Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-30Bitstream added on 2014-06-13T20:21:38Z : No. of bitstreams: 1 goncalves_hb_me_araiq.pdf: 1598700 bytes, checksum: 9f31d3b16656a31ddf594835f3745ebf (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A tanase (EC 3.1.1.20) é uma enzima induzível que age sobre os taninos hidrolisando suas ligações éster e depsídicas obtendo-se como produtos a glicose e o ácido elágico ou ácido gálico, sendo este último, um importante substrato para as indústrias farmacêutica e química. Entre os diferentes organismos capazes de produzir tanases, os microorganismos, de modo especial os fungos filamentosos, vêm se destacando uma vez que são mais versáteis na degradação de diferentes tipos de taninos. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi estudar as tanases intra e extracelulares do fungo filamentoso Emericella nivea produzidas em Fermentação Submersa (FSbm) e em Fermentação em Substrato Sólido (FSS), purificando-as e caracterizando-as bioquimicamente, além de imobilizá-las em suportes de agarose. Em princípio, foi realizada a seleção da melhor cepa produtora de tanases, submetendo-se 42 linhagens fúngicas a FSbm em meio de cultura Khanna com 2% de ácido tânico como fonte de carbono, por 3 a 4 dias a 30ºC, tendo sido o fungo Emericella nivea selecionado para prosseguimento do trabalho. Para este microorganismo os maiores nívies enzimáticos extracelulares foram obtidos em 3 dias de cultivo em FSbm e 8 dias em FSS, sendo para esta última utilizados produtos agroindustriais e folhas de vegetais de diferentes espécies secas trituradas umedecidas com água de torneira (1:1; p/v). As tanases extra e intracelular foram purificadas 61 e 2,5 vezes com recuperação de 30% e 8,8%, respectivamente. Eletroforese em condições não desnaturantes (PAGE 7%) mostrou a presença de uma única banda protéica revelada por prata e para atividade tanásica com a mesma mobilidade relativa. A forma extracelular possui massa molecular nativa de aproximadamente 322kDa com 50% de conteúdo de carboidratos. Já a enzima intracelular apresentou massa molecular nativa de 258kDa e 17% de... / Tannases (EC 3.1.1.20) are inducible enzymes that catalyze the hydrolysis of ester and depside bonds in hydrolysable tannins releasing glucose and ellagic acid or gallic acid, which is an important compound used in pharmaceutical and chemical industries. Among different organisms able to produce these enzymes, the microorganisms, especially filamentous fungi deserve attention since they can act on different tannins degradation ways. In this context, the aim of this work was to study the intra and extracellular tannases from the filamentous fungus Emericella nivea produced in Submerged Fermentation (SbmF) and Solid Substrate Fermentation (SSF), purifying and characterizing them biochemically, as well to immobilize the extracellular enzyme in agarose supports. First of all, it was selected the best tannase producer among 42 strains, in Khanna culture medium with 2% tannic acid as carbon source for 3-4 days at 30°C, and the fungus Emericella nivea was selected. This fungus produced high levels of extracellular enzyme at 3 and 8 days when cultivated in SbmF and SSF at 30°C, respectivally. FSS was performed with agroindustrial products or crushed dried leaves of different plants umidified with tap water (1:1, w/v). The extra and intracellular tannases were purified 61 times and 2.5-times, with recovery of 30% and 8.8%, respectivally. Non-denaturing electrophoresis (PAGE 7%), showed a unique proteic band stained by silver and for activity, both with the same relative mobility. The extracellular enzyme, probably, is a hetero-dimeric protein with native molecular mass of 322 kDa with 50% of carbohydrate content and the intracellular with native molecular mass of 258 kDa and 17% of carbohydrate. The optimum temperature were 45ºC and 50°C for the extra and intracellular enzymes, respectively and the optimum pH for both enzymes was 5.0. The soluble tannases were thermostable with... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-27Bitstream added on 2014-06-13T20:04:36Z : No. of bitstreams: 1 freitas_pm_dr_rcla.pdf: 670514 bytes, checksum: 22df87c8cdf056a03825df30dc778c89 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O fungo Rhizomucor pusillus A 13.36, quando cultivado por fermentação em estado sólido utilizando farelo de algodão como fonte de carbono por 72 horas, produziu altos níveis de poligalacturonase (18,6U/g). Essa enzima apresentou atividade máxima em pH 5,5 e em 55oC. A poligalacturonase bruta apresentou estabilidade na faixa de pH entre 4,5 e 6,5, com uma atividade residual de 91,3% no pH 6,5, e também até 70oC por 1h, com atividade residual de 80% nas temperaturas de 55 a 60oC. Esta enzima foi purificada por concentração e uma combinação de procedimentos de gel filtração e cromatografia de troca-iônica. A massa molecular da enzima foi 53,7kDa. A focalização isoelétrica mostrou uma única banda cujo ponto isoelétrico (pI) foi 3,8. A atividade máxima da enzima purificada também ocorreu em pH 5,5 e a 55oC. A enzima purificada foi estável na faixa de pH 4,5 a 6,5, com atividade residual na faixa de 80 a 100%, e também até 70oC por 1h, com atividade residual de 100% nas temperaturas de 55 a 60oC. A enzima purificada foi totalmente inibida por Ca2+, Cu2+, Hg2+ e 80% inibida por Fe2+ e Ag+. Mg2+ estimulou a atividade da poligalacturonase em 100%. Entre os substratos avaliados, a pectina de citrus (D.E. 92%) foi o que mais estimulou a ação da enzima. A afinidade por pectinas de alta esterificação e a ausência de atividade quando o ácido poligalacturônico foi usado como substrato, indica que a enzima purificada é uma polimetilgalacturonase. Os resultados obtidos pela cromatografia de papel demonstraram que a polimetilgalacturonase purificada possui o modo de clivagem endo/exo misto. O Km com pectina de citrus foi 10,78mg mL-1 e a Vmax foi 2379,04μmolmin-1mg-1. As possíveis aplicações desta enzima incluem composição de detergentes, processamento têxtil e de fibras de celulose, degradação ou modificação de material vegetal, aditivo... / Rhizomucor pusillus A 13.36 produced high levels of polygalacturonase (18.6U/g) in solid state fermentation in medium composed by cotton bran for 72 hours. This enzyme showed maximal activity at pH 5.5 and 55oC. Crude polygalacturonase was stable from pH 4.5 to 6.5, with remaining activity of 91,3% at pH 6.5, and stable until 70oC for 1h, with remaining activity of 80% at 55-60oC. This enzyme was purified by concentration and a combination of gel filtration and ion exchange chromatographic procedures. The molecular mass of the enzyme was 53.7kDa. Isoelectric focusing showed a single band with an isoelectric point (pI) of 3.8. The purified enzyme also showed maximum activity at pH 5.5 and 55oC. The purified enzyme was stable from pH 4.5 to 6.5, with remaining activity range of 80 to 100%, and stable until 70oC for 1h, with remaining activity of 100% at 55-60oC. The purified enzyme was totally inhibited by Ca2+, Cu2+, Hg2+ and 80% inhibited by Fe2+ and Ag+. Mg2+ increased poligalacturonase activity in 100%. Citrus pectin (D.E. 92%) was found to be the preferred substrate among the different substrates tested in the enzyme assay. The affinity for high pectin esterification and the lack of activity when polygalacturonic acid was used as substrate, indicates that the enzyme is a polymethylgalacturonase. The results obtained by paper chromatography showed that the purified polymethylgalacturonase has the mixed endo/exo mode of cleavage. The Km with citrus pectin was 10.78mg mL-1 and the Vmax was 2379.04μmolmin-1mg- 1. The possible applications of this enzyme include the composition of detergents, textile and cellulosic fiber processing, degradation or modification of plant material, animal feed additive and wine and juice processing.