Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Programa de Pós-Graduação em Ciências e Tecnologias em Saúde, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-10-14T21:29:48Z No. of bitstreams: 1 2014_AmandaLiraNogueiraBarros.pdf: 3370997 bytes, checksum: 85117556d8ae68f1292b6073cbb5fc91 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-10-15T13:24:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_AmandaLiraNogueiraBarros.pdf: 3370997 bytes, checksum: 85117556d8ae68f1292b6073cbb5fc91 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-15T13:24:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_AmandaLiraNogueiraBarros.pdf: 3370997 bytes, checksum: 85117556d8ae68f1292b6073cbb5fc91 (MD5) / As proteínas Velvet compreendem quatro membros altamente conservados entre ascomicetos e basidiomicetos, os quais compartilham o domínio Velvet. Eles regulam diferentes vias de sinalização em resposta a estímulos ambientais e também coordenam o metabolismo secundário e diferenciação assexual e sexual em diferentes espécies de fungos. Recentemente, as proteínas Velvet foram implicadas na virulência de alguns agentes patogênicos de plantas. Buscou-se avaliar o papel das proteínas Velvet no fungo patogênico humano Cryptococcus neoformans, causador da criptococose, importante micose sistêmica e a terceira doença mais prevalente em indivíduos portadores do vírus HIV. Entre as micoses sistêmicas, ela é classificada como tendo a maior incidência em pacientes imunocomprometidos. A infecção por C.neoformans ocorre pela inalação de células infecciosas e é considerada uma infecção pulmonar primária, o que pode levar a uma infecção disseminada e meningoencefalite. O objetivo geral do trabalho foi avaliar o papel do gene VELB na patogenidade e morfogênese de C. neoformans. O primeiro passo realizado no estudo foi a deleção do gene VELB em Cryptococcus neoformans. O cassete foi transformado em células leveduriformes haploides de C. neoformans diretamente através de biobalística. Confirmou-se a deleção por PCR e Southern Blot. Após confirmação, os transformantes foram submetidos a diferentes condições de crescimento para determinação de seus fenótipos e virulência. Foram realizados testes de estresse osmótico (NaCl), estresse na parede celular (CongoRed, SDS, cafeína) e estresse oxidativo com peróxido de hidrogênio. Foram avaliados os fatores de virulência de C. neoformans como fosfolipase, urease, melanina e cápsula. Os testes fenotípicos não apresentaram alterações entre a linhagem e mutante indicando que o gene VELB parece não ter nenhum envolvimento em virulência e resposta a agentes estressores. Para avaliação da capacidade de acasalamento foram realizados co-cultivos no escuro em diferentes meios de cultura (Filament, SLAD e MS), além disto foi testada a capacidade de fusão dos mutantes. Estes testes demonstraram que a deleção de VELB bloqueia a produção de hifas no acasalamento entre mutantes e que estes apresentam também defeito no processo de fusão celular. Estes resultados gerados neste trabalho sobre o papel de VELB corroboram os dados anteriormente obtidos pelo nosso grupo de pesquisa de que os membros da família velvet estão diretamente envolvidos na regulação do ciclo sexual de C. neoformans. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Velvet proteins consist of four highly conserved members in ascomycetes and basidiomycetes, sharing the Velvet domain. They regulate different signaling ways in response to environmental stimulation and also coordinate secondary metabolism and asexual to sexual differentiation in different species of fungi. Recently, Velvet proteins have been implicated in the virulence of some pathogenic agents of plants. It was evaluated the role of Velvet proteins in the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans that causes cryptococcosis, an important systemic mycosis and the third most prevalent disease in HIV positive individuals. Compared to other systemic mycoses, it is classified as having the highest incidence in immunocompromised patients. C.neoformans infection is by inhalation of infectious cells and is considered a primary pulmonary infection, which can lead to widespread infection and meningoencephalitis. The overall objective of this study was to evaluate the role of the VELB gene in morphogenesis and pathogenicity of C. neoformans. The first step was performed at study deletion of the gene VELB in Cryptococcus neoformans. The cassette was transformed into haploid yeast cells of C. neoformans directly through biolistic. The deletion was confirmed by PCR and Southern blot. After confirmation, the transformants were submitted to different growth conditions to determine their phenotypes and virulence. Tests of osmotic stress (KCl, NaCl, sorbitol), stress in the cell wall (Congo Red, Calcofluor, SDS, caffeine) and oxidative stress with hydrogen peroxide were performed. Virulence factors of C. neoformans as phospholipase, urease, melanin and capsule were evaluated. Phenotypic tests showed no change between the strain and mutant indicating that the VELB gene seems to have no involvement in virulence and response to stressors. To evaluate the ability of mating co-cultures were performed in the dark in different culture media (Filament, SLAD and MS), in addition it was tested the ability of fusion of mutants. These tests showed that the deletion of VELB blocks the production of hyphae in mating and that these mutants also exhibit defective cell fusion process. These results generated in this paper about the VELB function corroborate data previously 13 obtained by our research group that the members of the velvet family are directly involved in the regulation of the sexual cycle of C. neoformans.

Orientador : Claudio Luiz Messias / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-16T19:58:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Matos_AdmirJosafaArraisde_D.pdf: 6171342 bytes, checksum: cf3f04c36c690924ab8bb219c92f8fc0 (MD5) Previous issue date: 1988 / Resumo: Estudou-se a germinação e alguns aspectos da morfologia e fisiologia de Metarhizium anisopliae (METSCH.) SOROKIN, utilizando-se meios de cultura de diversas composições e também substâncias inibidoras de diversas naturezas. Observou-se a formação e o crescimento de tubos germinativos em conidios de linhagens selvagens, mutantes e diplóides. Verificou-se nos estudos iniciais que quando os conidios de M.anisopliae produzidos em meio mínimo, em culturas de superfície, eram expostos a ambiente ventilado, perdiam cerca de 50% de seu peso, pela evaporação da água em 6 horas. Verificou-se também que quando conídios produzidos de igual modo eram inoculados em meio completo líquido aumentavam seu volume em mais de 6 horas.Os estudos subsequentes mostraram que em 12 horas de incubação, mais de 85% de conídios germinaram nos vários meios testados, tanto sólidos como liquidas. Este tempo pode ser considerado como o tempo mínimo de germinação (TGm), para a variedade anisopliae. Os estudos também sugeriram que em meio liquido e à temperatura ambiente, uma concentração de 10_ conidios/ml, parece ser em algumas situações a mais indicada. Houve variabilidade quanto ao número de tubos germinativos em conídios de M.anisopliae num determinado tempo. A germinação e o crescimento de tubos germinativos podem ser representados por um modelo exponencial. Considerando também os vários meios de cultura testados, o meio mínimo + extrato de levedura se mostrou um meio basal para a germinação de conidios e crescimento de co1ônias. Foram ensaiadas várias substâncias inibidoras da germinação de conídios como, glicerol, polietilenoglicol, benzeno, clorofórmio, m-cresol, álcool éter + alquil-sulfato de sódio e cicloheximida, cujos efeitos permitiram em muitos casos um maior sincronismo na germinação. Algumas destas substancias além de osmoreguladoras, também produziram efeitos morfogênicos, aumentando o número de tubos germinativos dentro de um determinado tempo. Com m-cresol, o efeito morfogênico foi mais duradouro. Os mutantes da 1inhagem E9 não diferiram no modo de germinação quando comparados com a linhagem selvagem de origem, o mesmo não acontecendo com os mutantes de F84. A germinação de conídios dos diplóides, revelou cada um deles germinando de maneira diferente. O trabalho permitiu concluir que a germinação de conídios é um processo extremamente complexo, que segue um programa genético, o qual se expressa no tempo e no espaço e influenciado por diversos fatores ambientais / Abstract: Were studied on the germination of the Metarhizium anisopliae (METSCH) SOROKIN, and several aspects the morphology and physiology, utilizing culture media of various compositions and also inhibiting substances of various natures. The formation and growth of germinative tubes were observed in conidia of wild strains, mutant and diploid. The initial studies showed that when conidia the M.anisopliae produced in a minimum medium, in superficial cultures, were exposed to a ventilated environment they would loose 50% of their weight, by water evaporation in 6 hours. It was noticed also that when conidia produced in an equal manner were inoculated in a complete liquid medium they would increase their volume to more than 50% in 6 hours.The subsequent studies showed that in 12 hours of incubation more than 85% of the conidia germinated in the various tested media, such as for solids, as for liquids. This length can be considered as the minimum time for germination (TGm), for the anisopliae variety. The studies also suggested that in a liquid medium at the environmental temperature, a concentration of 10_ conidia/ml, it seems to be in some situations the most indicated. There was variability as to the number of germinative tubes in M.anisopliae conidia in a determined period of time. The germination and growth of germitiative tubes can be represented by an exponential model. Considering also the various tested culture media, the minimum + yeast extract demonstrated to be a basal medium for germination of conidia and growth of colonies. Various inhibiting substances of the conidia germination were tested, as glycerol, poliethileneglycol, benzene, chloroform, m-cresol, alcohol ether + alquil-sulphate of sodium and cicloheximide, being that the effects served in many cases to increase synchronism in germination. Some of these substances, besides being osmoregulators, also produced morphogenic effects, increasing the number of germinative tubes within a certain period of time. With m-cresol the morphogenic effect lasted longer.The mutants of strain E9 did not differ in the germination manner when compared to a wild origen, the same did not occur with the mutants F84. The germination of diploids conidia showed each of them germinating in a different manner. It was concluded by the study that the germination of the conidia is an extremely complex process, following a genetic program, which express in time and space and it is influenced by several environmental factors / Doutorado / Doutor em Ciências

Orientador : Claudio Luiz Messias / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-17T07:27:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lugli_Juverlande_M.pdf: 2361566 bytes, checksum: 66289e18433c71d51b1d736f0d409180 (MD5) Previous issue date: 1988 / Resumo: o objetivo do presente trabalho foi reunir duas linhagens diferentes de Metarhizium anisopliae, e através do ciclo parassexual obter diplóides e segregantes, os quais pudessem ser estudados quanto a produção de destruxlnas, utilizando-se decromatografta de camada delgada (CCD) e gasosa, sendo esta última acoplada ao espectrômetro de massa (GC-MS). Para isto foram utilizadas duas linhagens: uma de origem norte-americana (F-84) e a outra brasileira (E-9). Estas foram submetidas à ação da luz ultra-vloleta, de maneira a obter-se mutantes morfológicos e auxotróficos. Os mutantes obtidos foram: E-9 am-pir, F-84 vio-tia e F-84 vio-nic, os quais apresentaram-se bastante estáveis com uma frequência de reversão menor que 10-6 conídios. Testes de complementação de pigmentos dos mutantes foram conduzidos e pode-se verificar que os mesmos não produzem a enzima lacase, que tem ação na formação do pigmento selvagem, e assim sendo os diplóides não apresentaram pigmentação verde. Os diplódes foram formados dos cruzamentos de E-9 am-pir x F-84 vio-tia e E-9 ampir x F-84 vto-nic. Ambos apresentaram coloração de um dos parentais (amarelo); estes foram haploidizados com Cloroneb (150µg/ml), surgindo setores amarelos e violetas de formato irregular. Para as destruxinas, foram utilizados os extratos das linhagens selvagens, mutantes, diplóides e segregantes, que foram cromatografados em CCD, apresentando um Rf próximo ao padrão 0,50. Um deles demonstrou Rr abaixo do padrão, (O,44). Na espectrometria de massa, os íons formados determinaram a presença das destruxinas A e B dada pelas frações 576, 7-577,6 e 592,7-593,b respectivamente. Todos os extratos das linhagens analisadas produziram destruxinas, com excecão de dois segregantes S/B-1a e S/B-1b, em cujos extratos não encontradas as duas destruxinas B e A e B. respectivamente / Abstract: In this work the main object was the study of destruxlns production, by diploids and segregants obtained through parasexual cycle in Metarhizium anisopliae. The two parantal strains utilized were E-9 (Brazil) and F-84 (USA), which after induction with UV-radiation produced conidial color and auxotrophic mutants. The mutants E-9 am-pir, F-84 vio-tia and F-84 vio-nic were utilized because they showed a reversion frequency of auxotrophlc markers lower than 10-6 conidia. The diploids Isolated (E-9 am-pir x F-84 vio-tia and E-9 am-pir x F-84 vio-nic) were all yellow conidiating and showed yellow and violet irregular segregants on Chloroneb (150µg/ml) . As only yellow conidia diploids were isolated it can be suggested that they are not able to produce laccase, which Is the enzyme responsible for wild type (green) pigment formation. Additional tests for laccase production were made with color mutants growing together in a same Petri dish and tt could be deduced that leccase was absent. Destruxtins were analyzed by Thin-layer chromatography (TLC), showing Rf close to the pattern 0,50 and gas chromatography combined with mass spectrography. The mass spectrography showed the presence of destruxins A and B by lons formation in fractions 576,7-577,6 and 592,7-593,6 respectively. One of them showed Rf below to the pattern (0,44). Mass spectrography showed the presence of the destruxin A and B by fractions 576,7-577,& and 592,7-593,6 respectively. AI) the strains analysed produced destruxins, but the sectors S/B-la and S/B-lb, which extracts didn't have destruxlns B and A and B, respectively / Mestrado / Mestre em Biologia

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-03T18:50:01Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 128394 bytes, checksum: eade9f83480bcb6c288ec63ffe339c8e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-03T18:50:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 128394 bytes, checksum: eade9f83480bcb6c288ec63ffe339c8e (MD5) Previous issue date: 2005-02-22 / Esporulação de Alternaria solani é normalmente escassa e facilmente paralisada quando em cultivos in vitro. Foi obtido e validado um protocolo para induzir esporulação em A. solani baseado em fragmentação e desidratação de micélio. Para tal, quatro isolados oriundos de três municípios foram usados em ensaios de efeito da umidade, injúria do micélio, luz, fotoperíodo e meio de cultura, na esporulação. Maior esporulação ocorreu quando se cresceram culturas de A. solani em meio V8 sob agitação e triturou-se o micélio o qual foi vertido em placas com meio BDA (pH=6,5). As placas sem tampa, para permitir a desidratação, foram mantidas a 25 ± 2 o C, sob fotoperíodo de 12 h de luz negra por 60 horas. O protocolo foi validado com 20 isolados de A. solani de diferentes hospedeiros, localidades, idades e modo de armazenamento. Quantificaram-se a esporulação, germinação de conídios e infectividade do inóculo em tomateiro e batateira. Todos os isolados esporularam, e a germinabilidade dos conídios foi superior a 96%. Maiores valores de frequência de infecção ocorreram em folíolos do terço médio de batateira. Para avaliar o efeito das repicagens sucessivas na esporulação, efetuaram-se 24 repicagem periódicas, a cada 7 dias. Em cada repicagem, empregou-se o protocolo para induzir a esporulação e se quantificou a produção de conídios. Pelo menos uma das colônias de cada isolado esporulou até a 10a repicagem. / Sporulation of Alternaria solani is scarse and commonly reduced when the fungus is cultivated in vitro. A procedure to induce sporulation based on mycelial fragmentation and dehydration was developed and validated. Four isolates of A. solani were used in experiments to assess the effects of moisture, mycelial wounding, light quality and photoperiod, and culture media on conidia production. Sporulation was higher when the fungus was grown on V8 medium at 25 o C in darkness with agitation, followed be mycelium grinding and pouring to Petri dishes containing PDA (pH 6.5). In addition, colonies were incubated at 25 ± 2 o C under near ultraviolet light and 12-hour photoperiod. The procedure was validated with 20 isolates of A. solani from different hosts, places, ages, and storage conditions. Conidia production, germination, and infectivity were quantified. All isolates sporulated and minimum conidia germination was 96%. Inoculations with conidia suspension of all isolates resulted in lesions. Infection frequency was highest when leaflets of the middle third of tomato plants were inoculated. The effect of subculturing on A. solani sporulation was also assessed. After 24 subcultures, at every 7 days. / Dissertação importada do Alexandria