNA damage response. Mutations in SETX are implicated in the neurodegenerative diseases Type 2 Ataxia with Oculomotor Apraxia (AOA2) and juvenile Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS4). Recent work from our group has demonstrated that SETX also acts as an antagonist of the antiviral response during RNA virus infections. Infections, including those caused by Herpes Simplex Virus type I (HSV-1), have been identified as potential environmental triggers of neurodegenerative diseases. Therefore, we elected to study the role of SETX during DNA virus infections since, in addition to regulating host genes, it may also play a role in viral transcription and/or DNA replication. Our data suggests that SETX is involved in the regulation of viral gene expression, and that SETX facilitates DNA replication and contributes to viral biogenesis. SETX attenuates the antiviral response, and in mouse models of infection, is protective against HSV-1 disease pathogenesis. These studies have enhanced our understanding of the role played by SETX during viral infection and may shed light on the mechanism(s) through which SETX dysfunction results in neurodegenerative diseases. / Thesis / Master of Health Sciences (MSc) / DNA viruses utilize host proteins in gene expression, therefore, associated factors play roles during DNA virus infections. Senataxin (SETX) is a RNA:DNA helicase associated with these proteins. SETX mutations are implicated in the neurodegenerative diseases Type 2 Ataxia with Oculomotor Apraxia (AOA2) and juvenile Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS4). Recently, our group demonstrated SETX antagonizes antiviral responses to RNA virus infections. Infections, including those caused by Herpes Simplex Virus type I (HSV-1), are identified as potential triggers of neurodegenerative diseases. We elected to study the role of SETX during DNA virus infections. Our data suggests that SETX is involved in the regulation of viral gene expression, facilitates HSV-1 DNA replication, attenuates the antiviral response, and in mouse models of infection, is protective against HSV-1 disease pathogenesis. These studies enhance understanding of the role of SETX during viral infection and may shed light on the mechanism(s) of SETX role in neurodegenerative disease.

<p>Constitutive stable DNA replication (cSDR) is an alternative mode of replication initiation in Escherichia coli. cSDR is active in rnhA and recG mutants, which lack proteins that remove DNA-RNA hybrids called R-loops. The mechanism for cSDR initiation, therefore, is thought to involve these R-loop structures, which are proposed to form at specific locations known as oriK sites on the chromosome. Thus far, oriK sites have only been mapped to broad, 100-200 kb regions on the chromosome, so the specific elements involved in initiation are still unknown. My research focused on localizing the oriK sites on the chromosome, specifically those in the terminus region, where two of the major oriK sites had previously been mapped. We used two-dimensional gel electrophoresis (Friedman & Brewer, 1995) to analyze the replication forks that are blocked at the innermost Ter sites at the terminus, and found that elevated levels of replication forks are blocked at the Ter sites in rnhA mutants. We also used microarray and deep sequencing analysis to determine that there is a major location of oriK activity in the chromosome, located in the region between TerA and TerC. Furthermore, we also studied the use of the activation-induced deaminase (AID) enzyme as a tool for identifying regions of R-loop formation in the chromosome, and learned about its properties in the process.</p> / Dissertation

Yes / R-loops are by-products of transcription that must be tightly regulated to maintain genomic stability and gene expression. Here, we describe a mechanism for the regulation of the Rloop- specific helicase, senataxin (SETX), and identify the ubiquitin specific peptidase 11 (USP11) as an R-loop regulator. USP11 de-ubiquitinates SETX and its depletion increases SETX K48-ubiquitination and protein turnover. Loss of USP11 decreases SETX steady-state levels and reduces R-loop dissolution. Ageing of USP11 knockout cells restores SETX levels via compensatory transcriptional downregulation of the E3 ubiquitin ligase, KEAP1. Loss of USP11 reduces SETX enrichment at KEAP1 promoter, leading to R-loop accumulation, enrichment of the endonuclease XPF and formation of double-strand breaks. Overexpression of KEAP1 increases SETX K48-ubiquitination, promotes its degradation and R-loop accumulation. These data define a ubiquitination-dependent mechanism for SETX regulation, which is controlled by the opposing activities of USP11 and KEAP1 with broad applications for cancer and neurological disease. / Wellcome Trust Investigator Award, Lister Institute of Preventative Medicine Fellowship

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第21646号 / 医博第4452号 / 新制||医||1034(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 武田 俊一, 教授 萩原 正敏, 教授 滝田 順子 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Les cellules sont constamment exposées à des agents endommageant de l'ADN d'origine exogène, notamment les rayons ultraviolets, les irradiations γ, et l'exposition aux agents chimiques génotoxiques, mais également d'origine endogène générés par le métabolisme cellulaire. De plus en plus d'évidences montrent que la transcription est un processus biologique qui peut mettre en péril l'intégrité du génome. Un mécanisme actuellement très étudié qui lie la transcription à l'instabilité génomique est la formation des boucles R (R-loops), des structures hybrides ARN:ADN qui exposent un ADN simple brin déplacé. Ces structures aberrantes se présentent en tant que sous-produits de la transcription et/ou lors de l'interférence entre la réplication et la transcription, et plus récemment ils ont été montrées s'accumuler lorsque la biogénèse de l'ARNm est perturbée. La persistance des boucles R est une source importante d'instabilité génomique car elle peut générer des cassures double brin de l'ADN et favoriser la recombinaison. Pour faire face aux conséquences néfastes des endommagements de l'ADN, les cellules activent une cascade élaborée de voies de signalisation qui permet de coordonner la prolifération cellulaire avec la réparation de l'ADN. L'ensemble de ces acteurs moléculaires constitue un réseau de réponse aux dommages de l'ADN qui est indispensable pour la stabilité génomique. Récemment chez la levure, l'activation transitoire de ce réseau a été également proposée être important dans la coordination de la transcription et de la réplication, afin d'éviter d'une part des contraintes topologiques et d'autre part la formation de structures aberrantes générées lors de conflits entre ces deux processus cellulaires essentiels. Dans la perspective d'identifier des nouveaux gènes impliqués dans ce réseau de signalisation, un crible fonctionnel in vitro précédemment établi au laboratoire a conduit à l'identification de Ddx19, une hélicase à motif DEAD-box, en tant que nouvel élément répondant à l'endommagement de l'ADN. Ddx19 interagit avec le pore nucléaire via CAN/Nup214, et il est impliqué dans l'export des ARNm grâce à son activité hélicase et ATPase, stimulé par les facteurs IP6 et Gle1. Le présent travail de thèse dévoile une nouvelle fonction de Ddx19 distincte de son rôle connu dans l'export de l'ARNm. Je pu montrer que, lors de l'induction des dommages à l'ADN par les rayons UV, Ddx19 se relocalise transitoirement de la face cytoplasmique du nucléopore vers le noyau de façon dépendant d'ATR. L'inactivation de Ddx19 entraîne des endommagements spontanées dépendant de la prolifération, démontré par l'activation de la voie de signalisation d'ATM-Chk2 et la formation de foyers nucléaires de γH2AX et 53BP1. Ces phénotypes sont concomitants avec le ralentissement des fourches de réplication qui ne peuvent plus redémarrer après leur blocage par la camptothécine. En outre, les cellules déplétées de Ddx19 présentent une forte accumulation des boucles R nucléaires, enrichi dans le compartiment nucléolaire, et aussi autour de la périphérie nucléaire. Par ailleurs, ces cellules présentent une viabilité réduite et une létalité synthétique lorsque la déplétion de Ddx19 est combinée avec l'inhibition de l'expression de la topoisomérase I. Je propose Ddx19 comme deuxième hélicase nécessaire pour la résolution des boucles R, et qui fonctionne à côté mais de façon indépendante de la Senataxin, l'hélicase précédemment connue pour résoudre ces structures in vivo chez les cellules de mammifères. Je démontre que cette nouvelle fonction de Ddx19 ne dépend pas de son interaction avec le pore nucléaire, mais plutôt de son activité hélicase et d'un résidu de sérine phosphorylée par Chk1 qui stimule sa relocalisation vers le noyau. Ces données proposent Ddx19 en tant que nouvelle ARN hélicase qui facilite la coordination de la réplication et la transcription, médiée par ATR à travers de la résolution des boucles R, préservant ainsi l'intégrité du génome. / Cells are continuously challenged by DNA damage resulting from external cues as UV light, γ-irradiation and exposure to genotoxic chemicals, as well as from endogenous stress caused by cellular metabolism. Growing evidence points to transcription as a biological process that could adversely affect genome integrity. One currently highly investigated mechanism by which transcription can induce genome instability is through the formation of R-loops, RNA:DNA hybrid structures exposing a displaced single-stranded DNA tract. These aberrant structures occur as byproducts of transcription and/or upon interference between replication and transcription, and more recently were also shown to accumulate upon disruption of mRNA biogenesis and processing. Persistent unresolved R-loops are a potent source of genomic instability as they ultimately generate double strand breaks and promote recombination events. To deal with the deleterious consequences of DNA damage, cells activate elaborate DNA damage response (DDR) pathways to delay cell division and stimulate repair of lesions, thus preserving genome stability. Recently in yeast transient DDR activation has also been proposed to be important in the coordination of transcription and replication, in order to avoid topological constraints and the formation of aberrant structures generated upon collision of their machineries. By means of an in vitro screen aimed at identifying new DDR genes, we isolated Ddx19, a DEAD-Box helicase known to be involved in mRNA export, as a novel DNA damage responsive gene. Ddx19 interacts with the nucleopore complex via nucleoporin CAN/Nup214, and is involved in mRNA remodelling and export through its ATPase and helicase activities, stimulated by IP6 and the Gle1 factor. My present thesis work unravels a novel function of Ddx19 in preserving genome stability in mammalian cells, distinct from its known role in mRNA export. I show that upon UV-induced damage, Ddx19 transiently relocalizes from the cytoplasmic face of the nucleopore to the nucleus in an ATR-dependent manner. Downregulation of Ddx19 gives rise to spontaneous, proliferation-dependent DNA damage, as determined by the specific activation of the ATM-Chk2 pathway and formation of γH2AX and 53BP1 nuclear foci. This is concomitant with the slowing down of replication forks that are unable to restart after being stalled with camptothecin. In addition, cells depleted of Ddx19 display strong accumulation of nuclear R-loops, enriched in the nucleolar compartment, and around the nuclear periphery. Moreover, these cells show low viability and exhibited synthetic lethality when combined with inhibition of topoisomerase I expression. I propose Ddx19 as a second helicase required for R-loops resolution, functioning alongside but independently of Senataxin, the first known RNA helicase to resolve these structures in vivo in mammalian cells. I provide evidence that this new function of Ddx19 does not depend on its interaction with the nuclear pore, but rather on its helicase activity and on a serine residue phosphorylated by Chk1 which promotes its relocalization into the nucleus upon damage. These data put forward Ddx19 as a novel RNA helicase that facilitates ATR-dependent coordination of DNA replication and transcription through R-loops resolution, thus preserving genome integrity.

Les R-loops générés durant la transcription sont impliqués dans de nombreuse fonctions incluant la réplication, la recombinaison et l’expression génique tant chez les procaryotes que chez les eucaryotes. Plusieurs études ont montré qu’un excès de supertours négatifs et des séquences riches en bases G induisent la formation de R-loops. Jusqu’à maintenant, nos résultats nous ont permis d’établir un lien direct entre les topoisomérases, le niveau de surenroulement et la formation de R-loops. Cependant, le rôle physiologique des R-loops est encore largement inconnu. Dans le premier article, une étude détaillée du double mutant topA rnhA a montré qu’une déplétion de RNase HI induit une réponse cellulaire qui empêche la gyrase d’introduire des supertours. Il s’agit ici, de la plus forte évidence supportant les rôles majeurs de la RNase HI dans la régulation du surenroulement de l’ADN. Nos résultats ont également montré que les R-loops pouvaient inhiber l’expression génique. Cependant, les mécanismes exacts sont encore mal connus. L’accumulation d’ARNs courts au détriment d’ARNs pleine longueur peut être causée soit par des blocages durant l’élongation de la transcription soit par la dégradation des ARNs pleine longueur. Dans le deuxième article, nous montrons que l’hypersurenroulement négatif peut mener à la formation de R-loops non-spécifiques (indépendants de la séquence nucléotidique). La présence de ces derniers, engendre une dégradation massive des ARNs et ultimement à la formation de protéines tronquées. En conclusion, ces études montrent l’évidence d’un lien étroit entre la RNase HI, la formation des R-loops, la topologie de l’ADN et l’expression génique. De plus, elles attestent de la présence d’un nouvel inhibiteur de gyrase ou d’un mécanisme encore inconnu capable de réguler son activité. Cette surprenante découverte est élémentaire sachant que de nombreux antibiotiques ciblent la gyrase. Finalement, ces études pourront servir également de base à des recherches similaires chez les cellules eucaryotes. / R-loops generated during transcription elongation are implicated in many DNA reactions, including replication, recombination and gene expression both in prokaryotes and in eukaryotes. Many studies have shown that negative supercoils excess and G-rich sequences induce the formation of R-loops. Up to now, our results allow us to establish a direct link between topoisomerases, supercoiling level, and the formation of R-loops. However, what the physiological significance, if any, of R-loops is still largely unknown. In the first article, a detailed study on double topA rnhA mutants showed that the depletion of RNase HI activity induces a cellular response which renders gyrase unable to perform supercoils. This is the first evidence implicating RNase HI as a major player in DNA supercoiling regulation. Our results also show that R-loops formation can lead to the inhibition of gene expression. However, the exact mechanism(s) leading to the inhibition of gene expression are not yet understood. The accumulation of shorter than full length RNAs could be caused by road-blocks during transcription elongation or by the degradation of full length RNAs. In the second article, we show that hypernegative supercoiling can lead to sequence independent R-loop formation. The physiological consequence is extensive RNA degradation which ultimately culminates in the formation of truncated proteins. In conclusion, this study clearly shows a close link between RNase HI activity, R-loop formation, DNA topology and gene expression. In addition, this study also provides some evidence for the synthesis of a gyrase inhibitor that can regulate gyrase activity directly or indirectly via unidentified mechanisms. This surprising observation is still preliminary taking into consideration that many antibiotics target gyrase. Finally results from this study could open up avenues for research in eukaryotes.

Les R-loops générés durant la transcription sont impliqués dans de nombreuse fonctions incluant la réplication, la recombinaison et l’expression génique tant chez les procaryotes que chez les eucaryotes. Plusieurs études ont montré qu’un excès de supertours négatifs et des séquences riches en bases G induisent la formation de R-loops. Jusqu’à maintenant, nos résultats nous ont permis d’établir un lien direct entre les topoisomérases, le niveau de surenroulement et la formation de R-loops. Cependant, le rôle physiologique des R-loops est encore largement inconnu. Dans le premier article, une étude détaillée du double mutant topA rnhA a montré qu’une déplétion de RNase HI induit une réponse cellulaire qui empêche la gyrase d’introduire des supertours. Il s’agit ici, de la plus forte évidence supportant les rôles majeurs de la RNase HI dans la régulation du surenroulement de l’ADN. Nos résultats ont également montré que les R-loops pouvaient inhiber l’expression génique. Cependant, les mécanismes exacts sont encore mal connus. L’accumulation d’ARNs courts au détriment d’ARNs pleine longueur peut être causée soit par des blocages durant l’élongation de la transcription soit par la dégradation des ARNs pleine longueur. Dans le deuxième article, nous montrons que l’hypersurenroulement négatif peut mener à la formation de R-loops non-spécifiques (indépendants de la séquence nucléotidique). La présence de ces derniers, engendre une dégradation massive des ARNs et ultimement à la formation de protéines tronquées. En conclusion, ces études montrent l’évidence d’un lien étroit entre la RNase HI, la formation des R-loops, la topologie de l’ADN et l’expression génique. De plus, elles attestent de la présence d’un nouvel inhibiteur de gyrase ou d’un mécanisme encore inconnu capable de réguler son activité. Cette surprenante découverte est élémentaire sachant que de nombreux antibiotiques ciblent la gyrase. Finalement, ces études pourront servir également de base à des recherches similaires chez les cellules eucaryotes. / R-loops generated during transcription elongation are implicated in many DNA reactions, including replication, recombination and gene expression both in prokaryotes and in eukaryotes. Many studies have shown that negative supercoils excess and G-rich sequences induce the formation of R-loops. Up to now, our results allow us to establish a direct link between topoisomerases, supercoiling level, and the formation of R-loops. However, what the physiological significance, if any, of R-loops is still largely unknown. In the first article, a detailed study on double topA rnhA mutants showed that the depletion of RNase HI activity induces a cellular response which renders gyrase unable to perform supercoils. This is the first evidence implicating RNase HI as a major player in DNA supercoiling regulation. Our results also show that R-loops formation can lead to the inhibition of gene expression. However, the exact mechanism(s) leading to the inhibition of gene expression are not yet understood. The accumulation of shorter than full length RNAs could be caused by road-blocks during transcription elongation or by the degradation of full length RNAs. In the second article, we show that hypernegative supercoiling can lead to sequence independent R-loop formation. The physiological consequence is extensive RNA degradation which ultimately culminates in the formation of truncated proteins. In conclusion, this study clearly shows a close link between RNase HI activity, R-loop formation, DNA topology and gene expression. In addition, this study also provides some evidence for the synthesis of a gyrase inhibitor that can regulate gyrase activity directly or indirectly via unidentified mechanisms. This surprising observation is still preliminary taking into consideration that many antibiotics target gyrase. Finally results from this study could open up avenues for research in eukaryotes.