Clostridium perfringens est ubiquitaire dans l’environnement. Ce microorganisme peut être retrouvé dans la flore normale du tractus gastro-intestinal des mammifères et peut également causer une variété d’infections intestinales. Le phénotype de résistance à la bacitracine a déjà été rapporté chez C. perfringens mais les gènes associés n’ont pas été caractérisés. Dans cette étude, 24 des 99 isolats de C. perfringens aviaires testés ont démontré une résistance à la bacitracine. Les analyses ont révélé la présence d’un transporteur ABC ainsi que d’une undécaprénol kinase surproduite. Ces deux mécanismes semblent être codés par l’opéron bcrABDR. En amont et en aval des gènes bcr, un élément IS1216-like a été identifié, celui-ci pouvant jouer un rôle dans la dissémination de la résistance à la bacitracine. Des analyses d’hybridation sur ADN ont révélé que les gènes bcrABDR étaient localisés sur le chromosome. De plus, il a été démontré que les gènes bcr étaient exprimés en présence de bacitracine. Plusieurs études ont associé la tolérance aux antibiotiques et aux désinfectants à la formation de biofilm. Dans la littérature, peu d’informations sont disponibles sur le biofilm de C. perfringens. La majorité des isolats testés dans cette étude ont démontré la formation d’un biofilm. L’analyse de la matrice a démontré que celle-ci contenait des protéines, de l’ADN extracellulaire ainsi que des polysaccharides liés en bêta-1,4. Une meilleure survie des cellules en biofilm a été observée suite à une exposition à de fortes concentrations d’antibiotiques. Une exposition à de faibles doses de certains antibiotiques semblait diminuer le biofilm formé alors que pour d’autres, le biofilm semblait augmenter. Dans la présente étude, la susceptibilité des biofilms de C. perfringens à la désinfection a été également analysée. Les résultats ont démontré que la formation de biofilm protégeait les cellules de l’action du monopersulfate de potassium, des ammoniums quaternaires, du peroxyde d’hydrogène et du glutéraldéhyde. Toutefois, l’hypochlorite de sodium a été démontré comme étant efficace contre le biofilm de C. perfringens. Il a été démontré que les biofilms mixtes de C. perfringens cultivés en présence de Staphylococcus aureus ou d’Escherichia coli étaient plus résistants à la désinfection en comparaison aux biofilms simples de S. aureus ou d’E. coli. Toutefois, le biofilm simple de C. perfringens était plus résistant à la désinfection que les biofilms mixtes. Finalement, les profils de transcription entre les populations planctoniques et en biofilm ont été analysés par séquençage d’ARN. L’analyse transcriptomique du biofilm a identifié 238 gènes différentiellement exprimés entre les deux conditions. Les gènes négativement régulés sont impliqués dans la virulence, la production d’énergie, le métabolisme des sucres ainsi que dans la biosynthèse des acides gras et des acides aminés alors que les gènes induits sont impliqués dans la réponse au stress et au stress oxydatif, dans la biosynthèse d’acides gras et de phospholipides ainsi que dans la virulence. Cette étude décrit pour la première fois la découverte des gènes associés à la résistance à la bacitracine chez C. perfringens. Elle rapporte également de nouvelles données sur la matrice du biofilm, la tolérance aux antibiotiques et aux désinfectants ainsi que sur le transcriptome du biofilm de C. perfringens. / Clostridium perfringens is ubiquitous in the environment. This microorganism can be found in the intestinal tract of mammals as normal flora and can also cause many gastrointestinal infections. Phenotypic bacitracin resistance has been reported in the literature for C. perfringens but the genes responsible for this resistance have not yet been characterized. In this study, twenty-four of the 99 poultry isolates tested showed bacitracin resistance. Analysis revealed putative genes encoding for both an ABC transporter and an overproduced undecaprenol kinase. These two mechanisms were shown to be both encoded by the putative bcrABDR operon. An IS1216-like element was found upstream and downstream from the bcr cluster, which may play a role in the dissemination of this resistance determinant. DNA hybridization analyses revealed that the bacitracin resistance genes bcrABDR were located on the chromosome. Moreover, this gene cluster has been showed to be expressed under bacitracin stress. Many studies have associated tolerance to antibiotics and disinfectants to biofilm. In the literature, very little is known on the biofilm formation by C. perfringens. Most of the C. perfringens isolates tested in this study were able to form biofilms. Matrix composition analysis revealed the presence of proteins, extracellular DNA and beta-1,4 linked polysaccharides. Biofilm could also protect C. perfringens bacterial cells from an exposition to high concentrations of antibiotics. Exposition to low doses of antibiotics tended to lead to a diminution of the biofilm formed but for few isolates, the biofilm formation was increased. In the present study, susceptibilities of C. perfringens biofilms to disinfectants were also analysed. Results showed that biofilms can protect the bacterial cells from the action of potassium monopersulfate, quaternary ammonium chlorides, hydrogen peroxide and gluteraldehyde solutions. However, sodium hypochlorite solution was shown to be effective on C. perfringens biofilms. Our investigation of dual-species biofilms of C. perfringens with the addition of Staphylococcus aureus or Escherichia coli demonstrated that these dual-species biofilms were more tolerant to disinfection with sodium hypochlorite than the mono-species biofilms of S. aureus or E. coli. However, further disinfection studies using sodium hypochlorite suggest that the mono-species biofilms formed by C. perfringens is more tolerant to this disinfectant than the dual-species biofilms of C. perfringens with S. aureus or E. coli. Finally, the differential gene expression patterns between planktonic populations and biofilms of C. perfringens were investigated by RNA sequencing. The transcriptomic analysis identified 238 genes that were significantly differentially expressed between both conditions. Genes that were down-regulated in biofilm cells, relative to planktonic cells, included those involved in virulence, energy production, carbohydrate metabolism, fatty acids and amino acids biosynthesis. On the other hand, genes up-regulated in biofilm cells were involved in oxidative and stress responses, fatty acids and phospholipids biosynthesis and few genes were involved in virulence. This study reports on the discovery of genes associated to bacitracin resistance of C. perfringens. Our work brings also new data on matrix cohesion of the biofilm, tolerance to antibiotics and disinfectants, and on the transcriptome of the biofilm of C. perfringens.

La connaissance et la maîtrise de la présence d’un biofilm représentent aujourd’hui un challenge important. Dans le contexte d’étude des capacités de développement des biofilms, BioFilm Control fait figure de pionnier grâce à leur test nommé Biofilm Ring Test. Basé sur une sollicitation du biofilm via l’attraction, par un aimant, de microbilles magnétiques au centre du puits, le test évalue la présence de biofilm par l’absence de regroupement des billes au centre du puits à un instant donné. L’enjeu de ce travail est de décliner le BioFilm Ring Test® en un examen dynamique, non destructif et à l’échelle microscopique. Dans le biofilm, la matrice polymérique assure la cohésion entre cellules et confère une protection aux bactéries qui vivent au sein du biofilm. Les propriétés mécaniques de la matrice sont donc un indicateur de l’état local du biofilm. La recherche de ces paramètres permet de pouvoir prédire et contrôler la formation, l’accumulation et la dissémination de bactéries propageant les infections et/ou l’encrassement. Néanmoins, la détermination des propriétés mécaniques des biofilms nécessite des précautions et l’usage d’un vocabulaire homogénéisé et de méthodes unifiées au sein de la communauté. Pour cela, une première partie de ce travail de thèse consiste en la proposition d’un guide de bonnes pratiques quant à la caractérisation mécanique du matériau biofilm. Dans la deuxième partie de ce travail de thèse, une méthodologie pour le suivi de particules micrométriques au sein d’un matériau vivant est développée. Le recours à des techniques d’imagerie telle que la corrélation d’images numériques permet de remonter à la cinématique du mouvement de chacune des microbilles, qui servent de marqueurs au sein des images traitées, par une mesure sans contact. Cette méthode est ensuite appliquée à l’étude de la formation de biofilm. L’originalité de ce travail repose sur la caractérisation de l’évolution de la typologie du mouvement des microbilles métalliques lors de la formation des biofilms. Il s’agit là de discriminer des comportements de billes révélateurs de la genèse d’un biofilm. En tirant parti de l’observation du mouvement de microbilles inertes introduites dans le milieu bactérien, on détecte des changements de typologies de trajectoires qui semblent être reliés à l’activité de bactéries sessiles, adhésion ou formation de matériel extracellulaire. Les résultats montrent que les diverses étapes de la formation de biofilms sont caractérisées, ce qui permet notamment de discriminer la présence ou non d’antibiotiques mélangés avec les bactéries et d’apprécier leur efficacité. Dans une dernière partie, des recherches encore en phase de développement sont exposées. Elles s’intéressent au comportement du biofilm sous sollicitation volumique. Il s’agit dans ce cas d’observer le biofilm en champ lointain et de suivre le déplacement ou la déformation d’un marquage constitué d’un agglomérat de microbilles, plongées dans un champ magnétique. Ces premiers travaux pourront servir d’ébauche à des travaux futurs dans le but de caractériser quantitativement le matériau biofilm. / The control of biofilm formation constitutes an important challenge in many industrial and biomedical applications. In this context, BioFilm Control is a pioneer thanks to its test named BioFilm Ring Test. Based on the immobilisation of magnetic microbeads by adherent cells, the assay allows to detect the presence of biofilm at a given time. The aim of this phD project is to translate the BioFilm Ring Test® into a dynamic, non-destructive and microscopic examination of the biofilm state. Whithin the biofilm, the matrix provides a strong cohesion between cells and therefore increases their resistance against chemical or mechanical stress in comparison to their planktonic counterparts. The mechanical properties of the matrix are therefore an indicator of the local state of the biofilm. The search for these parameters makes it possible to predict and control the formation, accumulation and spread of bacteria that propagate infections and/or biofouling. Nevertheless, the determination of the mechanical properties of biofilms requires precautions and the use of an homogenized vocabulary and methods that are unified within the community. To this end, a first part of this thesis work consists in proposing a guide of good practices for the mechanical characterization of biofilm material. In the second part of this work, a methodology for tracking of micrometric particles within a living material is developed. The use of full field measurement method such as digital image correlation makes it possible to trace the kinematics of the motion of each particle, which is a probe of the local environment. This method is then applied to the study of the biofilm formation, by non-contact measurement. The originality of this work is based on the characterization of the change in the microbeads movement during the biofilm formation steps. The aim is to discriminate bead behaviours that reveal the genesis of a biofilm. By taking advantage of the observation of the movement of inert microbeads embedded into the bacterial environment, we detect changes of type of trajectories which seem to be correlated to the activity of sessiles bacteria, adhesion or formation of extracellular material. The results show that the various stages of the biofilm formation are characterized by a non-destructive test. Especially, It allows to appreciate the efficiency of an antibiotic. In the last part, research still in a development phase is presented. It concerns the behaviour of biofilm under mechanical solicitation. This involves observing the biofilm in the far field and following the displacement or deformation of a pattern consisting of an agglomerate of microbeads immersed in a magnetic field. This initial work can be used as a draft for future work to quantitatively characterize the biofilm material.

Les infections bactériennes lorsqu’elles se développent à partir d’implants sont très difficiles à traiter, l’issue courante étant un retrait pur et simple de l’implant incriminé. Dans ce cadre, les revêtements des biomatériaux ont un rôle important à jouer pour, d’une part, prévenir l’adhésion bactérienne et d’autre part, éliminer les bactéries présentes. Ces revêtements antibactériens doivent par ailleurs permettre une intégration tissulaire des biomatériaux aux cellules rencontrées sur le site de l’implantation. Dans ce travail une nouvelle famille de revêtements antibactériens a été développée. Ils contiennent et libèrent de manière contrôlée un agent bioactif. Ils sont constitués de multicouches de polymère plasma d'anhydride maléique déposées à la surface de fibres de polypropylène tressées et constituant le matériau à implanter. Entre chaque dépôt de polymère plasma (agissant comme couche barrière), des nanoparticules d'argent sont piégées formant ainsi des réservoirs d’agent antibactérien. En raison des différences de propriétés mécaniques entre les films minces plasma et le substrat massique élastique (i.e. tissu de fibre de polypropylène), la résistance à la traction génère des fissures dans les couches polymère plasma, qui sont utilisées comme canaux de diffusion pour les substances bioactives (dans notre cas les ions argent). Avant étirement, la libération spontanée des ions argent par simple diffusion aux travers des couches barrières peut être contrôlée en jouant sur le taux de réticulation des couches plasma. Au cours de l'étirement, le contrôle réversible de l'ouverture des fissures permet une libération maîtrisée des ions argent. Dans le domaine des textiles et d'autres biomatériaux souples, cette stratégie est prometteuse en raison des contraintes mécaniques qui se produisent naturellement sur le site de l'implantation.L'impact de différents types de procédures de stérilisation couramment utilisés (autoclave et irradiation par faisceau d’électrons) sur les propriétés du matériau développé a également été étudié. En particulier, l’incidence sur la chimie de surface, la dispersion des nanoparticules d'argent et la formation de fissures sous étirement a été regardée. La méthode de stérilisation par faisceau d’électrons permet de conserver les propriétés finales recherchées. Enfin, les propriétés antibactériennes du nouveau matériau ont été étudiées. L'effet du relargage des ions argent sur des bactéries Escherichia coli planctoniques, l'adhésion bactérienne et la formation de biofilm sur le système étiré et non-étiré a été évalué. L’intégrité membranaire des bactéries adhérées et des bactéries dans les biofilms a été suivie au cours de l'étude comme indicateur de l’état physiologique des bactéries. Les résultats ont suggéré que la sensibilité des bactéries aux concentrations faibles d'ions d'argent libérés aboutit à la formation de différents types de structures de biofilms sur les matériaux étudiés. L’ensemble des résultats obtenus donne une base solide pour le développement de matériaux intelligents capables de contrôler la libération du principe actif sur le site de l'infection. Nos résultats montrent qu’une faible dose d’argent peut suffire à contrôler l’infection en agissant sur la structure des biofilms formés. / Despite strict operative procedures to minimize microbial contaminations, bacterial infection of implants significantly raises postoperative complications of surgical procedures. One of the promising approaches is to adjust and control antimicrobial properties of the implant surface. New types of antibacterial coatings prepared via plasma polymer functionalization step have been developed. These coatings contain and release in a control way a bioactive agent. Controlled release was achieved by the fabrication of plasma polymer multilayer systems, which consist of two layers of Maleic Anhydride Plasma Polymer deposited on the surface of Polypropylene made surgical mesh. In between plasma polymer layers, silver nanoparticles are trapped as an antibacterial agent reservoir. Owing to differences between mechanical properties of the plasma-polymer thin films and the elastic bulk substrates, tensile strengths generate cracks within the plasma polymer, which might be used as diffusive channels for bioactive substances, here silver ions. The cracks can be controlled mechanically in a reversible way. The tailoring of the spontaneous release of bioactive agent is achieved by the modification of the second plasma polymer deposition conditions. In addition, during mechanical stimulation of the designed material, control over silver ion release is achieved through an elongation-dependent releasing process allowed by the reversible control of the cracks. In the field of textiles and other soft biomaterials, this strategy is promising due to the mechanical stresses that naturally occur at the implant location. In regard of possible application of the developed system as a future biomaterial, the impact of different types of commonly used sterilization procedures on the properties of developed material was studied. The effects of autoclaving and electron beam sterilization methods on the surface chemistry, the dispersion of embedded silver nanoparticles in the plasma polymer and the cracks formation of the developed material was verified. Results showed the compatibility of the developed system with electron beam sterilization method. The antibacterial properties of the new material have been evaluated. The effect of developed system on planktonic bacteria, bacterial adhesion and biofilm formation on stretched and unstretched system was studied. The membrane integrity of the adhered bacteria and bacteria in biofilms was followed during the study as an indicator of the physiologic state of bacteria. Results suggested that the sensitivity of bacteria to low concentrations of released silver ions resulted in the formation of different types of structures of the biofilms on the studied materials. The results give a strong base on the future of intelligent, silver containing materials that control the release at the site of infection. Our results show that low doses of silver may be sufficient to control infection by acting on the structure of bacterial biofilms.