Orientador: Maria Denise Lopes / Banca: Frederico Ozanan Papa / Banca: Gilson Hélio Toniollo / Banca: Isabel Candia Nunes da Cunha / Banca: Fabiana Ferreira de Souza / Resumo: A inseminação artificial (IA) utilizando sêmen congelado é uma ferramenta importante na reprodução de cães, visa o melhoramento genético e melhor aproveitamento do reprodutor. Além disso, a melhor metodologia para avaliar o potencial fecundante de uma amostra de sêmen é o teste in vivo. Por isso, os objetivos deste trabalho foram determinar a taxa de gestação de cadelas, utilizando sêmen congelado em meio diluente TRIS/OEP/Frutose/8%Glicerol, e comparar duas técnicas de IA: intra-uterina, por laparotomia e intravaginal. O sêmen foi colhido de um único macho, por manipulação digital do pênis e analisado, imediatamente, após a colheita e após a descongelação a 70°C, por 8 segundos. A cinética do movimento foi verificada pelo CASA (Computer Assisted Semen Analyzer), e a integridade das membranas por: sondas fluorescentes (iodeto de propídio e carboxifluoresceína), pelo teste supra vital com a coloração de eosina, e pela associação de sondas (iodeto de propídio, JC-1 e FITC-PSA). A morfologia espermática foi avaliada por meio de esfregaços corados com Karras. A congelação do sêmen foi realizada pelo método descrito por Chirinéa et al. (2006). As fêmeas foram monitoradas desde o início da fase do proestro utilizando a citologia vaginal seriada e a dosagem de progesterona sérica, a cada 48 horas. Para as inseminações, as cadelas foram divididas em dois grupos: Grupo 1 (n=6) inseminadas uma única vez, via intra-uterina, por laparotomia, com uma dose inseminante de 160 x 106 espermatozóides/2mL; e Grupo 2 (n=6) inseminadas duas vezes, via intravaginal com uma dose inseminante de 160 x 106 espermatozóides/2 mL por inseminação. Os resultados das análises do sêmen pré e pós-descongelação não apresentaram diferenças significativas, com exceção da morfologia espermática e da associação de sondas fluorescentes... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Artificial insemination (AI) using frozen semen is an important tool on dog's reproduction, aiming to genetic improvement and better use of a stud. Besides, the better way to evaluate the fecundate potential of a semen sample is an in vivo test. That way, the aim of this work was to determine the pregnancy rate in bitches, using TRIS/OEP/Fructose/8%Glycerol as the diluent medium, and to compare two AI techniques: intrauterine and intravaginal. Semen was collected from one male only, by digital manipulation. Semen was analyzed immediately after collection and after thawed at 70°C for 8 seconds. Movement kinetics were analyzed by CASA (Computer Assisted Semen Analyzer), membrane integrity using fluorescents probes (propidium iodide and carboxyfluorescein), supravital test, eosin staining, integrity of plasmatic, nuclear and mitochondrial membranes using the association of fluorescent probes (FITC-PSA, propidium iodide and JC-1) and sperm morphology. Semen was frozen using the method described by Chirinéa, 2006. Females were monitored since the beginning of proestrus, using vaginal smear and progesterone measurement, each 48hours. To inseminations, bitches were divided into two groups: Group 1, composed by 6 females, which were inseminated just once via intrauterine, with an insemination dose of 160 x 106 spermatozoids/2mL and Group 2 constituted by 6 females, which were inseminated twice, via intravaginal, using an insemination dose of 160 x 106 spermatozoids/2 mL/insemination. Results from semen analyses made before and after freezing did not show any difference, except for sperm morphology and association of fluorescents probes. Pregnancy rate was 66,6% (4/6) on Group 1 and 16,6% (1/6) on Group 2. In conclusion, the success of artificial insemination depends not only on semen quality after thawed, but also on the AI technique used. In our work, intrauterine technique by laparotomy was better than intravaginal. / Doutor

Orientador: Marco Antonio Alvarenga / Banca: Marco Antonio Alvarenga / Resumo: Em eqüinos existe um grande interesse em se desenvolver e aprimorar técnicas de inseminação artificial que possibilitam a obtenção de bons índices de fertilidade utilizando um baixo número de espermatozóides. O presente trabalho teve como objetivos avaliar: 1) a viabilidade, in vitro, do sêmen congelado de garanhões após a diluição em fluido folicular pré-ovulatório de éguas; 2) a população espermática no oviduto de éguas, utilizando diferentes técnicas de inseminação; 3) a fertilidade de éguas após a utilização de diferentes técnicas de inseminação artificial, utilizando um baixo número de espermatozóides; 4) a reação inflamatória na cavidade peritoneal após as inseminações intrafoliculares e intraperitoneais; 5) averiguar o efeito da presença de espermatozóides dentro do folículo pré-ovulatório, na capacidade de fertilização do oócito. No experimento 1 foram realizadas análises laboratoriais da viabilidade espermática, de sêmen congelado de garanhões sem diluição (GI), diluído em Kenney (GII) e diluído em fluido folicular (GIII). Observou-se que porcentagem de espermatozóides com membrana plasmática íntegra não diferiu significativamente entre os grupos (p>0,05). Também não foi observado diferença estatística (p>0,05) entre os grupos na porcentagem de espermatozóides vivos com membrana acrossomal íntegra. A motilidade total foi significativamente inferior (p<0,05) no grupo em que o sêmen foi diluído em fluido folicular (GIII) apenas no primeiro momento, logo após a diluição (T0). A motilidade progressiva foi significativamente maior (p<0,05) no grupo diluído com Kenney (GII) do que nos demais grupos em T0 e três horas após (T3). A velocidade espermática ao longo de uma trajetória média (VAP) foi significativamente maior (p<0,05) em GIII do que em GI nos momentos T0, após uma (T1) e duas horas (T2) da diluição. / Abstract: The objective of the present study was to evaluated the viability, in vitro, of stallion frozen semen after dilution in mare's pre-ovulatory follicular fluid; assess sperm population in mares's oviduct using differents artificial insemination techinics; verify the fertility of of differents artificial insemination techinics in mares with low sperm number; assess if mares develop an inflamatory reaction in the peritoneal cavity after intraperitoneal and intrafollicular insemination and to verify if the presence of sperm in pre-ovulatory follicle could interfere on oocyte fertilization capacity. In experiment 1, frozen-thawed semen viability was evaluated without dilution (GI) and after dilution with Kenney or Mare's pre-ovulatory follicular fluid. The percentage of sperm with plasmatic membrane integrity was not different between the groups (p>0,05). No statistical difference (p>0,05) was observed between the groups in percentage of live sperm with intact acrosome. Total motility (MT) was significantly lower (p<0,05) in follicular fluid group (GIII) just in the first moment (T0). Progressive motility was significantly higher (p<0,05) in group diluted with Kenney (GII) than the other groups in T0 and 3 hours after (T3). Average path velocity (VAP) was significantly higher (p<0,05) in GIII than GI in moments T0, T1 and T2. Straight line velocity (VSL), curvilinear velocity (VCL) and Beat cross frequence (BCF) were significantly lower (p<0,05) in GI in moments T0, T1 and T2, when compared with GIII. No statistical difference (p>0,05) were observed in amplitud of lateral head (ALH), straightness (STR) and percentage of sperm with linear (LIN) and rapid (RAP) movement between GI and GIII in any moment. In T3 no statistical difference was observed (p>0,05) between all groups in any motility parameters analyzed. / Doutor

Orientador: Frederico Ozanam Papa / Resumo: O presente estudo objetivou a colheita do sêmen de garanhões nos haras, diluição e transporte destas amostras em dois sistemas de refrigeração (Equitainerâ e Max-Semen Expressâ) para os centros especializados onde foram submetidos ao processo de congelação. No Experimento I foi utilizado 01 ejaculado de 12 garanhões de diferentes raças. Após a colheita os ejaculados foram divididos em duas alíquotas: uma submetida ao processo de congelação convencional, utilizando o meio diluidor Botu-Crioâ e outra diluída com Botu-Semenâ e armazenada em Equitainerâ durante 24h. Após a refrigeração o sêmen foi centrifugado e ressuspendido com Botu-Crioâ e submetidas ao processo de congelação. As amostras descongeladas foram analisadas pelo CASA e a integridade de membrana plasmática pelo uso de sondas fluorescentes. Os resultados do Experimento I mostraram que não houve diferença nos parâmetros avaliados (motilidade total, progressiva e integridade da membrana plasmática) entre a metodologia convencional e a congelação de sêmen após 24h de refrigeração (p>0,05). No Experimento II, foi utilizado 01 ejaculado de 11 garanhões, os quais foram diluídos e armazenados em dois sistemas de transporte (Equitainerâ e Max-Semen Expressâ) durante 24h. As amostras foram congeladas, conforme descrito no Experimento I utilizando-se a associação do glicerol com dimetilacetamida, dimetilformamida e metilformamida. Após a descongelação a análise dos parâmetros espermáticos demonstrou a superioridade do Equitainerâ em relação ao Max-Semen Expressâ (p<0,05). A metilformamida associada ao glicerol apresentou resultados superiores aos demais crioprotetores utilizados . O teste de fertilidade comparou amostras congeladas de dois garanhões (A e B) pelos métodos: convencional e pós-refrigeração em Equitainer por 24h.... (Resumo complet, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of the present study was to develop a new method to freeze equine semen. Semen was collected at the stallion farm, diluted, divided into two samples and cooled at Equitainer® or Max-Semen Express®, then transported to an equipped laboratory for freezing. On Experiment I used one ejaculate from each of 11 stallions from different breeds. The ejaculates were divided into two parts: one was frozen following a regular protocol and the other was diluted with Botu-Semen® and stored at Equitainer® for 24 hours. Afterwards, cooled semen was centrifuged and ressuspended with Botu-Crio® and then frozen. After thawing motility was evaluated by CASA and by fluorescent probes for plasma membrane integrity evaluation. Based on these results of Experiment I concluded that there was no difference between total motility, progressive motility and plasma membrane integrity when comparing the two methods for freezing semen (p>0,05). At Experiment II one ejaculate from each of 11 stallions was collected, diluted and stored either an Equitainer® or in a Max-Semen Express® for 24 hours. The samples were frozen as described on Experiment I using the association of glycerol with dimethylformamide, dimethylacetamide and methylformamide. After thawing the results suggested that the Equitainer® was better than Max-Semen Express® in maintaining sperm viability (p>0,05). The association of metilformamida and glycerol was superior to the others. Fertility trials compared the two methods: conventional and cooled/frozen semen. Ten mares were inseminated in a total of 40 cycles; the mares were monitorated every day by ovarian ultrasonography. Ovulation was induced using 10mg EPE (equine pituitary extract) intravenously when a follicle of 35mm of diameter was detected. Inseminations were performed twice, before and after ovulation with 350x106 spermatozoa/mL toward the tip of the horn.... (Complete abstract, access undermentioned electronic address) / Mestre