Mitocôndrias desempenham funções celulares vitais. O funcionamento dessas organelas e seu papel no metabolismo celular, não surpreendentemente, têm sido implicados no desenvolvimento de diferentes cânceres. Nos últimos anos, diversos estudos tem sugerido um papel importante para as mitocôndrias e o metabolismo celular na resposta à terapia e na resistência de células tumorais à essa terapia. Dado o papel central da mitocôndria na homeostase celular, avaliamos as alterações mitocondriais e metabólicas em células de glioblastoma em resposta ao tratamento com o quimioterápico Temozolomida (TMZ). O tratamento agudo com TMZ induziu um aumento transitório tanto na massa mitocondrial como no potencial de membrana mitocondrial (MMP) 5 dias após o tratamento, seguido de uma diminuição dos mesmos parâmetros no sétimo dia. O aumento desses parâmetros é acompanhado por uma diminuição nos níveis de expressão de PGC1a no dia 3 e um aumento progressivo nos níveis de autofagia, sugerindo que o aumento de massa mitocondrial é independente de PGC1a, podendo ser devido à um acúmulo de mitocôndrias. Além disso, o aumento de massa mitocondrial e potencial de membrana se correlacionam com os níveis mais elevados de estresse oxidativo e senescência no D5. Também foram avaliadas taxas de consumo de oxigênio tanto em células controle como tratadas com TMZ, observando-se no D5 células apresentam essas taxas elevadas e uma maior capacidade reserva. A fim de entender como alterações mitocondriais podem influenciar na resposta à quimioterapia, nós tratamos as células previamente tratadas com TMZ no dia 5 com inibidores de glicólise e/ou fosforilação oxidativa e acompanhamos o número de células. Os resultados sugerem que os inibidores diminuem a proliferação celular. Além disso, células tratadas com TMZ parecem ser mais sensíveis à inibição de fosforilação oxidativa do que glicólise, sugerindo que TMZ reprograma o metabolismo dessas células para um estado mais oxidativo. / Mitochondria play vital cellular functions. These organelles functions and roles in cellular metabolism not surprisingly have been implicated in a broad spectrum of diseases, including neurodegeneration and cancer. Lately, it has been given an important role for mitochondria and cellular metabolism in response and resistance of tumour cells to therapy. Given the central role of mitochondria in cellular homeostasis, we evaluated mitochondria network alterations in glioblastoma cells in response to treatment with the chemotherapeutic Temozolomide (TMZ). The acute treatment with TMZ induced an increase in both mitochondrial mass and mitochondrial membrane potential (MMP) 5 days after treatment, followed by a decrease in the same parameters on day 7. The increase in these parameters is accompanied by a decrease in PGC1a expression on day 3 and a progressive increase in autophagy levels, suggesting that the increase in mitochondrial mass is independent of PGC1a and may be due to an accumulation of mitochondria. Also, the increase in mitochondrial mass and MMP correlates with higher levels of oxidative stress and senescence on day 5. We also evaluated mitochondrial oxygen consumption in both control and treated with TMZ cells, observing that 5 days after treatment with TMZ cells have higher oxygen consumption rates and a higher reserve capacity. In order to understand how mitochondrial alterations influence the response to chemotherapy, we treated the cells previously treated with TMZ on D5 with glycolysis and OXPHOS inhibitors and followed cell number. Results suggest that these inhibitors abrogate TMZtreated cells proliferation. Also, TMZ-treated cells are more sensitive to OXPHOS inhibition than control cells, suggesting that TMZ reprograms the cells metabolism to a more oxidative state instead of a glycolytic one.

Proefschrift Universiteit van Amsterdam. / Met lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

Glioblastomas (GBMs) são os tumores primários (gliomas) mais comuns e agressivos do Sistema Nervosos Central, classificados pelos oncologistas como um dos maiores desafios da oncoterapia. O prognóstico dos pacientes é ruim mesmo após terapia cirúrgica seguida de radio e quimioterapia com Temozolomida (TMZ). Células de GBM apresentam resistência intrínseca à apoptose, porém, se mostram mais sensíveis à indução de senescência, autofagia e catástrofe mitótica. Resveratrol (Rsv) é um polifenol com ação neuroprotetora ao tecido neural sadio e, por outro lado, ação citotóxica em células de GBM. Porém, o mecanismo de ação do Rsv nestas células ainda não está esclarecido. O objetivo do presente trabalho é avaliar o mecanismo de ação do Rsv, bem como o efeito do co-tratamento de Rsv e TMZ, em células de GBM. Rsv reduziu o número de células em 3 linhagens de GBM humano, induzindo autofagia e acúmulo de células nas fases S-G2/M do ciclo celular, com aumento de pCdc2(Y15), das ciclinas E, A e B e redução de ciclina D1. A inibição da autofagia induzida pelo Rsv aumentou a toxicidade do composto, ativou a apoptose (acompanhado do aumento de Bax e de clivagem de caspase 3) e inibiu a parada no ciclo celular induzida pelo Rsv, reduzindo os níveis das ciclinas e de pCdc2 (Y15). Estes dados sugerem um papel citoprotetor da autofagia no efeito do Rsv. Por outro lado, Rsv potencializou o efeito citotóxico da TMZ através da inibição da parada em G2/M induzido pela TMZ, sem reduzir o dano ao DNA induzido pela TMZ ou a ativação da proteína de reconhecimento de dano ATM. Núcleos das células expostas ao co-tratamento apresentaram características típicas de catástrofe mitótica, acompanhado pelo acúmulo de ciclina B e redução de pCdc2(Y15). Através de uma ferramenta de análise morfométrica nuclear desenvolvida por nós, mostramos que o cotratamento de Rsv e TMZ induziu um aumento no número de núcleos em catástrofe mitótica. Em conclusão, Rsv apresentou potencial aplicação em GBM a ser testada em modelos in vivo deste tumor, tanto como terapia primária (especialmente se combinado a inibidores de autofagia) ou como adjuvante à TMZ. Uma vez que as células cancerosas são resistentes à morte celular e sabendo que um único composto geralmente modula mais de um mecanismo celular, é importante considerar estas interações para o desenvolvimento de alternativas para sensibilizar as células cancerosas e aumentar a eficácia terapêutica. / Glioblastomas (GBM) are the most common and aggressive primary tumors (gliomas) of the Central Nervous System, classified by oncologists as one of the biggest challenges of oncotherapy. The prognosis for patients is poor, even after surgical therapy followed by radiotherapy and chemotherapy with Temozolomide (TMZ). GBM cells are intrinsically resistance to apoptosis, but more sensitive to the induction of senescence, autophagy and mitotic catastrophe. Resveratrol (Rsv) is a polyphenol with a neuroprotective effect on healthy neural tissue but it has a a cytotoxic activity in GBM cells. Unfortunately, the mechanism of action of Rsv in these cells is still unclear. The aim of this study is to assess the mechanism of action of Rsv, as well as the effect of co-treatment of Rsv and TMZ in GBM cells. Rsv reduced the number of cells in three cell lines of human GBM, inducing autophagy and accumulation of cells in S-G2/M phase of cell cycle, increasing pCdc2 (Y15), pRb (S807/811), cyclins E, A and B, and reducing cyclin D1. Inhibition of Rsvinduced autophagy slightly increased the toxicity of the Rsv , accompained by triggering apoptosis (accompanied by an increase of Bax and cleavage of caspase 3) and inhibition of cell cycle arrest induced by Rsv, reducing the levels of cyclins and pCdc2 (Y15) in relation to Rsv alone, suggesting a cytoprotective role of autophagy in the effect of Rsv. Moreover, Rsv enhanced the cytotoxic effect of TMZ by abrogate the arrest in G2/M induced by TMZ, without reducing the DNA damage induced by TMZ or the activation of protein damage recognition ATM. Nuclei of cells exposed to co-treatment showed typical features of mitotic catastrophe, accompanied by the accumulation of cyclin B and reduced pCdc2 (Y15). Through a tool developed by us, we demonstrate that in fact the cotreatment induced an increase of nuclei with irregularities typical of mitotic catastrophe. In conclusion, Rsv has potential application in GBM, both as primary therapy (especially if combined with inhibitors of autophagy) or as adjuvant to TMZ. Since cancer cells are resistant to cell death and understanding that a single compound usually modulates more than one cellular mechanism, it is important to consider these interactions to the development of alternatives to sensitize cancer cells and increase therapeutic efficacy.

Mitocôndrias desempenham funções celulares vitais. O funcionamento dessas organelas e seu papel no metabolismo celular, não surpreendentemente, têm sido implicados no desenvolvimento de diferentes cânceres. Nos últimos anos, diversos estudos tem sugerido um papel importante para as mitocôndrias e o metabolismo celular na resposta à terapia e na resistência de células tumorais à essa terapia. Dado o papel central da mitocôndria na homeostase celular, avaliamos as alterações mitocondriais e metabólicas em células de glioblastoma em resposta ao tratamento com o quimioterápico Temozolomida (TMZ). O tratamento agudo com TMZ induziu um aumento transitório tanto na massa mitocondrial como no potencial de membrana mitocondrial (MMP) 5 dias após o tratamento, seguido de uma diminuição dos mesmos parâmetros no sétimo dia. O aumento desses parâmetros é acompanhado por uma diminuição nos níveis de expressão de PGC1a no dia 3 e um aumento progressivo nos níveis de autofagia, sugerindo que o aumento de massa mitocondrial é independente de PGC1a, podendo ser devido à um acúmulo de mitocôndrias. Além disso, o aumento de massa mitocondrial e potencial de membrana se correlacionam com os níveis mais elevados de estresse oxidativo e senescência no D5. Também foram avaliadas taxas de consumo de oxigênio tanto em células controle como tratadas com TMZ, observando-se no D5 células apresentam essas taxas elevadas e uma maior capacidade reserva. A fim de entender como alterações mitocondriais podem influenciar na resposta à quimioterapia, nós tratamos as células previamente tratadas com TMZ no dia 5 com inibidores de glicólise e/ou fosforilação oxidativa e acompanhamos o número de células. Os resultados sugerem que os inibidores diminuem a proliferação celular. Além disso, células tratadas com TMZ parecem ser mais sensíveis à inibição de fosforilação oxidativa do que glicólise, sugerindo que TMZ reprograma o metabolismo dessas células para um estado mais oxidativo. / Mitochondria play vital cellular functions. These organelles functions and roles in cellular metabolism not surprisingly have been implicated in a broad spectrum of diseases, including neurodegeneration and cancer. Lately, it has been given an important role for mitochondria and cellular metabolism in response and resistance of tumour cells to therapy. Given the central role of mitochondria in cellular homeostasis, we evaluated mitochondria network alterations in glioblastoma cells in response to treatment with the chemotherapeutic Temozolomide (TMZ). The acute treatment with TMZ induced an increase in both mitochondrial mass and mitochondrial membrane potential (MMP) 5 days after treatment, followed by a decrease in the same parameters on day 7. The increase in these parameters is accompanied by a decrease in PGC1a expression on day 3 and a progressive increase in autophagy levels, suggesting that the increase in mitochondrial mass is independent of PGC1a and may be due to an accumulation of mitochondria. Also, the increase in mitochondrial mass and MMP correlates with higher levels of oxidative stress and senescence on day 5. We also evaluated mitochondrial oxygen consumption in both control and treated with TMZ cells, observing that 5 days after treatment with TMZ cells have higher oxygen consumption rates and a higher reserve capacity. In order to understand how mitochondrial alterations influence the response to chemotherapy, we treated the cells previously treated with TMZ on D5 with glycolysis and OXPHOS inhibitors and followed cell number. Results suggest that these inhibitors abrogate TMZtreated cells proliferation. Also, TMZ-treated cells are more sensitive to OXPHOS inhibition than control cells, suggesting that TMZ reprograms the cells metabolism to a more oxidative state instead of a glycolytic one.

Glioblastomas (GBMs) são os tumores primários (gliomas) mais comuns e agressivos do Sistema Nervosos Central, classificados pelos oncologistas como um dos maiores desafios da oncoterapia. O prognóstico dos pacientes é ruim mesmo após terapia cirúrgica seguida de radio e quimioterapia com Temozolomida (TMZ). Células de GBM apresentam resistência intrínseca à apoptose, porém, se mostram mais sensíveis à indução de senescência, autofagia e catástrofe mitótica. Resveratrol (Rsv) é um polifenol com ação neuroprotetora ao tecido neural sadio e, por outro lado, ação citotóxica em células de GBM. Porém, o mecanismo de ação do Rsv nestas células ainda não está esclarecido. O objetivo do presente trabalho é avaliar o mecanismo de ação do Rsv, bem como o efeito do co-tratamento de Rsv e TMZ, em células de GBM. Rsv reduziu o número de células em 3 linhagens de GBM humano, induzindo autofagia e acúmulo de células nas fases S-G2/M do ciclo celular, com aumento de pCdc2(Y15), das ciclinas E, A e B e redução de ciclina D1. A inibição da autofagia induzida pelo Rsv aumentou a toxicidade do composto, ativou a apoptose (acompanhado do aumento de Bax e de clivagem de caspase 3) e inibiu a parada no ciclo celular induzida pelo Rsv, reduzindo os níveis das ciclinas e de pCdc2 (Y15). Estes dados sugerem um papel citoprotetor da autofagia no efeito do Rsv. Por outro lado, Rsv potencializou o efeito citotóxico da TMZ através da inibição da parada em G2/M induzido pela TMZ, sem reduzir o dano ao DNA induzido pela TMZ ou a ativação da proteína de reconhecimento de dano ATM. Núcleos das células expostas ao co-tratamento apresentaram características típicas de catástrofe mitótica, acompanhado pelo acúmulo de ciclina B e redução de pCdc2(Y15). Através de uma ferramenta de análise morfométrica nuclear desenvolvida por nós, mostramos que o cotratamento de Rsv e TMZ induziu um aumento no número de núcleos em catástrofe mitótica. Em conclusão, Rsv apresentou potencial aplicação em GBM a ser testada em modelos in vivo deste tumor, tanto como terapia primária (especialmente se combinado a inibidores de autofagia) ou como adjuvante à TMZ. Uma vez que as células cancerosas são resistentes à morte celular e sabendo que um único composto geralmente modula mais de um mecanismo celular, é importante considerar estas interações para o desenvolvimento de alternativas para sensibilizar as células cancerosas e aumentar a eficácia terapêutica. / Glioblastomas (GBM) are the most common and aggressive primary tumors (gliomas) of the Central Nervous System, classified by oncologists as one of the biggest challenges of oncotherapy. The prognosis for patients is poor, even after surgical therapy followed by radiotherapy and chemotherapy with Temozolomide (TMZ). GBM cells are intrinsically resistance to apoptosis, but more sensitive to the induction of senescence, autophagy and mitotic catastrophe. Resveratrol (Rsv) is a polyphenol with a neuroprotective effect on healthy neural tissue but it has a a cytotoxic activity in GBM cells. Unfortunately, the mechanism of action of Rsv in these cells is still unclear. The aim of this study is to assess the mechanism of action of Rsv, as well as the effect of co-treatment of Rsv and TMZ in GBM cells. Rsv reduced the number of cells in three cell lines of human GBM, inducing autophagy and accumulation of cells in S-G2/M phase of cell cycle, increasing pCdc2 (Y15), pRb (S807/811), cyclins E, A and B, and reducing cyclin D1. Inhibition of Rsvinduced autophagy slightly increased the toxicity of the Rsv , accompained by triggering apoptosis (accompanied by an increase of Bax and cleavage of caspase 3) and inhibition of cell cycle arrest induced by Rsv, reducing the levels of cyclins and pCdc2 (Y15) in relation to Rsv alone, suggesting a cytoprotective role of autophagy in the effect of Rsv. Moreover, Rsv enhanced the cytotoxic effect of TMZ by abrogate the arrest in G2/M induced by TMZ, without reducing the DNA damage induced by TMZ or the activation of protein damage recognition ATM. Nuclei of cells exposed to co-treatment showed typical features of mitotic catastrophe, accompanied by the accumulation of cyclin B and reduced pCdc2 (Y15). Through a tool developed by us, we demonstrate that in fact the cotreatment induced an increase of nuclei with irregularities typical of mitotic catastrophe. In conclusion, Rsv has potential application in GBM, both as primary therapy (especially if combined with inhibitors of autophagy) or as adjuvant to TMZ. Since cancer cells are resistant to cell death and understanding that a single compound usually modulates more than one cellular mechanism, it is important to consider these interactions to the development of alternatives to sensitize cancer cells and increase therapeutic efficacy.

Glioblastoma is the most common and fatal adult primary brain tumour. Despite maximum therapy, median survival time is 14 months after diagnosis. Senescence is a cellular stress response that results in irreversible growth arrest with continued metabolic activity. It has been shown to be a novel mechanism to inhibit tumorigenesis and tumor progression. However, the role of senescence in glioblastoma is poorly understood. Furthermore, resistance to therapy is believed to be in large part due to extensive heterogeneity in glioblastoma at the molecular level. While this has shed light on the biological understanding of glioblastoma, the impact of such heterogeneity in glioblastoma with respect to therapeutic mechanisms such as senescence induction is largely unknown and warrants further investigation. Primary glioblastoma cells constitute an important model of study as they are a closer representation of the parent disease. In the present study, previously isolated primary glioblastoma cells from human patients were characterized according to their molecular subtype by microarray expression analysis. PriGO7A, PriGO8A and PriGO9A cells were predominantly of the classical subtype whereas PriGO17A were predominantly mesenchymal. I investigated the response of these PriGO cells towards various stress inducing agents to determine their capability to undergo senescence. PriGO8A and PriGO9A cells underwent senescence in response to serum characterized by increased SAβGal activity, PML bodies, p21 and morphological changes characteristic of senescence. This occurred in the absence of a detectable DNA damage response as seen without an increase in γH2AX foci. There was also a lack of a senescence-associated secretory phenotype. Ionizing radiation, known to induce senescence in fibroblasts by inducing double stranded DNA damage, caused cell death but not senescence in PriGO8A and PriGO9A cells. Similarly, exposure of PriGO8A and PriGO9A cells to Triapine (an agent known to cause single stranded DNA damage) induced cell death without senescence. PriGO17A cells did not show evidence of cell death or senescence upon exposure to any of the above agents. In subsequent studies, I investigated the molecular mechanism responsible for induction of senescence in PriGO cells. Microarray expression analysis revealed that serum exposure in PriGO8A cells increased the expression of genes associated with the Transforming growth factor-β (TGFβ) pathway. The response of PriGO8A cells to serum was attributed at least in part to TGFβ that was dependent on basal expression of the TGFβ activator protein thrombospondin. PriGO7A cells lacked basal thrombospondin expression and did not undergo senescence in response to serum, but exhibited senescence in response to TGFβ. PriGO17A cells, on the other hand, exhibited senescence in response to TGFβ only when Ras activity was blocked. In conclusion, primary glioblastoma cells retain a functional senescence program capable of undergoing senescence in response to TGFβ, which suggests senescence can potentially be exploited therapeutically in glioblastoma. In addition, the response to therapeutic agents in glioblastoma is influenced by the molecular heterogeneity present in primary glioblastoma cells not only of different subtypes but also within the same subtype.

Mitocôndrias desempenham funções celulares vitais. O funcionamento dessas organelas e seu papel no metabolismo celular, não surpreendentemente, têm sido implicados no desenvolvimento de diferentes cânceres. Nos últimos anos, diversos estudos tem sugerido um papel importante para as mitocôndrias e o metabolismo celular na resposta à terapia e na resistência de células tumorais à essa terapia. Dado o papel central da mitocôndria na homeostase celular, avaliamos as alterações mitocondriais e metabólicas em células de glioblastoma em resposta ao tratamento com o quimioterápico Temozolomida (TMZ). O tratamento agudo com TMZ induziu um aumento transitório tanto na massa mitocondrial como no potencial de membrana mitocondrial (MMP) 5 dias após o tratamento, seguido de uma diminuição dos mesmos parâmetros no sétimo dia. O aumento desses parâmetros é acompanhado por uma diminuição nos níveis de expressão de PGC1a no dia 3 e um aumento progressivo nos níveis de autofagia, sugerindo que o aumento de massa mitocondrial é independente de PGC1a, podendo ser devido à um acúmulo de mitocôndrias. Além disso, o aumento de massa mitocondrial e potencial de membrana se correlacionam com os níveis mais elevados de estresse oxidativo e senescência no D5. Também foram avaliadas taxas de consumo de oxigênio tanto em células controle como tratadas com TMZ, observando-se no D5 células apresentam essas taxas elevadas e uma maior capacidade reserva. A fim de entender como alterações mitocondriais podem influenciar na resposta à quimioterapia, nós tratamos as células previamente tratadas com TMZ no dia 5 com inibidores de glicólise e/ou fosforilação oxidativa e acompanhamos o número de células. Os resultados sugerem que os inibidores diminuem a proliferação celular. Além disso, células tratadas com TMZ parecem ser mais sensíveis à inibição de fosforilação oxidativa do que glicólise, sugerindo que TMZ reprograma o metabolismo dessas células para um estado mais oxidativo. / Mitochondria play vital cellular functions. These organelles functions and roles in cellular metabolism not surprisingly have been implicated in a broad spectrum of diseases, including neurodegeneration and cancer. Lately, it has been given an important role for mitochondria and cellular metabolism in response and resistance of tumour cells to therapy. Given the central role of mitochondria in cellular homeostasis, we evaluated mitochondria network alterations in glioblastoma cells in response to treatment with the chemotherapeutic Temozolomide (TMZ). The acute treatment with TMZ induced an increase in both mitochondrial mass and mitochondrial membrane potential (MMP) 5 days after treatment, followed by a decrease in the same parameters on day 7. The increase in these parameters is accompanied by a decrease in PGC1a expression on day 3 and a progressive increase in autophagy levels, suggesting that the increase in mitochondrial mass is independent of PGC1a and may be due to an accumulation of mitochondria. Also, the increase in mitochondrial mass and MMP correlates with higher levels of oxidative stress and senescence on day 5. We also evaluated mitochondrial oxygen consumption in both control and treated with TMZ cells, observing that 5 days after treatment with TMZ cells have higher oxygen consumption rates and a higher reserve capacity. In order to understand how mitochondrial alterations influence the response to chemotherapy, we treated the cells previously treated with TMZ on D5 with glycolysis and OXPHOS inhibitors and followed cell number. Results suggest that these inhibitors abrogate TMZtreated cells proliferation. Also, TMZ-treated cells are more sensitive to OXPHOS inhibition than control cells, suggesting that TMZ reprograms the cells metabolism to a more oxidative state instead of a glycolytic one.

Glioblastomas (GBMs) são os tumores primários (gliomas) mais comuns e agressivos do Sistema Nervosos Central, classificados pelos oncologistas como um dos maiores desafios da oncoterapia. O prognóstico dos pacientes é ruim mesmo após terapia cirúrgica seguida de radio e quimioterapia com Temozolomida (TMZ). Células de GBM apresentam resistência intrínseca à apoptose, porém, se mostram mais sensíveis à indução de senescência, autofagia e catástrofe mitótica. Resveratrol (Rsv) é um polifenol com ação neuroprotetora ao tecido neural sadio e, por outro lado, ação citotóxica em células de GBM. Porém, o mecanismo de ação do Rsv nestas células ainda não está esclarecido. O objetivo do presente trabalho é avaliar o mecanismo de ação do Rsv, bem como o efeito do co-tratamento de Rsv e TMZ, em células de GBM. Rsv reduziu o número de células em 3 linhagens de GBM humano, induzindo autofagia e acúmulo de células nas fases S-G2/M do ciclo celular, com aumento de pCdc2(Y15), das ciclinas E, A e B e redução de ciclina D1. A inibição da autofagia induzida pelo Rsv aumentou a toxicidade do composto, ativou a apoptose (acompanhado do aumento de Bax e de clivagem de caspase 3) e inibiu a parada no ciclo celular induzida pelo Rsv, reduzindo os níveis das ciclinas e de pCdc2 (Y15). Estes dados sugerem um papel citoprotetor da autofagia no efeito do Rsv. Por outro lado, Rsv potencializou o efeito citotóxico da TMZ através da inibição da parada em G2/M induzido pela TMZ, sem reduzir o dano ao DNA induzido pela TMZ ou a ativação da proteína de reconhecimento de dano ATM. Núcleos das células expostas ao co-tratamento apresentaram características típicas de catástrofe mitótica, acompanhado pelo acúmulo de ciclina B e redução de pCdc2(Y15). Através de uma ferramenta de análise morfométrica nuclear desenvolvida por nós, mostramos que o cotratamento de Rsv e TMZ induziu um aumento no número de núcleos em catástrofe mitótica. Em conclusão, Rsv apresentou potencial aplicação em GBM a ser testada em modelos in vivo deste tumor, tanto como terapia primária (especialmente se combinado a inibidores de autofagia) ou como adjuvante à TMZ. Uma vez que as células cancerosas são resistentes à morte celular e sabendo que um único composto geralmente modula mais de um mecanismo celular, é importante considerar estas interações para o desenvolvimento de alternativas para sensibilizar as células cancerosas e aumentar a eficácia terapêutica. / Glioblastomas (GBM) are the most common and aggressive primary tumors (gliomas) of the Central Nervous System, classified by oncologists as one of the biggest challenges of oncotherapy. The prognosis for patients is poor, even after surgical therapy followed by radiotherapy and chemotherapy with Temozolomide (TMZ). GBM cells are intrinsically resistance to apoptosis, but more sensitive to the induction of senescence, autophagy and mitotic catastrophe. Resveratrol (Rsv) is a polyphenol with a neuroprotective effect on healthy neural tissue but it has a a cytotoxic activity in GBM cells. Unfortunately, the mechanism of action of Rsv in these cells is still unclear. The aim of this study is to assess the mechanism of action of Rsv, as well as the effect of co-treatment of Rsv and TMZ in GBM cells. Rsv reduced the number of cells in three cell lines of human GBM, inducing autophagy and accumulation of cells in S-G2/M phase of cell cycle, increasing pCdc2 (Y15), pRb (S807/811), cyclins E, A and B, and reducing cyclin D1. Inhibition of Rsvinduced autophagy slightly increased the toxicity of the Rsv , accompained by triggering apoptosis (accompanied by an increase of Bax and cleavage of caspase 3) and inhibition of cell cycle arrest induced by Rsv, reducing the levels of cyclins and pCdc2 (Y15) in relation to Rsv alone, suggesting a cytoprotective role of autophagy in the effect of Rsv. Moreover, Rsv enhanced the cytotoxic effect of TMZ by abrogate the arrest in G2/M induced by TMZ, without reducing the DNA damage induced by TMZ or the activation of protein damage recognition ATM. Nuclei of cells exposed to co-treatment showed typical features of mitotic catastrophe, accompanied by the accumulation of cyclin B and reduced pCdc2 (Y15). Through a tool developed by us, we demonstrate that in fact the cotreatment induced an increase of nuclei with irregularities typical of mitotic catastrophe. In conclusion, Rsv has potential application in GBM, both as primary therapy (especially if combined with inhibitors of autophagy) or as adjuvant to TMZ. Since cancer cells are resistant to cell death and understanding that a single compound usually modulates more than one cellular mechanism, it is important to consider these interactions to the development of alternatives to sensitize cancer cells and increase therapeutic efficacy.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Secondary gliomas are an incurable form of brain cancer that are diagnosed in people at a median age of 45 years. Next-generation sequencing has found that secondary glioblastomas have a distinct genetic profile from the more common primary glioblastomas, which are diagnosed in people typically over the age of 60. Over 80% of secondary gliomas contain an IDH1R132H mutation, resulting in neomorphic mutations, which catalyze isocitrate to the oncometabolite D-2-hydroxyglutarate (2-HG) instead of alpha-ketoglutarate (α-KG). As 2-HG accumulates, it induces a hypermethylator phenotype that prevents the cells from differentiating. Acquisition of additional mutations in tumor suppressors such as p53 and/or ATRX likely leads to tumor initiation. Work in the Wells Laboratory has found that loss of the HIPPO adaptor protein AmotL1 is also associated with increased malignancy. AmotL1 inhibits the transcriptional co-activator YAP to suppress both cell growth and migration. To understand the molecular events leading to secondary glioma development, this thesis developed a series of astrocyte cell lines that carry IDH1 and/or p53 mutations. These lines were then studied in 2D and 3D cell culture systems to identify changes that are associated with early secondary glial tumors. Work was also carried out to enable screens for small molecules that can be tested on these cell lines.

Class of 2007 Abstract / Objectives: To evaluate the efficacy of carmustine wafers over placebo plus surgery in the treatment of primary glioblastoma multiforme. Methods: Searches of MEDLINE (1966-2007), ASH (American Society of Hematology) abstracts, and ASCO (American Society of Clinical Oncology) abstracts were conducted to obtain clinical outcomes data (meta- analysis, randomized controlled studies) for the carmustine wafers or for the traditional form of therapy, surgical resection of glioblastoma multiforme. Serious adverse events associated with the chemotherapeutic agent were identified and their respective rates of incidence calculated. Three prospective randomized controlled trials were used to provide point estimates and distributions for the Monte Carlo simulation. Parameters used to populate the Markov model were derived from the extant primary literature for patients undergoing surgical resection with either carmustine or placebo for glioblastoma multiforme. The base case was a 50 year old male with primary glioma. Results: Findings indicated that carmustine wafers increased survival over placebo from 54.05 months [95% confidence interval 46.25-61.07] to 69.87 months [95% confidence interval 67.02-71.94]. Serious side effects such as intracranial hemorrhage, seizures, and infections were also taken into account in the decision analytic model. Conclusions: Carmustine wafers significantly increase survival in patients undergoing surgical resection for glioblastoma multiforme. Therefore, carmustine wafers should be used as an adjunct to surgery in these patients.