Mitocôndrias desempenham funções celulares vitais. O funcionamento dessas organelas e seu papel no metabolismo celular, não surpreendentemente, têm sido implicados no desenvolvimento de diferentes cânceres. Nos últimos anos, diversos estudos tem sugerido um papel importante para as mitocôndrias e o metabolismo celular na resposta à terapia e na resistência de células tumorais à essa terapia. Dado o papel central da mitocôndria na homeostase celular, avaliamos as alterações mitocondriais e metabólicas em células de glioblastoma em resposta ao tratamento com o quimioterápico Temozolomida (TMZ). O tratamento agudo com TMZ induziu um aumento transitório tanto na massa mitocondrial como no potencial de membrana mitocondrial (MMP) 5 dias após o tratamento, seguido de uma diminuição dos mesmos parâmetros no sétimo dia. O aumento desses parâmetros é acompanhado por uma diminuição nos níveis de expressão de PGC1a no dia 3 e um aumento progressivo nos níveis de autofagia, sugerindo que o aumento de massa mitocondrial é independente de PGC1a, podendo ser devido à um acúmulo de mitocôndrias. Além disso, o aumento de massa mitocondrial e potencial de membrana se correlacionam com os níveis mais elevados de estresse oxidativo e senescência no D5. Também foram avaliadas taxas de consumo de oxigênio tanto em células controle como tratadas com TMZ, observando-se no D5 células apresentam essas taxas elevadas e uma maior capacidade reserva. A fim de entender como alterações mitocondriais podem influenciar na resposta à quimioterapia, nós tratamos as células previamente tratadas com TMZ no dia 5 com inibidores de glicólise e/ou fosforilação oxidativa e acompanhamos o número de células. Os resultados sugerem que os inibidores diminuem a proliferação celular. Além disso, células tratadas com TMZ parecem ser mais sensíveis à inibição de fosforilação oxidativa do que glicólise, sugerindo que TMZ reprograma o metabolismo dessas células para um estado mais oxidativo. / Mitochondria play vital cellular functions. These organelles functions and roles in cellular metabolism not surprisingly have been implicated in a broad spectrum of diseases, including neurodegeneration and cancer. Lately, it has been given an important role for mitochondria and cellular metabolism in response and resistance of tumour cells to therapy. Given the central role of mitochondria in cellular homeostasis, we evaluated mitochondria network alterations in glioblastoma cells in response to treatment with the chemotherapeutic Temozolomide (TMZ). The acute treatment with TMZ induced an increase in both mitochondrial mass and mitochondrial membrane potential (MMP) 5 days after treatment, followed by a decrease in the same parameters on day 7. The increase in these parameters is accompanied by a decrease in PGC1a expression on day 3 and a progressive increase in autophagy levels, suggesting that the increase in mitochondrial mass is independent of PGC1a and may be due to an accumulation of mitochondria. Also, the increase in mitochondrial mass and MMP correlates with higher levels of oxidative stress and senescence on day 5. We also evaluated mitochondrial oxygen consumption in both control and treated with TMZ cells, observing that 5 days after treatment with TMZ cells have higher oxygen consumption rates and a higher reserve capacity. In order to understand how mitochondrial alterations influence the response to chemotherapy, we treated the cells previously treated with TMZ on D5 with glycolysis and OXPHOS inhibitors and followed cell number. Results suggest that these inhibitors abrogate TMZtreated cells proliferation. Also, TMZ-treated cells are more sensitive to OXPHOS inhibition than control cells, suggesting that TMZ reprograms the cells metabolism to a more oxidative state instead of a glycolytic one.

Mitocôndrias desempenham funções celulares vitais. O funcionamento dessas organelas e seu papel no metabolismo celular, não surpreendentemente, têm sido implicados no desenvolvimento de diferentes cânceres. Nos últimos anos, diversos estudos tem sugerido um papel importante para as mitocôndrias e o metabolismo celular na resposta à terapia e na resistência de células tumorais à essa terapia. Dado o papel central da mitocôndria na homeostase celular, avaliamos as alterações mitocondriais e metabólicas em células de glioblastoma em resposta ao tratamento com o quimioterápico Temozolomida (TMZ). O tratamento agudo com TMZ induziu um aumento transitório tanto na massa mitocondrial como no potencial de membrana mitocondrial (MMP) 5 dias após o tratamento, seguido de uma diminuição dos mesmos parâmetros no sétimo dia. O aumento desses parâmetros é acompanhado por uma diminuição nos níveis de expressão de PGC1a no dia 3 e um aumento progressivo nos níveis de autofagia, sugerindo que o aumento de massa mitocondrial é independente de PGC1a, podendo ser devido à um acúmulo de mitocôndrias. Além disso, o aumento de massa mitocondrial e potencial de membrana se correlacionam com os níveis mais elevados de estresse oxidativo e senescência no D5. Também foram avaliadas taxas de consumo de oxigênio tanto em células controle como tratadas com TMZ, observando-se no D5 células apresentam essas taxas elevadas e uma maior capacidade reserva. A fim de entender como alterações mitocondriais podem influenciar na resposta à quimioterapia, nós tratamos as células previamente tratadas com TMZ no dia 5 com inibidores de glicólise e/ou fosforilação oxidativa e acompanhamos o número de células. Os resultados sugerem que os inibidores diminuem a proliferação celular. Além disso, células tratadas com TMZ parecem ser mais sensíveis à inibição de fosforilação oxidativa do que glicólise, sugerindo que TMZ reprograma o metabolismo dessas células para um estado mais oxidativo. / Mitochondria play vital cellular functions. These organelles functions and roles in cellular metabolism not surprisingly have been implicated in a broad spectrum of diseases, including neurodegeneration and cancer. Lately, it has been given an important role for mitochondria and cellular metabolism in response and resistance of tumour cells to therapy. Given the central role of mitochondria in cellular homeostasis, we evaluated mitochondria network alterations in glioblastoma cells in response to treatment with the chemotherapeutic Temozolomide (TMZ). The acute treatment with TMZ induced an increase in both mitochondrial mass and mitochondrial membrane potential (MMP) 5 days after treatment, followed by a decrease in the same parameters on day 7. The increase in these parameters is accompanied by a decrease in PGC1a expression on day 3 and a progressive increase in autophagy levels, suggesting that the increase in mitochondrial mass is independent of PGC1a and may be due to an accumulation of mitochondria. Also, the increase in mitochondrial mass and MMP correlates with higher levels of oxidative stress and senescence on day 5. We also evaluated mitochondrial oxygen consumption in both control and treated with TMZ cells, observing that 5 days after treatment with TMZ cells have higher oxygen consumption rates and a higher reserve capacity. In order to understand how mitochondrial alterations influence the response to chemotherapy, we treated the cells previously treated with TMZ on D5 with glycolysis and OXPHOS inhibitors and followed cell number. Results suggest that these inhibitors abrogate TMZtreated cells proliferation. Also, TMZ-treated cells are more sensitive to OXPHOS inhibition than control cells, suggesting that TMZ reprograms the cells metabolism to a more oxidative state instead of a glycolytic one.

Mitocôndrias desempenham funções celulares vitais. O funcionamento dessas organelas e seu papel no metabolismo celular, não surpreendentemente, têm sido implicados no desenvolvimento de diferentes cânceres. Nos últimos anos, diversos estudos tem sugerido um papel importante para as mitocôndrias e o metabolismo celular na resposta à terapia e na resistência de células tumorais à essa terapia. Dado o papel central da mitocôndria na homeostase celular, avaliamos as alterações mitocondriais e metabólicas em células de glioblastoma em resposta ao tratamento com o quimioterápico Temozolomida (TMZ). O tratamento agudo com TMZ induziu um aumento transitório tanto na massa mitocondrial como no potencial de membrana mitocondrial (MMP) 5 dias após o tratamento, seguido de uma diminuição dos mesmos parâmetros no sétimo dia. O aumento desses parâmetros é acompanhado por uma diminuição nos níveis de expressão de PGC1a no dia 3 e um aumento progressivo nos níveis de autofagia, sugerindo que o aumento de massa mitocondrial é independente de PGC1a, podendo ser devido à um acúmulo de mitocôndrias. Além disso, o aumento de massa mitocondrial e potencial de membrana se correlacionam com os níveis mais elevados de estresse oxidativo e senescência no D5. Também foram avaliadas taxas de consumo de oxigênio tanto em células controle como tratadas com TMZ, observando-se no D5 células apresentam essas taxas elevadas e uma maior capacidade reserva. A fim de entender como alterações mitocondriais podem influenciar na resposta à quimioterapia, nós tratamos as células previamente tratadas com TMZ no dia 5 com inibidores de glicólise e/ou fosforilação oxidativa e acompanhamos o número de células. Os resultados sugerem que os inibidores diminuem a proliferação celular. Além disso, células tratadas com TMZ parecem ser mais sensíveis à inibição de fosforilação oxidativa do que glicólise, sugerindo que TMZ reprograma o metabolismo dessas células para um estado mais oxidativo. / Mitochondria play vital cellular functions. These organelles functions and roles in cellular metabolism not surprisingly have been implicated in a broad spectrum of diseases, including neurodegeneration and cancer. Lately, it has been given an important role for mitochondria and cellular metabolism in response and resistance of tumour cells to therapy. Given the central role of mitochondria in cellular homeostasis, we evaluated mitochondria network alterations in glioblastoma cells in response to treatment with the chemotherapeutic Temozolomide (TMZ). The acute treatment with TMZ induced an increase in both mitochondrial mass and mitochondrial membrane potential (MMP) 5 days after treatment, followed by a decrease in the same parameters on day 7. The increase in these parameters is accompanied by a decrease in PGC1a expression on day 3 and a progressive increase in autophagy levels, suggesting that the increase in mitochondrial mass is independent of PGC1a and may be due to an accumulation of mitochondria. Also, the increase in mitochondrial mass and MMP correlates with higher levels of oxidative stress and senescence on day 5. We also evaluated mitochondrial oxygen consumption in both control and treated with TMZ cells, observing that 5 days after treatment with TMZ cells have higher oxygen consumption rates and a higher reserve capacity. In order to understand how mitochondrial alterations influence the response to chemotherapy, we treated the cells previously treated with TMZ on D5 with glycolysis and OXPHOS inhibitors and followed cell number. Results suggest that these inhibitors abrogate TMZtreated cells proliferation. Also, TMZ-treated cells are more sensitive to OXPHOS inhibition than control cells, suggesting that TMZ reprograms the cells metabolism to a more oxidative state instead of a glycolytic one.

Autofagia é um processo de degradação fisiológico aumentado em diferentes condições de estresse, em que proteínas e organelas não funcionais são direcionadas ao lisossomo, onde são degradadas e os produtos da degradação reutilizados pela célula. Senescência é o processo em que as células param de dividir e entram em um estado de parada celular irreversível. Os dois processos, autofagia e senescência, podem ser induzidos na presença de dano no DNA, porém a maquinaria molecular que realiza a intermediação neste processo ainda é incerta. Temozolomida (TMZ) é um agente alquilante, usado para tratar pacientes com Glioblastoma, que induz dano no DNA. Lesões produzidas por TMZ ativam a resposta ao dano no DNA (DDR), uma sinalização complexa que medeia as respostas celulares, tais como a dinâmica do ciclo celular, autofagia, senescência e morte celular, ao dano genotóxico. Dada a importância desses mecanismos, esse trabalho objetiva avaliar o impacto da inibição da cinase Ataxia Telangiectasia mutada dependente de Rad3 (ATR), reguladora chave da DDR, na proliferação, autofagia e senescência em células de glioblastoma tratadas com TMZ. Para tal, nós utilizamos um inibidor farmacológico para ATR (VE-821), bem como shRNA para ATR com vetor lentiviral em células U87. A inibição farmacológica da proteína ATR não alterou o estado autofágico e de senescência em comparação com as células tratadas somente com TMZ. Esses resultados foram obtidos usando o método Laranja de Acridina (AO) e a ferramenta de Análise Morfométrica Nuclear (NMA). Na ausência de uma sinalização dependente de ATR, obtida pelas células shATR tratadas com TMZ, também não observamos alteração significativa em relação a esses processos. No entanto, nós observamos um acúmulo da proteína SQSTM1/p62, substrato da autofagia, nas células silenciadas para ATR. Esta alteração não se refletiu em aumento de foci intracelulares da proteína SQSTM1/p62. Em conclusão, ATR não parece participar diretamente da ativação da Autofagia e da Senescência induzidas por TMZ. / Autophagy is a catabolic process, that shows increased levels in stressful situations, whereby dysfunctional proteins and organelles are engulfed and targeted to lysosomes for degradation and recycled back to the cell. Senescence is the process by which cells stop dividing and enter a state of growth arrest. Both processes, autophagy and senescence, can be induced by DNA damage, however, the molecular machinery that mediates this process is still uncertain. Temozolomide (TMZ) is an alkylating agent, used to treat patients with Glioblastoma, that drives DNA damage. Lesions produced by TMZ activate the DNA damage response (DDR), a complex signalling pathway, that mediates cellular outcomes such as cell cycle distribution, autophagy, senescence and cellular death, to genotoxic damage. Given the importance of such mechanisms, this work aims to evaluate the impact of inhibiting the Ataxia telangiectasia and Rad3 related (ATR) kinase, key regulator of the DDR, on cellular proliferation, autophagy and senescence, on Glioblastoma (GBM) cells treated with TMZ. In order to do that, we used a pharmacological inhibitor for ATR (VE-821) as well as shRNA to ATR, in U87 cells using lentiviral vectors. The pharmacological inhibition of ATR did not alter the autophagic or senescence status in comparison with the cells treated with TMZ only. Such results were obtained by Acridine Orange (AO) assessment and Nuclear Morphometric Analysis (NMA) tool. In the absence of an ATR dependent signalling, assessed through shATR cells treated with TMZ, no significant alteration in relation to such processes was seen. However, we observed an accumulation of the SQSTM1/p62 protein, a selective autophagy substrate, on cells silenced for ATR. This accumulation did not reflect in increased intracellular foci formation of SQSTM1/p62 protein. In conclusion, ATR doesn't seem to play a direct role in the Autophagy and Senescence induced by TMZ.

Glioblastomas são os tumores mais agressivos do Sistema Nervoso Central (SNC). Caracterizam-se por sua alta invasibilidade, proliferação, altos índices de recorrência e morte, assim como quimio e radiorresistência. Tumores sólidos apresentam uma organização hierárquica, em que há uma pequena população de células tronco tumorais (CSCs) ou células iniciadoras de tumor (CICs). Essas células são capazes de repopular o tumor, que leva à recorrência. CSCs caracterizam-se por realizar também a mitose assimétrica, na qual parte das células continuam como CSCs e a outra parte sofre diferenciação. Essas células diferenciadas são incapazes de repopular o tumor, uma vez que perderam a sua capacidade tronco. CSCs mostraram ser relativamente resistentes as terapias anticâncer tradicionais como quimio e/ou radioterapia. Doxorrubicina (Doxo) é um agente anticâncer usado em diversos tipos de tumor e atua formando adutos no DNA e também inibindo a ação da topoisomerase II. Dependendo da concentração utilizada de Doxo, diferentes efeitos são observados; por exemplo, baixas doses (100 nM) levam à senescência celular, enquanto que altas doses (10 μM) levam à apoptose. Temozolomida (Tmz) é um anti-tumoral utilizado na terapia de diversos tumores, inclusive gliomas. Resveratrol (Rsv) é um polifenol encontrado em diversas plantas, como a uva, e possui efeitos como: neuroproteção, antiinflamatório, anti-oxidante, proteção cardíaca, entre outros. Nosso objetivo foi avaliar a influência do efeito dessas três drogas nas CSCs derivadas de glioblastoma humano. Realizou-se o ensaio de formação de esferas, um indicador da presença de CSCs, citometria de fluxo para Oct4 e Nanog e ensaio de senescência. Nossos ensaios utilizaram a linhagem U87 e dois tipos diferentes de meio de cultura. O primeiro continha DMEM Low Glucose com SFB e o segundo, um meio de cultura para células tronco (SCM), contendo DMEM F12 suplementado com FGF (fator de crescimento fibroblástico), EGF (fator de crescimento epidermal), LIF (fator inibidor de leucemia) e B27. Os tratamentos realizados utilizaram Doxo 1 e 10 nM; Tmz 5 μM e Rsv 1, 10 e 30 μM. O número de esferas formadas foi reduzido tanto em Doxo 1 quanto em 10 nM quando SFB foi utilizado. Doxo 1 não alterou o número de células Oct4 e Nanog positivas enquanto que Doxo 10 nM reduziu. Ambas as doses induziram senescência. Tmz reduziu o número de esferas formadas e também a porcentagem de células Oct4 e Nanog positivas. Usando SCM, observamos que Doxo e Tmz reduziram o número de esferas e a porcentagem de células Nanog e Oct4 positivas. Rsv 10 μM reduziu o número de esferas formadas enquanto que Rsv 30 μM reduziu o número de células positivas para CD133 e Oct4 com meio com SFB. Nossos resultados sugerem que Doxo 10 nM possui um melhor efeito nas CSCs do que Doxo 1 nM. Doxo 10 nM, além de reduzir o número de esferas, reduziu a porcentagem dos marcadores de CSCs e também induziu senescência celular na presença de SFB. Tmz e Rsv apresentaram resultados semelhantes à Doxo 10 nM. / Glioblastomas are the most aggressive tumors of the central nervous system (CNS). They are characterized by their high invasiveness, proliferation, high rates of recurrence and death, as well as chemo and radioresistance. Solid tumors have a hierarchical organization, in which there is a small tumor stem cell population (CSCs) or tumor initiator cells (CICs). These cells are able to repopulate the tumor, which leads to recurrence. CSCs are characterized by also performing asymmetric mitosis, in which the cells remain as CSCs and the other part undergoes differentiation. These differentiated cells are unable to repopulate the tumor, since they have lost their stem cell capacity. CSCs showed to be relatively resistant to traditional anti-cancer therapies such as chemo and / or radiotherapy. Doxorubicin (Doxo) is an anticancer agent used in several tumor types and acts by forming DNA adducts as well as inhibiting the action of topoisomerase II. Depending on the concentration of Doxo used, different effects was observed, for example, low doses (100 nM) lead to cellular senescence, whereas high doses (10 μM) lead to apoptosis. Temozolomide (Tmz) is an anti-tumor therapy used in many tumors, including gliomas. Resveratrol (Rsv) is a polyphenol found in various plants, such as grapes, and has effects such as neuroprotective, antiinflammatory, anti-oxidant, cardiac protection, among others. Our objective was to evaluate the effects of these three drugs on CSCs derived from human glioblastoma. We performed the sphere formation assay, an indicator of the presence of CSCs, flow cytometry for Oct4 and Nanog and senescence assay. Our experiments used the cell line U87 and two different types of culture medium. The first contained DMEM Low Glucose with FBS and the second, a culture medium for stem cells (SCM), containing DMEM F12 supplemented with FGF (fibroblastic growth factor), EGF (epidermal growth factor), LIF (leukemia inhibitor factor) and B27. The tests were performed using Doxo 1 and 10 nM, Tmz 5 μM and Rsv 10 and 30 μM. The number of spheres formed was reduced in both doses of Doxo when FBS was used. Doxo 1 nM did not alter the number of Oct4 and Nanog positive cells while Doxo 10 nM reduced. Both doses induced senescence. Tmz reduced the number of spheres formed and also the percentage of Nanog and Oct4 positive cells. Using SCM, we saw that Doxo and Tmz reduced the number of spheres and the percentage of Nanog and Oct4 positive cells. Rsv 10 μM reduced the number of spheres formed while Rsv 30 μM reduced the number of CD133 and Oct4 positive cells with medium supplemented with FBS. Our results suggest that Doxo 10 nM has a better effect in the CSCs than Doxo 1 nM. Doxo 10 nM besides reducing the number of spheres also decreased the percentage of CSCs markers, and induced cellular senescence in the presence of FBS. Tmz and Rsv had similar effects as Doxo 10 nM.

Glioblastomas são os tumores mais agressivos do Sistema Nervoso Central (SNC). Caracterizam-se por sua alta invasibilidade, proliferação, altos índices de recorrência e morte, assim como quimio e radiorresistência. Tumores sólidos apresentam uma organização hierárquica, em que há uma pequena população de células tronco tumorais (CSCs) ou células iniciadoras de tumor (CICs). Essas células são capazes de repopular o tumor, que leva à recorrência. CSCs caracterizam-se por realizar também a mitose assimétrica, na qual parte das células continuam como CSCs e a outra parte sofre diferenciação. Essas células diferenciadas são incapazes de repopular o tumor, uma vez que perderam a sua capacidade tronco. CSCs mostraram ser relativamente resistentes as terapias anticâncer tradicionais como quimio e/ou radioterapia. Doxorrubicina (Doxo) é um agente anticâncer usado em diversos tipos de tumor e atua formando adutos no DNA e também inibindo a ação da topoisomerase II. Dependendo da concentração utilizada de Doxo, diferentes efeitos são observados; por exemplo, baixas doses (100 nM) levam à senescência celular, enquanto que altas doses (10 μM) levam à apoptose. Temozolomida (Tmz) é um anti-tumoral utilizado na terapia de diversos tumores, inclusive gliomas. Resveratrol (Rsv) é um polifenol encontrado em diversas plantas, como a uva, e possui efeitos como: neuroproteção, antiinflamatório, anti-oxidante, proteção cardíaca, entre outros. Nosso objetivo foi avaliar a influência do efeito dessas três drogas nas CSCs derivadas de glioblastoma humano. Realizou-se o ensaio de formação de esferas, um indicador da presença de CSCs, citometria de fluxo para Oct4 e Nanog e ensaio de senescência. Nossos ensaios utilizaram a linhagem U87 e dois tipos diferentes de meio de cultura. O primeiro continha DMEM Low Glucose com SFB e o segundo, um meio de cultura para células tronco (SCM), contendo DMEM F12 suplementado com FGF (fator de crescimento fibroblástico), EGF (fator de crescimento epidermal), LIF (fator inibidor de leucemia) e B27. Os tratamentos realizados utilizaram Doxo 1 e 10 nM; Tmz 5 μM e Rsv 1, 10 e 30 μM. O número de esferas formadas foi reduzido tanto em Doxo 1 quanto em 10 nM quando SFB foi utilizado. Doxo 1 não alterou o número de células Oct4 e Nanog positivas enquanto que Doxo 10 nM reduziu. Ambas as doses induziram senescência. Tmz reduziu o número de esferas formadas e também a porcentagem de células Oct4 e Nanog positivas. Usando SCM, observamos que Doxo e Tmz reduziram o número de esferas e a porcentagem de células Nanog e Oct4 positivas. Rsv 10 μM reduziu o número de esferas formadas enquanto que Rsv 30 μM reduziu o número de células positivas para CD133 e Oct4 com meio com SFB. Nossos resultados sugerem que Doxo 10 nM possui um melhor efeito nas CSCs do que Doxo 1 nM. Doxo 10 nM, além de reduzir o número de esferas, reduziu a porcentagem dos marcadores de CSCs e também induziu senescência celular na presença de SFB. Tmz e Rsv apresentaram resultados semelhantes à Doxo 10 nM. / Glioblastomas are the most aggressive tumors of the central nervous system (CNS). They are characterized by their high invasiveness, proliferation, high rates of recurrence and death, as well as chemo and radioresistance. Solid tumors have a hierarchical organization, in which there is a small tumor stem cell population (CSCs) or tumor initiator cells (CICs). These cells are able to repopulate the tumor, which leads to recurrence. CSCs are characterized by also performing asymmetric mitosis, in which the cells remain as CSCs and the other part undergoes differentiation. These differentiated cells are unable to repopulate the tumor, since they have lost their stem cell capacity. CSCs showed to be relatively resistant to traditional anti-cancer therapies such as chemo and / or radiotherapy. Doxorubicin (Doxo) is an anticancer agent used in several tumor types and acts by forming DNA adducts as well as inhibiting the action of topoisomerase II. Depending on the concentration of Doxo used, different effects was observed, for example, low doses (100 nM) lead to cellular senescence, whereas high doses (10 μM) lead to apoptosis. Temozolomide (Tmz) is an anti-tumor therapy used in many tumors, including gliomas. Resveratrol (Rsv) is a polyphenol found in various plants, such as grapes, and has effects such as neuroprotective, antiinflammatory, anti-oxidant, cardiac protection, among others. Our objective was to evaluate the effects of these three drugs on CSCs derived from human glioblastoma. We performed the sphere formation assay, an indicator of the presence of CSCs, flow cytometry for Oct4 and Nanog and senescence assay. Our experiments used the cell line U87 and two different types of culture medium. The first contained DMEM Low Glucose with FBS and the second, a culture medium for stem cells (SCM), containing DMEM F12 supplemented with FGF (fibroblastic growth factor), EGF (epidermal growth factor), LIF (leukemia inhibitor factor) and B27. The tests were performed using Doxo 1 and 10 nM, Tmz 5 μM and Rsv 10 and 30 μM. The number of spheres formed was reduced in both doses of Doxo when FBS was used. Doxo 1 nM did not alter the number of Oct4 and Nanog positive cells while Doxo 10 nM reduced. Both doses induced senescence. Tmz reduced the number of spheres formed and also the percentage of Nanog and Oct4 positive cells. Using SCM, we saw that Doxo and Tmz reduced the number of spheres and the percentage of Nanog and Oct4 positive cells. Rsv 10 μM reduced the number of spheres formed while Rsv 30 μM reduced the number of CD133 and Oct4 positive cells with medium supplemented with FBS. Our results suggest that Doxo 10 nM has a better effect in the CSCs than Doxo 1 nM. Doxo 10 nM besides reducing the number of spheres also decreased the percentage of CSCs markers, and induced cellular senescence in the presence of FBS. Tmz and Rsv had similar effects as Doxo 10 nM.

Os gliomas representam a maioria dos tumores do sistema nervoso central, sendo o glioblastoma o mais maligno entre eles. O tratamento destes tumores ainda é ineficiente e a sobrevida média dos pacientes é de aproximadamente um ano após o diagnóstico. A remoção cirúrgica, quando possível, acompanhada de radioterapia e quimioterapia é o tratamento padrão. A tendência é que a quimioterapia assuma um papel mais importante, uma vez que possibilita a ativação de mecanismos endógenos antitumorais, como senescência celular. Este mecanismo possui potencial de induzir a perda irreversível da capacidade da divisão de células tumorais. O resveratrol e a quercetina, dois polifenóis naturais, induzem senescência em diferentes linhagens tumorais, incluindo os glioblastomas. Ambos têm efeitos pleiotrópicos e induzem a ativação de vários alvos moleculares, sendo SIRT1, um desses alvos. SIRT1 é uma histona desacetilase (HDAC) associada ao desenvolvimento de vários tipos de tumores. Por este motivo, foi avaliada a indução de senescência em células de glioblastomas pelo resveratrol e quercetina combinados com butirato de sódio, um inibidor de HDAC classe I e II. Os resultados mostram um efeito combinado do butirato de sódio e estes polifenóis para induzir a senescência nas linhagens celulares U87 e C6, mas não em astrócitos normais de ratos. Os co-tratamentos induzem perda de capacidade proliferativa e aumento do número de células positivas para β-galactosidase, um marcador de senescência. Estes resultados foram acompanhados de parada no ciclo celular na fase G2 na linhagem U87, mas nenhum efeito foi observado sobre o ciclo de células C6. A análise por Western Blot sugere o aumento do supressor tumoral p21 após co-tratamentos. Além disso, o co-tratamento com quercetina e butirato de sódio aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio, mas não os níveis de gama-H2AX (um marcador de dano). Estes dados sugerem que o butirato de sódio em combinação com os polifenóis tem potencial terapêutico para a supressão de glioblastomas. Por outro lado, um dos problemas em biologia e medicina é entender como células pré-cancerosas e cancerosas entram em senescência ou conseguem evitá-la. A chave para a compreensão da indução da senescência e do seu bypass é a ativação da enzima telomerase (TERT), presente em 85 % dos tumores. Na segunda parte desta tese, ferramentas de biologia de sistemas foram utilizadas para projetar uma rede câncer e senescência humana com o objetivo de estudar a relação entre senescência e câncer (incluindo glioblastoma). Os resultados mostram uma interação direta entre TERT e oncogenes como MYC, E2F1, AKT1 e ABL1, que podem induzir a senescência. Além disso, uma associação metabólica forte entre estes oncogenes e sua capacidade de induzir senescência foi mostrada através de análise por ontologia gênica. Estes oncogenes também atuam como reguladores da transcrição e/ou pós-transcrição da subunidade catalítica de TERT. Resultados obtidos a partir da análise de centralidade da rede juntamente com dados de microarranjos derivados de tumores foram utilizados para conceber um modelo dinâmico da regulação de TERT em câncer. Com base nestes resultados, foi gerado um modelo hipotético no qual a expressão de TERT pode ser transitória ou induzida por espécies reativas de oxigênio, aumentando a sobrevivência de diferentes tipos de tumores, como o glioblastoma. Este estudo fornece novas evidências para a relação entre senescência e câncer. Além disso, esta hipótese, se verificada experimentalmente, pode permitir a formulação de novas abordagens quimioterapêuticas para o tratamento de gliobastomas. / Gliomas are the majority of central nervous system tumours, being glioblastoma the most malign among them. The treatment for these tumors is still inefficient and survival average of patients is approximately one year after diagnosis. Surgical removal, if possible, followed by radiotherapy and chemotherapy is the standard treatment. The trend is that chemotherapy assumes a greater role, since it allows the activation of antitumour mechanisms, such as cellular senescence. This mechanism has potential to induce irreversible loss of division ability in tumor cells. Resveratrol and quercetin, two natural polyphenols, are able to induce senescence in different cancer models, including glioblastoma. Resveratrol and quercetine are molecules with pleiotropic effects and leads to SIRT1 activation. SIRT1 is a histone deacetylase (HDAC) which has been linked positively to cancer development. Therefore, we analyzed the ability of sodium butyrate, a HDAC class I and II inhibitor combined with resveratrol or quercetin to induce senescence in glioblastoma cell lines. Results show a combined effect of sodium butyrate and these polyphenols to induce senescence in U87 and C6 cell lines, but not in normal rat astrocytes. Co-treatments induce a loss of proliferative capacity and increase the number of positive cells for β-galactosidase, a senescence marker. These results were accompanied with cell cycle arrest in G2 checkpoint in U87, but no effect on cell cycle phase‟s distribution in C6 was observed. Western blott analysis suggests that these arrests are result of tumour suppressor p21 increase. Moreover, co-treatments increased reactive oxygen species, but not gamma-H2AX levels (a damage marker). The data underline that tumor cells can be driven towards cellular senescence by sodium butyrate combined with polyphenols, which may further arise as a possibility for tumor suppression. On the other hand, one of the challenging problems in biology and medicine is to understand how pre-cancerous or cancer cells enter in senescence or can avoid it. The key to understanding senescence induction and its bypass is the telomerase (TERT), which is present in 85 % of tumors. In a second part of this thesis, system biology tools were used to design a human cancer-senescence network with the aim to study the relationship between senescence and cancer (included glioblastoma). The results show a direct interaction between TERT and oncogenes such as MYC, E2F1, AKT1 and ABL1, which can induce senescence. Moreover, a strong metabolic association between these oncogenes and their ability to induce senescence was shown by gene ontology analysis. These oncogenes also act as transcriptional and/or post-transcriptional regulators of TERT catalytic subunit. Results obtained from centrality analysis and microarray data derived from tumors were used to design a dynamic model for TERT regulation in cancer. Based on these results, a hypothetical model was generated in which TERT expression may be transient or induced by reactive oxygen species, increasing the survival of different tumor types, such as glioblastoma. This study provides new evidence for the relationship between senescence and cancer. Furthermore, this hypothesis, if experimental verified, can enable the development of new chemotherapy approaches to glioblastoma treatment. and ABL1, which can induce senescence. Moreover, a strong metabolic association between these oncogenes and their ability to induce senescence was shown by gene ontology analysis. These oncogenes also act as transcriptional and/or post-transcriptional regulators of TERT catalytic subunit. Based on these results, a hypothetical model was generated in which TERT expression may be transient or induced by reactive oxygen species, increasing the survival of different tumor types, such as glioblastoma. This study provides new evidence for the relationship between senescence and cancer. Furthermore, this hypothesis, if experimental verified, can enable the development of new chemotherapy approaches.

Autofagia é um processo de degradação fisiológico aumentado em diferentes condições de estresse, em que proteínas e organelas não funcionais são direcionadas ao lisossomo, onde são degradadas e os produtos da degradação reutilizados pela célula. Senescência é o processo em que as células param de dividir e entram em um estado de parada celular irreversível. Os dois processos, autofagia e senescência, podem ser induzidos na presença de dano no DNA, porém a maquinaria molecular que realiza a intermediação neste processo ainda é incerta. Temozolomida (TMZ) é um agente alquilante, usado para tratar pacientes com Glioblastoma, que induz dano no DNA. Lesões produzidas por TMZ ativam a resposta ao dano no DNA (DDR), uma sinalização complexa que medeia as respostas celulares, tais como a dinâmica do ciclo celular, autofagia, senescência e morte celular, ao dano genotóxico. Dada a importância desses mecanismos, esse trabalho objetiva avaliar o impacto da inibição da cinase Ataxia Telangiectasia mutada dependente de Rad3 (ATR), reguladora chave da DDR, na proliferação, autofagia e senescência em células de glioblastoma tratadas com TMZ. Para tal, nós utilizamos um inibidor farmacológico para ATR (VE-821), bem como shRNA para ATR com vetor lentiviral em células U87. A inibição farmacológica da proteína ATR não alterou o estado autofágico e de senescência em comparação com as células tratadas somente com TMZ. Esses resultados foram obtidos usando o método Laranja de Acridina (AO) e a ferramenta de Análise Morfométrica Nuclear (NMA). Na ausência de uma sinalização dependente de ATR, obtida pelas células shATR tratadas com TMZ, também não observamos alteração significativa em relação a esses processos. No entanto, nós observamos um acúmulo da proteína SQSTM1/p62, substrato da autofagia, nas células silenciadas para ATR. Esta alteração não se refletiu em aumento de foci intracelulares da proteína SQSTM1/p62. Em conclusão, ATR não parece participar diretamente da ativação da Autofagia e da Senescência induzidas por TMZ. / Autophagy is a catabolic process, that shows increased levels in stressful situations, whereby dysfunctional proteins and organelles are engulfed and targeted to lysosomes for degradation and recycled back to the cell. Senescence is the process by which cells stop dividing and enter a state of growth arrest. Both processes, autophagy and senescence, can be induced by DNA damage, however, the molecular machinery that mediates this process is still uncertain. Temozolomide (TMZ) is an alkylating agent, used to treat patients with Glioblastoma, that drives DNA damage. Lesions produced by TMZ activate the DNA damage response (DDR), a complex signalling pathway, that mediates cellular outcomes such as cell cycle distribution, autophagy, senescence and cellular death, to genotoxic damage. Given the importance of such mechanisms, this work aims to evaluate the impact of inhibiting the Ataxia telangiectasia and Rad3 related (ATR) kinase, key regulator of the DDR, on cellular proliferation, autophagy and senescence, on Glioblastoma (GBM) cells treated with TMZ. In order to do that, we used a pharmacological inhibitor for ATR (VE-821) as well as shRNA to ATR, in U87 cells using lentiviral vectors. The pharmacological inhibition of ATR did not alter the autophagic or senescence status in comparison with the cells treated with TMZ only. Such results were obtained by Acridine Orange (AO) assessment and Nuclear Morphometric Analysis (NMA) tool. In the absence of an ATR dependent signalling, assessed through shATR cells treated with TMZ, no significant alteration in relation to such processes was seen. However, we observed an accumulation of the SQSTM1/p62 protein, a selective autophagy substrate, on cells silenced for ATR. This accumulation did not reflect in increased intracellular foci formation of SQSTM1/p62 protein. In conclusion, ATR doesn't seem to play a direct role in the Autophagy and Senescence induced by TMZ.

Autofagia é um processo de degradação fisiológico aumentado em diferentes condições de estresse, em que proteínas e organelas não funcionais são direcionadas ao lisossomo, onde são degradadas e os produtos da degradação reutilizados pela célula. Senescência é o processo em que as células param de dividir e entram em um estado de parada celular irreversível. Os dois processos, autofagia e senescência, podem ser induzidos na presença de dano no DNA, porém a maquinaria molecular que realiza a intermediação neste processo ainda é incerta. Temozolomida (TMZ) é um agente alquilante, usado para tratar pacientes com Glioblastoma, que induz dano no DNA. Lesões produzidas por TMZ ativam a resposta ao dano no DNA (DDR), uma sinalização complexa que medeia as respostas celulares, tais como a dinâmica do ciclo celular, autofagia, senescência e morte celular, ao dano genotóxico. Dada a importância desses mecanismos, esse trabalho objetiva avaliar o impacto da inibição da cinase Ataxia Telangiectasia mutada dependente de Rad3 (ATR), reguladora chave da DDR, na proliferação, autofagia e senescência em células de glioblastoma tratadas com TMZ. Para tal, nós utilizamos um inibidor farmacológico para ATR (VE-821), bem como shRNA para ATR com vetor lentiviral em células U87. A inibição farmacológica da proteína ATR não alterou o estado autofágico e de senescência em comparação com as células tratadas somente com TMZ. Esses resultados foram obtidos usando o método Laranja de Acridina (AO) e a ferramenta de Análise Morfométrica Nuclear (NMA). Na ausência de uma sinalização dependente de ATR, obtida pelas células shATR tratadas com TMZ, também não observamos alteração significativa em relação a esses processos. No entanto, nós observamos um acúmulo da proteína SQSTM1/p62, substrato da autofagia, nas células silenciadas para ATR. Esta alteração não se refletiu em aumento de foci intracelulares da proteína SQSTM1/p62. Em conclusão, ATR não parece participar diretamente da ativação da Autofagia e da Senescência induzidas por TMZ. / Autophagy is a catabolic process, that shows increased levels in stressful situations, whereby dysfunctional proteins and organelles are engulfed and targeted to lysosomes for degradation and recycled back to the cell. Senescence is the process by which cells stop dividing and enter a state of growth arrest. Both processes, autophagy and senescence, can be induced by DNA damage, however, the molecular machinery that mediates this process is still uncertain. Temozolomide (TMZ) is an alkylating agent, used to treat patients with Glioblastoma, that drives DNA damage. Lesions produced by TMZ activate the DNA damage response (DDR), a complex signalling pathway, that mediates cellular outcomes such as cell cycle distribution, autophagy, senescence and cellular death, to genotoxic damage. Given the importance of such mechanisms, this work aims to evaluate the impact of inhibiting the Ataxia telangiectasia and Rad3 related (ATR) kinase, key regulator of the DDR, on cellular proliferation, autophagy and senescence, on Glioblastoma (GBM) cells treated with TMZ. In order to do that, we used a pharmacological inhibitor for ATR (VE-821) as well as shRNA to ATR, in U87 cells using lentiviral vectors. The pharmacological inhibition of ATR did not alter the autophagic or senescence status in comparison with the cells treated with TMZ only. Such results were obtained by Acridine Orange (AO) assessment and Nuclear Morphometric Analysis (NMA) tool. In the absence of an ATR dependent signalling, assessed through shATR cells treated with TMZ, no significant alteration in relation to such processes was seen. However, we observed an accumulation of the SQSTM1/p62 protein, a selective autophagy substrate, on cells silenced for ATR. This accumulation did not reflect in increased intracellular foci formation of SQSTM1/p62 protein. In conclusion, ATR doesn't seem to play a direct role in the Autophagy and Senescence induced by TMZ.

Glioblastomas são os tumores mais agressivos do Sistema Nervoso Central (SNC). Caracterizam-se por sua alta invasibilidade, proliferação, altos índices de recorrência e morte, assim como quimio e radiorresistência. Tumores sólidos apresentam uma organização hierárquica, em que há uma pequena população de células tronco tumorais (CSCs) ou células iniciadoras de tumor (CICs). Essas células são capazes de repopular o tumor, que leva à recorrência. CSCs caracterizam-se por realizar também a mitose assimétrica, na qual parte das células continuam como CSCs e a outra parte sofre diferenciação. Essas células diferenciadas são incapazes de repopular o tumor, uma vez que perderam a sua capacidade tronco. CSCs mostraram ser relativamente resistentes as terapias anticâncer tradicionais como quimio e/ou radioterapia. Doxorrubicina (Doxo) é um agente anticâncer usado em diversos tipos de tumor e atua formando adutos no DNA e também inibindo a ação da topoisomerase II. Dependendo da concentração utilizada de Doxo, diferentes efeitos são observados; por exemplo, baixas doses (100 nM) levam à senescência celular, enquanto que altas doses (10 μM) levam à apoptose. Temozolomida (Tmz) é um anti-tumoral utilizado na terapia de diversos tumores, inclusive gliomas. Resveratrol (Rsv) é um polifenol encontrado em diversas plantas, como a uva, e possui efeitos como: neuroproteção, antiinflamatório, anti-oxidante, proteção cardíaca, entre outros. Nosso objetivo foi avaliar a influência do efeito dessas três drogas nas CSCs derivadas de glioblastoma humano. Realizou-se o ensaio de formação de esferas, um indicador da presença de CSCs, citometria de fluxo para Oct4 e Nanog e ensaio de senescência. Nossos ensaios utilizaram a linhagem U87 e dois tipos diferentes de meio de cultura. O primeiro continha DMEM Low Glucose com SFB e o segundo, um meio de cultura para células tronco (SCM), contendo DMEM F12 suplementado com FGF (fator de crescimento fibroblástico), EGF (fator de crescimento epidermal), LIF (fator inibidor de leucemia) e B27. Os tratamentos realizados utilizaram Doxo 1 e 10 nM; Tmz 5 μM e Rsv 1, 10 e 30 μM. O número de esferas formadas foi reduzido tanto em Doxo 1 quanto em 10 nM quando SFB foi utilizado. Doxo 1 não alterou o número de células Oct4 e Nanog positivas enquanto que Doxo 10 nM reduziu. Ambas as doses induziram senescência. Tmz reduziu o número de esferas formadas e também a porcentagem de células Oct4 e Nanog positivas. Usando SCM, observamos que Doxo e Tmz reduziram o número de esferas e a porcentagem de células Nanog e Oct4 positivas. Rsv 10 μM reduziu o número de esferas formadas enquanto que Rsv 30 μM reduziu o número de células positivas para CD133 e Oct4 com meio com SFB. Nossos resultados sugerem que Doxo 10 nM possui um melhor efeito nas CSCs do que Doxo 1 nM. Doxo 10 nM, além de reduzir o número de esferas, reduziu a porcentagem dos marcadores de CSCs e também induziu senescência celular na presença de SFB. Tmz e Rsv apresentaram resultados semelhantes à Doxo 10 nM. / Glioblastomas are the most aggressive tumors of the central nervous system (CNS). They are characterized by their high invasiveness, proliferation, high rates of recurrence and death, as well as chemo and radioresistance. Solid tumors have a hierarchical organization, in which there is a small tumor stem cell population (CSCs) or tumor initiator cells (CICs). These cells are able to repopulate the tumor, which leads to recurrence. CSCs are characterized by also performing asymmetric mitosis, in which the cells remain as CSCs and the other part undergoes differentiation. These differentiated cells are unable to repopulate the tumor, since they have lost their stem cell capacity. CSCs showed to be relatively resistant to traditional anti-cancer therapies such as chemo and / or radiotherapy. Doxorubicin (Doxo) is an anticancer agent used in several tumor types and acts by forming DNA adducts as well as inhibiting the action of topoisomerase II. Depending on the concentration of Doxo used, different effects was observed, for example, low doses (100 nM) lead to cellular senescence, whereas high doses (10 μM) lead to apoptosis. Temozolomide (Tmz) is an anti-tumor therapy used in many tumors, including gliomas. Resveratrol (Rsv) is a polyphenol found in various plants, such as grapes, and has effects such as neuroprotective, antiinflammatory, anti-oxidant, cardiac protection, among others. Our objective was to evaluate the effects of these three drugs on CSCs derived from human glioblastoma. We performed the sphere formation assay, an indicator of the presence of CSCs, flow cytometry for Oct4 and Nanog and senescence assay. Our experiments used the cell line U87 and two different types of culture medium. The first contained DMEM Low Glucose with FBS and the second, a culture medium for stem cells (SCM), containing DMEM F12 supplemented with FGF (fibroblastic growth factor), EGF (epidermal growth factor), LIF (leukemia inhibitor factor) and B27. The tests were performed using Doxo 1 and 10 nM, Tmz 5 μM and Rsv 10 and 30 μM. The number of spheres formed was reduced in both doses of Doxo when FBS was used. Doxo 1 nM did not alter the number of Oct4 and Nanog positive cells while Doxo 10 nM reduced. Both doses induced senescence. Tmz reduced the number of spheres formed and also the percentage of Nanog and Oct4 positive cells. Using SCM, we saw that Doxo and Tmz reduced the number of spheres and the percentage of Nanog and Oct4 positive cells. Rsv 10 μM reduced the number of spheres formed while Rsv 30 μM reduced the number of CD133 and Oct4 positive cells with medium supplemented with FBS. Our results suggest that Doxo 10 nM has a better effect in the CSCs than Doxo 1 nM. Doxo 10 nM besides reducing the number of spheres also decreased the percentage of CSCs markers, and induced cellular senescence in the presence of FBS. Tmz and Rsv had similar effects as Doxo 10 nM.