<p>Mutations of the FOXP2 gene impair speech and language development in humans and shRNA-mediated suppression of the avian orthologue FoxP2 disrupts song learning in juvenile zebra finches. How diminished FoxP2 levels affect vocal control and alter the function of neural circuits important to learned vocalizations remains unclear. Using a combination of behavioral analysis, in vivo intracellular recordings in anaesthetized birds, pharmacology and extracellular recordings in singing birds, I addressed how FoxP2 knockdown in songbird striatum affects vocal control and signal propagation through circuits important for the control of learned vocalizations. In summary, I found that FoxP2 knockdown in the songbird striatum disrupts developmental and social modulation of song variability. Recordings in anaesthetized birds show that FoxP2 knockdown interferes with D1R-dependent modulation of activity propagation in a corticostriatal pathway important to song variability, an effect that may be partly attributable to reduced D1R and DARPP-32 protein levels. Furthermore, recordings in singing birds reveal that FoxP2 knockdown prevents social modulation of singing-related activity in this pathway. These findings show that reduced FoxP2 levels interfere with the dopaminergic modulation of vocal variability, which may impede song and speech development by disrupting reinforcement learning mechanisms.</p> / Dissertation

The genetic contribution to the aetiology of psychiatric illness is well-established; however, few variants that alter the encoded protein have been irrefutably identified as causative, leading to the hypothesis that variants affecting gene regulation may play a pathogenic role. This thesis focuses on two genes, Neuregulin 1 (NRG1) and Disrupted in Schizophrenia 1 (DISC1), for which there is strong genetic evidence for involvement in psychiatric illness, as well as evidence for altered expression in patients. Association analysis was carried out to assess the involvement of six intronic NRG1 single nucleotide polymorphisms (SNPs) in schizophrenia and bipolar disorder in two independent samples from the Scottish (Scottish 2; n = 307 control subjects, 303 schizophrenic patients, and 239 bipolar disorder patients and German populations (n = 397 control subjects, 396 schizophrenic patients, and 400 bipolar disorder patients). These SNPs form two haplotypes, one encompassing the 5’ and promoter region of the gene and the other located at the 3’ end of the gene, that were previously associated with schizophrenia and bipolar disorder in a Scottish sample (Scottish 1). The location of these haplotypes, together with the prior evidence for altered NRG1 expression in schizophrenia, suggested the potential involvement of regulatory variants. On combining the Scottish 1 and Scottish 2 samples (combined n = 765 control subjects, 682 schizophrenic patients and 601 bipolar disorder patients), a two- SNP haplotype spanning both coding and non-coding regions in the 3’ region was associated with schizophrenia (p = 0.0037, OR=1.3, 95% CI: 1.1-1.6) and the combined schizophrenia and bipolar disorder case group (p = 0.0080, OR=1.2, 95% CI: 1.1-1.5), with both these associations remaining significant after permutation analysis (p = 0.022 and p = 0.044, respectively). To further understanding of how DISC1, a leading candidate gene for schizophrenia that has also been implicated in other psychiatric disorders, is regulated the previously uncharacterised promoter region was assessed both bioinformatically and in vitro using the dual luciferase reporter assay. The region was found to lack canonical promoter motifs but to contain a CpG island, consistent with DISC1’s ubiquitous pattern of expression. A region located 300bp to -177bp relative to the transcription start site (TSS) was identified as contributing positively to DISC1 promoter activity, whilst a region -982bp to -301bp relative to the TSS was found to confer a repressive effect. FOXP2, a transcription factor which is mutated in a rare speech and language disorder and implicated in autism pathogenesis, was found to repress transcription from the DISC1 promoter. Two pathogenic FOXP2 point mutations reduced this transcriptional repression. Preliminary evidence for a bi-directional regulatory relationship between DISC1 and FOXP2 was observed: a mouse model of schizophrenia that carries a Disc1 L100P amino acid substitution and shows altered developmental Disc1 expression was also found to show altered developmental expression of Foxp2. These results further understanding of two genes whose altered expression might contribute to the pathogenesis of psychiatric illness.

Die KE-Familie ist das am ausführlichsten untersuchte Beispiel für eine angeborene spezifische Sprachstörung. Die Sprachstörung in dieser Familie wird durch eine heterozygote Punktmutation im FoxP2-Gen hervorgerufen, die R553H-Mutation. Die betroffenen Mitglieder der Großfamilie haben Defizite beim Erlernen komplexer orofazialer Bewegungsabläufe als Grundlage des fließenden Sprechens und zeigen Störungen beim Sprachverständnis und beim Schreiben. Untersuchungen an der KE-Familie und an Knockout-Tieren hatten Hinweise auf eine Beteiligung des Kleinhirns an der Sprachstörung der KE-Familie geliefert. Entsprechend war zu erwarten, dass genauere Kenntnisse über den Einfluss vom FoxP2-Gen auf Entwicklung und Funktion des Kleinhirns helfen könnten, die Funktion von FoxP2 und seine Rolle bezüglich dieser Sprachstörung, aber auch in Hinblick auf die Sprachfähigkeit des Menschen weiter aufzuschlüsseln. Die Experimente, die der vorliegenden Promotionsarbeit zu Grunde liegen, erforschten erstmals den Einfluss der KE-Mutation im FoxP2-Gen auf synaptischer Ebene durch Untersuchungen am in der Literatur ausführlich beschriebenen erregenden Schaltkreis im Kleinhirnkortex von heterozygoten R552H-Mäusen. Elektrophysiologische Messungen dienten dazu, die Verschaltung der Parallelfasern und Kletterfasern auf die Purkinjezelle auf Veränderungen der Übertragungseigenschaften zu prüfen. Durch Induktion von Langzeitdepression und Paarpulsbahnung an der Parallelfaser-Purkinjezell-Synapse sollte die synaptische Plastizität untersucht werden. Es zeigten sich eine intakte Verschaltung der erregenden Eingänge auf die Purkinjezelle, jedoch Veränderungen der Langzeit- und der Kurzzeitplastizität: Nach Induktion von Langzeitdepression entwickelte sich diese signifikant schneller. Die Paarpulsbahnung war bei kurzen Interstimulusintervallen signifikant verstärkt. Die Befunde sprechen für einen Einfluss des FoxP2-Gens auf die synaptischen Eigenschaften im Kleinhirnkortex. Die Aufschlüsselung dieses Einflusses und seine Bedeutung für die Sprachstörung der KE-Familie und die Sprachentwicklung beim Menschen ist Gegenstand weiterer Forschung.

Des mutations du gène Foxp2 constituent le premier exemple connu de cause monogénique de troubles de la parole et du langage. Les individus atteints souffrent de difficultés d’articulation (dyspraxie verbale) mais aussi de perturbations du langage parlé et écrit, ce qui indique la présence d’un trouble cognitif. La séquence et la distribution d’expression de ce gène sont remarquablement conservées parmi les vertébrés.Cette thèse visait principalement à identifier les fonctions du facteur de transcription Foxp2 dans le cortex en caractérisant un modèle murin conditionnel dans lequel ce gène a été spécifiquement inactivé dans les neurones corticaux. Ce modèle murin permet ainsi d’étudier certains aspects des pathologies liées à Foxp2, notamment les aspects de communication et les comportements sociaux. En parallèle, j’ai entrepris, sur un autre modèle murin, des études moléculaires afin d’identifier les gènes perturbés par la réduction de l’expression de Foxp2 dans le cortex. L‘ensemble des résultats présentés suggère que l’inactivation de Foxp2 dans le cortex conduit à des défauts subtils des comportements sociaux sans modification majeure de la morphologie du cortex ou des neurones. Je montre en particulier que les souris mutées présentent des changements de vocalisation ultrasonique lors d’interactions entre mâles et femelles. Par ailleurs, en utilisant un modèle de souris hétérozygote pour une mutation dans Foxp2, j’ai identifié parmi les gènes dérégulés le gène Mint2 déjà impliqué chez l’homme dans l’autisme.En conclusion, ces résultats permettront de mieux comprendre le rôle de Foxp2 au niveau cortical chez les souris pour décrypter les mécanismes moléculaires qui ont été sélectionnés chez l’homme pendant l'évolution de la parole et du langage. / Genetic disruptions of the forkhead box transcription factor FOXP2 in humans cause a severe autosomal-dominant speech and language disorder. FOXP2 expression pattern and genomic structure are highly conserved in distant vertebrates. We hypothesized that this conservation may allow the use of animal models to identify Foxp2 dependent neuronal circuits and molecular networks involved in social behaviors. Therefore I began characterizing Foxp2 functions in the mouse cortex in conventional heterozygous (Foxp2+/-) and conditional (cortex specific) Foxp2 homozygous mutant mice (Nex-Cre; Foxp2lox/lox). Initial characterization of Nex-Cre; Foxp2lox/lox mice revealed no gross alterations in morphological architecture, postnatal development and basic adult behaviors. However, behavioral profiling of Nex-Cre; Foxp2lox/lox mice demonstrated deficiency in specific social behaviors such as approach behavior towards conspecifics and responses of WT interaction partners. Furthermore, Nex-Cre; Foxp2lox/lox mice showed alterations in specific acoustical parameters of ultrasonic vocalizations (USV), and the type of modulation differed in function of social context. Gene expression profiling of Foxp2-positive cortical pyramidal neurons in Foxp2+/- mice revealed the dysregulation of Mint2, a gene involved in approach behavior in mice and autism spectrum disorder in humans. This result was further validated in cortex-specific Foxp2 mutant mice The results deliver first insights into cortical Foxp2 dependent functions in mouse social behaviors. This provides a rational basis for further mechanistic studies of the ancestral functions of cortical Foxp2 that may have been recruited during speech and language evolution.

Die KE-Familie ist das am ausführlichsten untersuchte Beispiel für eine angeborene spezifische Sprachstörung. Die Sprachstörung in dieser Familie wird durch eine heterozygote Punktmutation im FoxP2-Gen hervorgerufen, die R553H-Mutation. Die betroffenen Mitglieder der Großfamilie haben Defizite beim Erlernen komplexer orofazialer Bewegungsabläufe als Grundlage des fließenden Sprechens und zeigen Störungen beim Sprachverständnis und beim Schreiben. Untersuchungen an der KE-Familie und an Knockout-Tieren hatten Hinweise auf eine Beteiligung des Kleinhirns an der Sprachstörung der KE-Familie geliefert. Entsprechend war zu erwarten, dass genauere Kenntnisse über den Einfluss vom FoxP2-Gen auf Entwicklung und Funktion des Kleinhirns helfen könnten, die Funktion von FoxP2 und seine Rolle bezüglich dieser Sprachstörung, aber auch in Hinblick auf die Sprachfähigkeit des Menschen weiter aufzuschlüsseln. Die Experimente, die der vorliegenden Promotionsarbeit zu Grunde liegen, erforschten erstmals den Einfluss der KE-Mutation im FoxP2-Gen auf synaptischer Ebene durch Untersuchungen am in der Literatur ausführlich beschriebenen erregenden Schaltkreis im Kleinhirnkortex von heterozygoten R552H-Mäusen. Elektrophysiologische Messungen dienten dazu, die Verschaltung der Parallelfasern und Kletterfasern auf die Purkinjezelle auf Veränderungen der Übertragungseigenschaften zu prüfen. Durch Induktion von Langzeitdepression und Paarpulsbahnung an der Parallelfaser-Purkinjezell-Synapse sollte die synaptische Plastizität untersucht werden. Es zeigten sich eine intakte Verschaltung der erregenden Eingänge auf die Purkinjezelle, jedoch Veränderungen der Langzeit- und der Kurzzeitplastizität: Nach Induktion von Langzeitdepression entwickelte sich diese signifikant schneller. Die Paarpulsbahnung war bei kurzen Interstimulusintervallen signifikant verstärkt. Die Befunde sprechen für einen Einfluss des FoxP2-Gens auf die synaptischen Eigenschaften im Kleinhirnkortex. Die Aufschlüsselung dieses Einflusses und seine Bedeutung für die Sprachstörung der KE-Familie und die Sprachentwicklung beim Menschen ist Gegenstand weiterer Forschung.

Le réseau des ganglions de la base (GB) est un ensemble de structures sous corticales, dont la principale fonction est le contrôle du mouvement volontaire. Le Globus Pallidus (GP), équivalent du GPe chez le primate, est un noyau constitué exclusivement de neurones GABAergiques, qui joue un rôle clé dans le fonctionnement des GB de par ses projections inhibitrices diffuses sur l’ensemble des structures de ce macrocircuit. Bien qu’une diversité neuronale au sein du GP ait été suggérée sur les bases de l’origine embryonnaire, de l’expression de protéines spécifiques ou encore de l’activité électrique des neurones, ces différents paramètres n’ont pas été corrélés de manière claire. Notre premier objectif a donc été de corréler les propriétés membranaires de neurones du GP enregistrés en patch-clamp sur des tranches de cerveau de rat avec l’expression spécifique de deux marqueurs neuronaux : une protéine liant le calcium, la parvalbumine (PV) ou un facteur de transcription, Forkhead Box 2 (FoxP2). Nous avons observé des différences électrophysiologiques significatives entre les neurones PV-positifs et FoxP2-positifs. Ce résultat nous a amené à formuler l’hypothèse qu’ayant des propriétés distinctes, les neurones PV-positifs et FoxP2-positifs pouvaient être connectés de manière différente au sein du réseau des ganglions de la base. Nous avons donc réalisé des expériences de traçage neuronal in vivo afin d’identifier les structures cibles de chaque sous-population. Nous montrons que les neurones PV-positifs projettent sur les structures de sortie des ganglions de la base tandis que les neurones FoxP2-positifs projettent uniquement sur le striatum. Enfin, le GP étant majoritairement composé de neurones PV-positifs, nous avons décidé de manipuler spécifiquement l’activité électrique de cette population in vitro et in vivo grâce à l’optogénétique. Nous présentons des résultats montrant que la modulation de l’activité électrique des neurones PV-positifs modifie le comportement moteur chez l’animal vigile. Nos résultats d’immunohistochimie et d’électrophysiologie in vitro démontrent pour la première fois l’existence d’une diversité neuronale au sein du GP. Nos expériences constituent la première étude du rôle des neurones PV-positifs dans le contrôle du mouvement volontaire. / Globus Pallidus (GP in Rodents; GPe in Primates) which belongs to the indirect pathway of basal ganglia is often, if not always, considered as an homogeneous entity which simply relays striatal information through the subthalamic nucleus, downstream to the output of basal ganglia, the substantia nigra pars reticulata. Prototypical GP neurons are often described as fast-spiking GABAergic cells which express parvalbumin (PV) as a neurochemical marker. However, cellular heterogeneity in GP has been suggested by anatomical, neurochemical, fate mapping analysis and electrophysiological activity in vivo but a clear demonstration of the existence of distinct cell types in GP, which requires by definition correlation of electrophysiological activity with neurochemistry and structure, is still missing. The objective of my PhD was i) to determine if the expression of specific neuronal markers in GP neurons is correlated with specific electrophysiological properties, ii) to understand the function of identified cell types in motor control, in order to prove that neuronal diversity exists and matters in GP. We show that electrical activity and repertoire of ionic channels differ in PV-positive and FoxP2-positive neurons. We demonstrate that PV-positive neurons do project on downstream structures whereas FoxP2-positive neurons exclusively target striatum. We report that manipulating PV-positive neurons using optogenetics induce changes in motor behavior. Thus, our results contribute to highlight the function of GP in motor control.