70% des mutations identifiées sur le gène responsable de la mucoviscidose correspondent à la délétion de la phénylalanine en position 508 (F508del) de la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). Cette mutation est responsable, à 37°C, d'un mauvais repliement, du blocage et de la dégradation rapide de CFTR au niveau du réticulum endoplasmique (RE), et par conséquent de l'absence de sécrétion des ions Cl- au niveau de la membrane apicale des cellules épithéliales. Deux conséquences principales de cette mutation sont un épaississement important du mucus bronchique et une diminution de l'intégrité de la barrière luminale de l'épithélium bronchique. Ces deux phénomènes participent à l'invasion et à l'infection du tissu pulmonaire par des bactéries pathogènes comme Pseudomonas aeruginosa, exacerbant l'inflammation et la destruction tissulaire au niveau des poumons. L'objectif de cette étude a été de déterminer le rôle de deux protéines appartenant à la famille des protéines G hétérotrimériques, G12 et G13, dans la dégradation de la protéine CFTR-F508del ainsi que dans le contrôle des complexes jonctionnels au niveau de l'épithélium bronchique sain et mucoviscidosique. Nos travaux démontrent pour la première fois que dans la mucoviscidose, l'expression des protéines G12 et G13 est faible. Nous avons aussi montré que G12, et non G13, est impliquée dans le contrôle de la dégradation de la protéine CFTR-F508del via les protéines chaperonnes Calnexine et HSP90, et dans la formation et le maintien des jonctions cellulaires bronchiques via E-cadhérine et ZO-1 de manière inverse par rapport à l'épithélium rénale. Ces travaux placent donc G12 comme un acteur non négligeable de la maladie de la mucoviscidose. / F508del, the most frequent mutation found in cystic fibrosis (CF) population, impacts CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) trafficking and causes its rapid degradation at the endoplasmic compartment, resulting in a significant decrease in Cl- secretion at the apical membrane of epithelial cells. F508del has two main features, significant thickening of the bronchial mucus and a reduction in the integrity of the luminal barrier of the bronchial epithelium. These two phenomena are involved in the invasion and infection of lung tissue by pathogenic bacteria such as Pseudomonas aeruginosa, exacerbating the inflammation and lung destruction. The objective of this study was to determine the role of two proteins member of the heterotrimeric G proteins family, G12 and G13, in the degradation of the F508del CFTR, and in the control of junctional complexes in the normal and CF bronchial epithelium. Our results show for the first time that G12 and G13 are down expressed in CF. G12, but not G13, is involved in the control of F508del-CFTR degradation through its interaction with Calnexin and HSP90 chaperones. Unlike kidney epithelia cells, G12 promotes the formation and maintenance of cell junctions in the bronchial epithelium by affecting E-cadherine and ZO-1 stability. Altogether, our results set therefore G12 as a significant actor of the CF disease.

Ovarian cancer is currently the most fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of fatal cancer in women overall. As compared to the better-characterized malignancies, such as such as prostate, breast and colorectal cancers, there have been no major changes in methods of detection or treatment of ovarian cancers since the 1970's. As a result, the incidence and age-adjusted death rates for this disease have improved only marginally since that time. The molecular changes required for ovarian cancer pathogenesis remain poorly defined. Lysophosphatidic acid (LPA) has emerged as a biomarker present in the ascitic fluid and serum of ovarian cancer patients. Subsequent studies have identified LPA as an agonist for G protein coupled receptors (GPCRs). LPA has been well characterized as a pro-migratory factor in ovarian cancer and other cell systems. However, the role of LPA in mediating a proliferative response in ovarian cancer cells has yet to be fully characterized. In addition, the identity of the G protein pathways involved in this proliferative response remains a major unresolved question in the field. To investigate the mitogenic role of LPA in ovarian cancers, a panel of representative human ovarian cancer cells was assembled. A series of immunoblot and RT-PCR analyses was used to profile the LPA receptors and Gα-subunits expressed in these cells. In addition to verifying the migratory effect of LPA in these cells, a series of proliferation assays were used to investigate the potential role for LPA as a mitogen. The results indicate that stimulation with LPA results in a robust and statistically significant proliferative response. This response was quantified using multiple approaches. In addition, the proliferative response was observed in three independent ovarian cancer cell lines using concentrations of LPA within the range found in vivo in the ascitic fluid of ovarian cancer patients. Taken together, these data for the first time validate the role of LPA as a mitogen in ovarian cancer cells. To gain further insight into the oncogenic signaling response stimulated by LPA, activation of the mitogen activated protein kinase (MAPK) modules was determined. Using a series of immunoblot analyses and kinase assays, LPA was found to stimulate ERK as well as JNK modules. To investigate the functional roles of these pathways, a series of proliferation assays were carried out using inhibitors of ERK and JNK signaling. Consistent with the role of ERK as a crucial regulator of growth-factor induced proliferation in other cell systems, the results demonstrated a significantly attenuated growth response to LPA with ERK inhibition. Moreover, additional studies demonstrated for the first time that inhibition of JNK signaling significantly attenuates the proliferative response to LPA. In order to investigate the potential role of Gα12 in mediating the oncogenic response to LPA, the activation status of Gα12 was monitored in ovarian cancer cells stimulated with LPA. These studies demonstrate rapid activation of Gα12 with LPA stimulation. Finally to investigate the functional role of LPA-Gα12 signaling, a series of cell lines was established which express a dominant negative form of Gα12. Expression of this construct induced complete inhibition of Gα12 activation by LPA. These cells were then used to determine the effects of Gα12 inhibition on the oncogenic response to LPA. Consistent with the role of G12 family members in mediating cell migration, these cells demonstrated an attenuated migratory response to LPA. In addition, inhibition of Gα12 resulted in an attenuated proliferative response to serum. Finally, to investigate the role of Gα12 in mediating the proliferative response to LPA, a series of proliferation assays was carried out. The results indicated a significant > 50% inhibition in multiple ovarian cancer cell lines. Taken together, these results, presented here for the first time, establish that LPA is a potent mitogen that induces a proliferative response in human ovarian carcinoma cells. Although LPA had previously been shown to induce a proliferative response in multiple other cell types, it had not been known if LPA activates specific oncogenic pathways. This thesis tested the hypothesis that LPA, which is crucially involved in the pathophysiology of ovarian carcinoma, induces the activation of Gα12. In this context, the data presented here demonstrating a novel role for Gα12- which has been defined as the gep oncogene - in mediating this proliferative response in ovarian carcinoma, represents a major finding in the field. / Molecular Biology and Genetics

70% des mutations identifiées sur le gène responsable de la mucoviscidose correspondent à la délétion de la phénylalanine en position 508 (F508del) de la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). Cette mutation est responsable, à 37°C, d'un mauvais repliement, du blocage et de la dégradation rapide de CFTR au niveau du réticulum endoplasmique (RE), et par conséquent de l'absence de sécrétion des ions Cl- au niveau de la membrane apicale des cellules épithéliales. Deux conséquences principales de cette mutation sont un épaississement important du mucus bronchique et une diminution de l'intégrité de la barrière luminale de l'épithélium bronchique. Ces deux phénomènes participent à l'invasion et à l'infection du tissu pulmonaire par des bactéries pathogènes comme Pseudomonas aeruginosa, exacerbant l'inflammation et la destruction tissulaire au niveau des poumons. L'objectif de cette étude a été de déterminer le rôle de deux protéines appartenant à la famille des protéines G hétérotrimériques, Gα12 et Gα13, dans la dégradation de la protéine CFTR-F508del ainsi que dans le contrôle des complexes jonctionnels au niveau de l'épithélium bronchique sain et mucoviscidosique. Nos travaux démontrent pour la première fois que dans la mucoviscidose, l'expression des protéines Gα12 et Gα13 est faible. Nous avons aussi montré que Gα12, et non Gα13, est impliquée dans le contrôle de la dégradation de la protéine CFTR-F508del via les protéines chaperonnes Calnexine et HSP90, et dans la formation et le maintien des jonctions cellulaires bronchiques via E-cadhérine et ZO-1 de manière inverse par rapport à l'épithélium rénale. Ces travaux placent donc Gα12 comme un acteur non négligeable de la maladie de la mucoviscidose.

Le récepteur V2 (V2R) de la vasopressine est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG), jouant un rôle fondamental dans le maintien de l’homéostasie hydrosodique. À l’instar de nombreux RCPGs, il est capable d’interagir avec plusieurs types de protéines G hétérotrimériques et possède des voies de signalisation peu explorées aux mécanismes mal compris. Ces voies non canoniques font l’objet des travaux exposés dans ce mémoire. Il s’agit d’explorer les caractéristiques et mécanismes de la signalisation de V2R via G12, et de la voie d’activation d’ERK 1/2 par transactivation du récepteur de l’insulin-like growth factor 1, IGF1R. Par des études de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), nous exposons la capacité de V2R à interagir avec la sous-unité Gα12 ainsi que la modulation de la conformation de l’hétérotrimère G12 par l’agoniste de V2R, l’arginine-vasopressine. Ces travaux dévoilent également la modulation de l’interaction entre Gα12 et son effecteur classique RhoA, suggérant un engagement de RhoA, ainsi que la potentialisation via Gα12 de la production d’AMP cyclique. À l’aide de diverses méthodes d’inhibition sélective, nos résultats précisent les mécanismes de la transactivation. Ils supportent notamment le rôle initiateur de l’activation de Src par V2R et l’absence d’implication des ligands connus d’IGF1R dans la transactivation. La métalloprotéase MMP 3 apparaît par ailleurs comme un bon candidat pour réguler la transactivation. Ce projet met en lumière des modes de signalisation peu explorés de V2R, dont l’implication physiologique et physiopathologique pourrait s’avérer significative, au-delà d’un apport fondamental dans la compréhension de la signalisation des RCPGs. / Vasopressin V2 receptor is a G protein coupled receptor (GPCR) responsible for the homeostatic regulation of water and sodium recapture from the urine to the bloodstream. Akin to numerous GPCRs, this receptor can interact with more than one heterotrimeric G protein subtype, and is still associated with some poorly explored signaling pathways with indefinite mechanisms. These non-canonical pathways are the focus of this project. This work aims at unveiling the characteristics and mechanisms underlying G12 mediated signaling by V2R and ERK 1/2 activation through the transactivation of the tyrosine kinase Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R). Using bioluminescence resonance energy transfer (BRET) experiments, we reveal V2R’s ability to interact with the Gα12 subunit, as well as the modulation of G12 heterotrimer’s conformation in response to V2R agonist arginine vasopressin (AVP). AVP-induced modulation of Gα12’s interaction with its classical effector RhoA upon stimulation with AVP suggests the engagement of RhoA, and our data also reveals that Gα12 potentiates AVP-induced cAMP production. Using diverse selective inhibition strategies, our results further define the mechanism of transactivation. Our data support a starter position of AVP-induced Src activation and discard IGF1R known agonists as the potential autocrine/paracrine factor responsible for IGF1R activation. Furthermore, our results suggest that the metalloproteinase MMP 3 is a good candidate for IGF1R transactivation. This project sheds light on lesser known signaling pathways involving V2R, which could reveal important on a physiological and pathophysiological scale, besides bringing a better understanding of the principles of GPCR signaling.