A degradação de quitina é importante para o remodelamento da parede celular em fungos filamentosos e crucial para o rompimento da cutícula de hospedeiros artrópodes durante a infecção de fungos entomopatogênicos. Além disso a quitina é uma importante fonte nutricional. Para que a quitina possa ser eficientemente utilizada, a atividade de b-Nacetilglicosaminidases (NAGases) deve estar presente. Após a ação de quitinases sobre a quitina, gerando dímeros de N-acetilglicosamina (GlcNAc)2, NAGases hidrolisam suas ligações β-1-4 produzindo GlcNAc livre. Fungos filamentosos possuem, em média, 15 a 25 quitinases, mas somente duas NAGases, o que leva a questões sobre a real importância destas enzimas. Em escala genômica, foram identificadas no fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae duas NAGases da família GH20 (MaNAG1 e MaNAG2) e duas NAGases da família GH3 (MaNAG3 e MaNAG4) das glicosil hidrolases. Análises filogenéticas sugerem subsequentes duplicações ocorrendo principalmente no clado de MaNAG2, resultando na presença de ortólogos em um amplo espectro de ascomicetos com diferentes estilos de vida. MaNAG1 agrupou majoritariamente com espécies entomopatogênicas. MaNAG3 e MaNAG4 apresentaram alta similaridade de sequências e conservação de domínios com NAGases GH3 de bactérias O perfil transcricional dos genes das NAGases GH20 e GH3 foi avaliado por qPCR, em oito diferentes condições de cultivo, representando diferentes estágios de desenvolvimento ou diferentes estados nutricionais. As NAGases apresentaram perfis de transcrição diferenciais em resposta às diferentes condições, indicando a ausência de um padrão de regulação gênica em comum. Os perfis de expressão variáveis também sugerem que elas não devem possuir funções totalmente redundantes. Ensaios de transcrição relativa mostraram a indução da expressão de MaNAG1, MaNAG2 e MaNAG4 por quitina 1%, enquanto MaNAG3 foi induzida em meio suplementado com GlcNAc 0,25%. As relações evolutivas de MaNAG3 e MaNAG4 e a regulação de suas expressões por substratos quitinosos são a primeira evidência do envolvimento de NAGases GH3 em processos celulares fisiológicos em ascomicetos, apontando para sua potencial relevância na diferenciação celular durante o ciclo de vida de M. anisopliae. Com o objetivo de avançar no estudo funcional das NAGases de M. anisopliae, foram gerados vetores para a construção de mutantes nulos para os quatro genes de NAGases e linhagens transformantes foram obtidas utilizando-se a metodologia de transformação de fungos mediada por Agrobacterium tumefaciens. / Chitin degradation is important for filamentous fungi cell wall remodeling and, in entomopathogenic fungi, this process is pivotal for breaching the arthropod host cuticles during infection. Chitin is an important nutrient and to be efficiently used, β-Nacetylglucosaminidases (NAGases) activity must be present. After chitinase action on chitin generating N-acetylglucosamine dimers (GlcNAc)2, NAGases hydrolyze theirs β-1-4 linkages producing free GlcNAc. Filamentous fungi have between 15 to 25 chitinases, but only two NAGases; then, questions arise about the actual importance of these enzymes. On a genomic scale, were identified in the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae two GH20 NAGases (MaNAG1 and MaNAG2) and two GH3 NAGases (MaNAG3 and MaNAG4) from glycoside hydrolases. Phylogenetic analysis suggested subsequent duplications occurring mainly in MaNAG2 clade, resulting in ortholog clusters in several ascomycetes with a broad range life style. MaNAG1 clusters mostly with entomopathogenic species clades. MaNAG3 and MaNAG4 showed high sequence similarity and domain conservation with bacterial GH3 NAGases Transcriptional profiles of GH20 and GH3 NAGase genes were evaluated by qPCR from eight culture conditions, representing different stages of development and different nutritional states. NAGases showed differential transcript profiles in response to different conditions, indicating an absence of a common gene regulation pattern. The variable expression profiles also suggest they may not have totally redundant roles. Relative transcription assays showed MaNAG1, MaNAG2 and MaNAG4 expression induction by chitin 1%, while MaNAG3 was induced in medium supplemented with GlcNAc 0.25%. Evolutionary relationships of MaNAG3 and MaNAG4 and their expression regulated by chitinous substrates are the first evidence of GH3 NAGases involvement in physiological cell process in entomopathogenic fungi, therefore, pointing to potential relevance on cell differentiation during M. anisopliae life cycle. In order to proceed on functional studies of M. anisopliae NAGases, vectors were constructed to produce knockout mutants for four NAGases genes and transformant strains were obtained by using fungi transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens.

Metarhizium anisopliae é um fungo entomopatogênico usado como agente de controle biológico devido a sua capacidade de infectar mais de 300 espécies de artrópodes. É um organismo muito utilizado como modelo de estudo de interação patógeno-hospedeiro sendo um dos focos de estudo a descrição de genes envolvidos no processo de infecção pela construção de mutantes funcionais. Esse processo pode ser facilitado pelo uso da metodologia do sistema CRISPR/Cas9 para manipulação genômica, que foi derivada do sistema imune adaptativo de procariotos que vem demonstrando potencial tecnológico em edição genética de eucariotos pela incorporação de protoespaçadores (sequencias oriundas de bacteriófagos ou plasmídeos invasores) em seus loci. CRISPR e a proteína associada à CRISPR (Cas) formam uma endonuclease guiada (Cas9) a qual tem como alvo o sítio específico do DNA invasor, provocando a clivagem da dupla fita do DNA alvo em uma sequência específica. Muitos estudos realizados pela edição gênica têm sido desenvolvidos em diferentes organismos por meio da sua adaptação em eucariotos. Com o objetivo de melhorar a eficiência na geração de mutantes em em M. anisopliae, o sistema CRISPR/Cas9 e um sistema de RNAi foram usados a fim de desenvolver novas ferramentas. As metodologias CRISPR/Cas9 e RNAi foram desenvolvidas para ter como alvo o gene reporter gfp da linhagem M. anisopliae E6 GFP+. Para realizar a edição genômica em M. anisopliae, foram gerados, por transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens, fungos transgênicos estáveis que expressam a endonuclease Cas9 códon-otimizada para fungos filamentosos. Oligonucleotídeos foram projetados para ter como alvo quatro regiões diferentes na sequencia do gene gfp com o auxílio da ferramenta CRISPR RGEN tool com o objetivo de evitar o pareamento aleatório. O vetor binário utilizado foi o plasmídeo pPZP com o promotor U6-1 para a expressão do RNA guia. Para a metodologia de RNA interferente foi reproduzido o knockdown do gene repórter gfp por meio de agrotransformação do vetor pPZP::SUR::DP que contém um sistema de dois promotores em direções opostas (dual promoter Pdgp e Ptrpc) e um cassette de expressão com o gene marcador sur (resistência a sulfoniluréia) para a seleção dos transformantes. Foram clonados 420 pares de bases do gene gfp entre os promotores gerando o plasmídeo pPZP::SUR::DP::GFP. O desenvolvimento dessas duas metodologias se mostra viável para análise funcional de genes de M. anisopliae. / Metarhizium anisopliae is an entomopathogenic fungus used as a biological control agent due to its capacity to infect more than three hundred species of arthropods. It is broadly used as a model to the development of host-pathogen interaction studies, including the study of the description of the involved genes in the infection process by the construction of functional mutants. This process may be facilitated by the use of the CRISPR/Cas9 methodology to genomic manipulation, which was derived from the immune adaptive system in prokaryotes and has demonstrated technological potential in genetic of eukaryotes edition through the activity of incorporation of protospacers (sequences arising from bacteriophages or plasmids invaders) in their loci. CRISPR and CRISPR associated protein (Cas) code a guided nuclease (Cas9) that targets a specific site of the invading DNA leading to breakage of double-stranded target DNA in a specific sequence. Multiple gene editing studies have been developed in different organisms including its adaptation to eukaryotes. In order to improve the efficiency of the generation of mutants in M. anisopliae, CRISPR/Cas9 system and a RNAi system were used in order to develop new tools. Both CRISPR/Cas9 and RNAi methodologies were developed having as a target the gfp gene from M. anisopliae E6 GFP+ strain. To perform genome editing in M. anisopliae, stable transgenic fungi that express fungal codon-optimized Cas9 were generated by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Oligonucleotides were designed to target four different regions along the gfp gene by using the CRISPR RGEN tool in order to avoid off-targets. The binary vector was the pPZP plasmid with the U6-1 to RNAi expression. For RNAi analysis, gene knockdown were developed by agrotransformation with a suitable plasmid (pPZP::SUR::DP) containing dual promoters with opposite directions (Pdgp and Ptrpc) and a cassette for the expression of the selective marker (gene sur, conferring sulfonylurea resistance) for the selection of transformants. The 420 bp gfp sequence was cloned between promoters, obtaining thus the plasmid pPZP::SUR::DP::GFP. The development of these two techniques proves itself viable for functional analysis of M. anisopliae genes.

Metarhizium anisopliae é um fungo entomopatogênico usado como agente de controle biológico devido a sua capacidade de infectar mais de 300 espécies de artrópodes. É um organismo muito utilizado como modelo de estudo de interação patógeno-hospedeiro sendo um dos focos de estudo a descrição de genes envolvidos no processo de infecção pela construção de mutantes funcionais. Esse processo pode ser facilitado pelo uso da metodologia do sistema CRISPR/Cas9 para manipulação genômica, que foi derivada do sistema imune adaptativo de procariotos que vem demonstrando potencial tecnológico em edição genética de eucariotos pela incorporação de protoespaçadores (sequencias oriundas de bacteriófagos ou plasmídeos invasores) em seus loci. CRISPR e a proteína associada à CRISPR (Cas) formam uma endonuclease guiada (Cas9) a qual tem como alvo o sítio específico do DNA invasor, provocando a clivagem da dupla fita do DNA alvo em uma sequência específica. Muitos estudos realizados pela edição gênica têm sido desenvolvidos em diferentes organismos por meio da sua adaptação em eucariotos. Com o objetivo de melhorar a eficiência na geração de mutantes em em M. anisopliae, o sistema CRISPR/Cas9 e um sistema de RNAi foram usados a fim de desenvolver novas ferramentas. As metodologias CRISPR/Cas9 e RNAi foram desenvolvidas para ter como alvo o gene reporter gfp da linhagem M. anisopliae E6 GFP+. Para realizar a edição genômica em M. anisopliae, foram gerados, por transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens, fungos transgênicos estáveis que expressam a endonuclease Cas9 códon-otimizada para fungos filamentosos. Oligonucleotídeos foram projetados para ter como alvo quatro regiões diferentes na sequencia do gene gfp com o auxílio da ferramenta CRISPR RGEN tool com o objetivo de evitar o pareamento aleatório. O vetor binário utilizado foi o plasmídeo pPZP com o promotor U6-1 para a expressão do RNA guia. Para a metodologia de RNA interferente foi reproduzido o knockdown do gene repórter gfp por meio de agrotransformação do vetor pPZP::SUR::DP que contém um sistema de dois promotores em direções opostas (dual promoter Pdgp e Ptrpc) e um cassette de expressão com o gene marcador sur (resistência a sulfoniluréia) para a seleção dos transformantes. Foram clonados 420 pares de bases do gene gfp entre os promotores gerando o plasmídeo pPZP::SUR::DP::GFP. O desenvolvimento dessas duas metodologias se mostra viável para análise funcional de genes de M. anisopliae. / Metarhizium anisopliae is an entomopathogenic fungus used as a biological control agent due to its capacity to infect more than three hundred species of arthropods. It is broadly used as a model to the development of host-pathogen interaction studies, including the study of the description of the involved genes in the infection process by the construction of functional mutants. This process may be facilitated by the use of the CRISPR/Cas9 methodology to genomic manipulation, which was derived from the immune adaptive system in prokaryotes and has demonstrated technological potential in genetic of eukaryotes edition through the activity of incorporation of protospacers (sequences arising from bacteriophages or plasmids invaders) in their loci. CRISPR and CRISPR associated protein (Cas) code a guided nuclease (Cas9) that targets a specific site of the invading DNA leading to breakage of double-stranded target DNA in a specific sequence. Multiple gene editing studies have been developed in different organisms including its adaptation to eukaryotes. In order to improve the efficiency of the generation of mutants in M. anisopliae, CRISPR/Cas9 system and a RNAi system were used in order to develop new tools. Both CRISPR/Cas9 and RNAi methodologies were developed having as a target the gfp gene from M. anisopliae E6 GFP+ strain. To perform genome editing in M. anisopliae, stable transgenic fungi that express fungal codon-optimized Cas9 were generated by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Oligonucleotides were designed to target four different regions along the gfp gene by using the CRISPR RGEN tool in order to avoid off-targets. The binary vector was the pPZP plasmid with the U6-1 to RNAi expression. For RNAi analysis, gene knockdown were developed by agrotransformation with a suitable plasmid (pPZP::SUR::DP) containing dual promoters with opposite directions (Pdgp and Ptrpc) and a cassette for the expression of the selective marker (gene sur, conferring sulfonylurea resistance) for the selection of transformants. The 420 bp gfp sequence was cloned between promoters, obtaining thus the plasmid pPZP::SUR::DP::GFP. The development of these two techniques proves itself viable for functional analysis of M. anisopliae genes.

Metarhizium anisopliae é um fungo entomopatogênico usado como agente de controle biológico devido a sua capacidade de infectar mais de 300 espécies de artrópodes. É um organismo muito utilizado como modelo de estudo de interação patógeno-hospedeiro sendo um dos focos de estudo a descrição de genes envolvidos no processo de infecção pela construção de mutantes funcionais. Esse processo pode ser facilitado pelo uso da metodologia do sistema CRISPR/Cas9 para manipulação genômica, que foi derivada do sistema imune adaptativo de procariotos que vem demonstrando potencial tecnológico em edição genética de eucariotos pela incorporação de protoespaçadores (sequencias oriundas de bacteriófagos ou plasmídeos invasores) em seus loci. CRISPR e a proteína associada à CRISPR (Cas) formam uma endonuclease guiada (Cas9) a qual tem como alvo o sítio específico do DNA invasor, provocando a clivagem da dupla fita do DNA alvo em uma sequência específica. Muitos estudos realizados pela edição gênica têm sido desenvolvidos em diferentes organismos por meio da sua adaptação em eucariotos. Com o objetivo de melhorar a eficiência na geração de mutantes em em M. anisopliae, o sistema CRISPR/Cas9 e um sistema de RNAi foram usados a fim de desenvolver novas ferramentas. As metodologias CRISPR/Cas9 e RNAi foram desenvolvidas para ter como alvo o gene reporter gfp da linhagem M. anisopliae E6 GFP+. Para realizar a edição genômica em M. anisopliae, foram gerados, por transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens, fungos transgênicos estáveis que expressam a endonuclease Cas9 códon-otimizada para fungos filamentosos. Oligonucleotídeos foram projetados para ter como alvo quatro regiões diferentes na sequencia do gene gfp com o auxílio da ferramenta CRISPR RGEN tool com o objetivo de evitar o pareamento aleatório. O vetor binário utilizado foi o plasmídeo pPZP com o promotor U6-1 para a expressão do RNA guia. Para a metodologia de RNA interferente foi reproduzido o knockdown do gene repórter gfp por meio de agrotransformação do vetor pPZP::SUR::DP que contém um sistema de dois promotores em direções opostas (dual promoter Pdgp e Ptrpc) e um cassette de expressão com o gene marcador sur (resistência a sulfoniluréia) para a seleção dos transformantes. Foram clonados 420 pares de bases do gene gfp entre os promotores gerando o plasmídeo pPZP::SUR::DP::GFP. O desenvolvimento dessas duas metodologias se mostra viável para análise funcional de genes de M. anisopliae. / Metarhizium anisopliae is an entomopathogenic fungus used as a biological control agent due to its capacity to infect more than three hundred species of arthropods. It is broadly used as a model to the development of host-pathogen interaction studies, including the study of the description of the involved genes in the infection process by the construction of functional mutants. This process may be facilitated by the use of the CRISPR/Cas9 methodology to genomic manipulation, which was derived from the immune adaptive system in prokaryotes and has demonstrated technological potential in genetic of eukaryotes edition through the activity of incorporation of protospacers (sequences arising from bacteriophages or plasmids invaders) in their loci. CRISPR and CRISPR associated protein (Cas) code a guided nuclease (Cas9) that targets a specific site of the invading DNA leading to breakage of double-stranded target DNA in a specific sequence. Multiple gene editing studies have been developed in different organisms including its adaptation to eukaryotes. In order to improve the efficiency of the generation of mutants in M. anisopliae, CRISPR/Cas9 system and a RNAi system were used in order to develop new tools. Both CRISPR/Cas9 and RNAi methodologies were developed having as a target the gfp gene from M. anisopliae E6 GFP+ strain. To perform genome editing in M. anisopliae, stable transgenic fungi that express fungal codon-optimized Cas9 were generated by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Oligonucleotides were designed to target four different regions along the gfp gene by using the CRISPR RGEN tool in order to avoid off-targets. The binary vector was the pPZP plasmid with the U6-1 to RNAi expression. For RNAi analysis, gene knockdown were developed by agrotransformation with a suitable plasmid (pPZP::SUR::DP) containing dual promoters with opposite directions (Pdgp and Ptrpc) and a cassette for the expression of the selective marker (gene sur, conferring sulfonylurea resistance) for the selection of transformants. The 420 bp gfp sequence was cloned between promoters, obtaining thus the plasmid pPZP::SUR::DP::GFP. The development of these two techniques proves itself viable for functional analysis of M. anisopliae genes.

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