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Novas abordagens terapêuticas para glioblastoma baseadas no ensaio de resposta a terapias em culturas derivadas de pacientes

Kipper, Franciele Cristina January 2017 (has links)
Gliomas são tumores do sistema nervoso central caracterizados por alta invasibilidade e mortalidade. Inúmeros esforços foram feitos nas últimas décadas para melhorar a sobrevida dos pacientes, porém o último marco no tratamento se deu pela implementação da temozolomida (TMZ) combinada a ressecção cirúrgica e a radioterapia (RTX) em 2005. O projeto do atlas do genoma humano do câncer (TCGA) sequenciou tumores de mais de 500 pacientes com diagnóstico de glioblastoma (GBM) e categorizou os tumores em quatro subtipos moleculares, baseados na expressão, mutações e deleções de genes. Essas alterações genéticas já foram correlacionadas à melhora na sobrevida e à sensibilidade a terapia, porém, até o momento estudos prospectivos falham em direcionar o tratamento dos pacientes baseados nas características moleculares. Em busca de melhorar o entendimento sobre a correlação entre a sensibilidade a terapia in vitro e características genotípicas e fenotípicas, nós realizamos culturas primárias de células derivadas de tumores do sistema nervoso central de 23 pacientes (24 biopsias diferentes). As células foram crescidas em DMEM/F12 suplementado com soro fetal bovino e expostas aos tratamentos em doses e tempos semelhantes aos encontrados na clínica. Foram realizadas análises de viabilidade celular sete dias após o início do tratamento para 11 culturas primárias, ou as culturas foram tratadas por cinco dias em combinação, ou não, com RTX (sem RTX: 16 culturas; com RTX: 9 culturas) seguidos de sete dias em meio livre de droga, ao fim dos quais as células remanescentes foram contadas. A radioterapia e fármacos que agem sobre o citoesqueleto (vincristina, vimblastina, paclitaxel e mebendazole) sozinhos foram os tratamentos mais eficientes em reduzir a população celular. Uma segunda rodada de tratamento com TMZ, paclitaxel e a combinação de procarbazina, CCNU e vincristina (PCV) sugere que a resistência não é estável, e sucessivas exposições ao mesmo, ou a um fármaco diferente, podem ter seus efeitos somados na diminuição do crescimento populacional ou na massa tumoral final. Ao administrar PCV e paclitaxel nas células em cultura observamos um aumento nos níveis de autofagia que correlaciona com o declínio da população. Combinações desses fármacos com concentrações plasmáticas de um bloqueador da autofagia (cloroquina) não são capazes alterar o crescimento populacional. Resultados de análises do banco disponibilizado pelo TCGA mostram que alguns pacientes não apresentam aumento na sobrevida após tratamento com TMZ, e que essa falha no tratamento correlaciona com a baixa expressão de alguns genes nos seus tumores, por exemplo, aqueles com baixa expressão de FGFR3 e AKT2. As culturas primárias e linhagens celulares com menor expressão desses genes foram sensíveis in vitro a combinação de TMZ com dois fármacos que agem sobre o citoesqueleto: vimblastina e mebendazole (TVM). Essa associação retarda o crescimento de linhagens e culturas primárias resistentes a TMZ, além de induzir parada no ciclo celular, senescência e aumento da expressão de Notch3. Devido a falha na terapia padrão, ao baixo custo e aos resultados promissores essa associação de TVM poderia ser testada em pacientes cujos tumores apresentam baixos níveis de AKT2 e FGFR3. / Gliomas are tumors of the central nervous system with high invasiveness and mortality. Efforts have been done in last decades to improve patients overall survival, but the last treatment gain was given by the introduction of temozolomide (TMZ) combined with surgical resection and radiotherapy (RTX), in 2005. The cancer genome atlas (TCGA) consortion sequenced tumors from 500 patients with glioblastoma diagnosis and clustered tumors into four molecular subtypes, based on gene expression, mutations and deletions. Theses genetic alterations are associated with improved overal survival and sensitivity to therapy, but up to date, prospective studies have failed to address patients’ treatment based on molecular characteristics. In order to better understand the correlation among sensitivity in vitro and genotypic and phenotypic characteristics, we performed patient-derived cell cultures of central nervous system tumors from 23 patients (24 biopsies). Cells were grown in DMEM/F12 supplemented with fetal bovine serum and treated at doses and times similars to those administered in patients. Cell viability analyses were performed seven days after start of treatment for 11 cultures or cultures were treated for five days plus RTX (without RTX: in 16 cultures; with RTX: in 9 cultures) followed by seven day in drug-free medium, at the end, the remaining amount of cells were counted. RTX and drugs acting on cytoskeleton (vincristine, vinblastine, paclitaxel and mebendazole) alone were the most efficient treatments to reduce the population. A second round of treatment with TMZ, paclitaxel and the combination of procarbazine, CCNU and vincristine (PCV) suggests that the resistance is not stable, and repeated exposures to the same, or to another drug, could have additional effects in population or tumor mass reduction. PCV and paclitaxel treated cells showed an increase in autophagy levels correlated with reduction in population. Combining these drugs with plasmatic concentrations of an autophagy inhibitor (chloroquine) did not change population growth. Results from TCGA databank showed that some patients did not benefit in overal survival after TMZ treatment and this correlates with expression of some genes, for example, those harboring tumors with FGFR3 and AKT2 low expression. Patient-derived cultures and cell lines with low expression of these genes were sensitive in vitro to the combination of TMZ with two drugs that act on cytoskeleton: vinblastine and mebendazole (TVM). This association slowed the growth of patient-derived and cell lines tolerant to TMZ, besides inducing cell cycle arrest, senescence and increased Notch3 expression. In the case of failure of standard therapy, low cost and promising results, TVM association could be tested in patients harboring FGFR3Low/AKT2Low tumors.
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Avaliação dos efeitos antitumorais agudos e crônicos em resposta ao tratamento com temozolomida e sua combinação com vimblastia e mebendazole em células de glioblastoma

Silva, Andrew Oliveira January 2016 (has links)
Apesar dos progressos na compreensão da biologia dos Glioblastomas (GBM), poucos avanços terapêuticos foram obtidos, desde que a Temozolomida (TMZ) foi implementada, em 2005, como quimioterápico padrão no tratamento de GBMs. Uma das justificativas para o insucesso de novas terapias, pode estar relacionada com a condução equivocada dos experimentos in vitro, que utilizam doses exorbitantes dos fármacos e curtos períodos de tempo para avaliar sua eficácia terapêutica, não refletindo a realidade clínica da doença. Desta forma, o objetivo deste trabalho é caracterizar in vitro os efeitos da TMZ, mimetizando parâmetros clínicos, como dose plasmática e regime de tratamento em pacientes, e investigar possíveis fármacos de ação adjuvante à TMZ. Primeiramente, uma nova metodologia de análise de ensaios de proliferação celular a longo prazo foi proposta, a fim de quantificar os efeitos antitumorais crônicos de diferentes intervenções in vitro e in vivo. Em seguida, foram confirmados os principais mecanismos agudos desencadeados por TMZ e constatou-se a conservação do seu efeito antitumoral até uma semana após o fim do período de exposição ao fármaco. Apesar disso, em todas células de GBM testadas, houve a manutenção de subpopulações sobreviventes que readquiriram sua capacidade proliferativa, dentro do período de 28 dias. Aplicando a nova metodologia proposta, constatou-se que nenhum mecanismo ou ensaio utilizado neste trabalho foi capaz de predizer o comportamento proliferativo das células sobreviventes, mostrando a importância da análise crônica in vitro para avaliar a eficácia terapêutica de um tratamento. Então, o potencial adjuvante de Vimblastina (VBL) e Mebendazole (MBZ) foi testado e ambos causaram redução inicial na população, seguida de um recrescimento das células sobreviventes. Quando combinadas com TMZ, viu-se um completo bloqueio na proliferação durante todo o período analisado, menos em U138 e C6, que apresentaram efeitos semelhantes à utilização isolada de VBL ou MBZ. Já a combinação de MBZ, TMZ e VBL (MTV) reduziu consideravelmente a proliferação de C6 e U138, em 28 dias de análise. Portanto, a análise da proliferação celular in vitro a longo prazo, através desta nova abordagem proposta, parece ser uma forma mais adequada de investigar a eficácia terapêutica novos regimes de tratamento, e as combinações entre TMZ, VBL e MBZ parecem representar uma estratégia terapêutica promissora de ser testada em ensaios in vivo, como nova sugestão de tratamento para este tipo tumoral. / Despite the progress in understanding the biology of glioblastoma (GBM), little therapeutic improvements has been achieved, since the Temozolomide (TMZ) was implemented in 2005 as a standard chemotherapeutic agent in the treatment of GBMs. One of the reasons for the failure of new therapies may be related to the mistaken conduct of in vitro experiments, using exorbitant doses of drugs and short periods of time to evaluate their therapeutic efficacy, not matching the clinical reality of the disease. Thus, the objective of this study is to characterize the in vitro effects of TMZ, mimicking clinical parameters, such as plasma concentration and the drug schedule regimen in patients, in addition to investigate a possible adjuvant drug to combine with TMZ. First, a new method to analyze long-term in vitro and in vivo outcomes was proposed in order to quantify the antitumor effects of different interventions. Then, the major acute mechanisms triggered by TMZ were confirmed and its antitumor effects were preserved until one week after the end of drug exposure period. Nevertheless, all tested GBM cells maintained a survival subpopulation after TMZ treatment that recovered it proliferative capacity within 28 days. Through the new proposed methodology, it was concluded that none tested mechanism or assay in this work was able to predict the proliferative behavior of the surviving cells, showing the importance of in vitro chronic analysis to evaluate the therapeutic effectiveness of a treatment. After, Vinblastine (VBL) and Mebendazole (MBZ) were tested as a potential adjuvant drug to be used in combination with TMZ and both presented a strong initial decrease in the proliferation, followed by a regrowth of the surviving subpopulation. However, when combined with TMZ, they caused a complete blockade in cell proliferation along the analyzed period (60 days), except in U138 and C6 cell lines, which exhibited similar decrease when VBL or MBZ were used alone. Next, MBZ, TMZ and VBL (MTV) were combined in a single treatment to be tested in C6 and U138 and the cell proliferation was significantly decreased in 28 days for both GBM cell lines. Therefore, analyzing the chronic effects using this new analytical approach seems to be a more suitable way to investigate the therapeutic effectiveness of a new treatment regimen and the combination of TMZ, VBL and MBZ appear to represent a promising therapeutic strategy to be in vivo tested, as new suggestion treatment for this tumor type.
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Avaliação dos efeitos antitumorais agudos e crônicos em resposta ao tratamento com temozolomida e sua combinação com vimblastia e mebendazole em células de glioblastoma

Silva, Andrew Oliveira January 2016 (has links)
Apesar dos progressos na compreensão da biologia dos Glioblastomas (GBM), poucos avanços terapêuticos foram obtidos, desde que a Temozolomida (TMZ) foi implementada, em 2005, como quimioterápico padrão no tratamento de GBMs. Uma das justificativas para o insucesso de novas terapias, pode estar relacionada com a condução equivocada dos experimentos in vitro, que utilizam doses exorbitantes dos fármacos e curtos períodos de tempo para avaliar sua eficácia terapêutica, não refletindo a realidade clínica da doença. Desta forma, o objetivo deste trabalho é caracterizar in vitro os efeitos da TMZ, mimetizando parâmetros clínicos, como dose plasmática e regime de tratamento em pacientes, e investigar possíveis fármacos de ação adjuvante à TMZ. Primeiramente, uma nova metodologia de análise de ensaios de proliferação celular a longo prazo foi proposta, a fim de quantificar os efeitos antitumorais crônicos de diferentes intervenções in vitro e in vivo. Em seguida, foram confirmados os principais mecanismos agudos desencadeados por TMZ e constatou-se a conservação do seu efeito antitumoral até uma semana após o fim do período de exposição ao fármaco. Apesar disso, em todas células de GBM testadas, houve a manutenção de subpopulações sobreviventes que readquiriram sua capacidade proliferativa, dentro do período de 28 dias. Aplicando a nova metodologia proposta, constatou-se que nenhum mecanismo ou ensaio utilizado neste trabalho foi capaz de predizer o comportamento proliferativo das células sobreviventes, mostrando a importância da análise crônica in vitro para avaliar a eficácia terapêutica de um tratamento. Então, o potencial adjuvante de Vimblastina (VBL) e Mebendazole (MBZ) foi testado e ambos causaram redução inicial na população, seguida de um recrescimento das células sobreviventes. Quando combinadas com TMZ, viu-se um completo bloqueio na proliferação durante todo o período analisado, menos em U138 e C6, que apresentaram efeitos semelhantes à utilização isolada de VBL ou MBZ. Já a combinação de MBZ, TMZ e VBL (MTV) reduziu consideravelmente a proliferação de C6 e U138, em 28 dias de análise. Portanto, a análise da proliferação celular in vitro a longo prazo, através desta nova abordagem proposta, parece ser uma forma mais adequada de investigar a eficácia terapêutica novos regimes de tratamento, e as combinações entre TMZ, VBL e MBZ parecem representar uma estratégia terapêutica promissora de ser testada em ensaios in vivo, como nova sugestão de tratamento para este tipo tumoral. / Despite the progress in understanding the biology of glioblastoma (GBM), little therapeutic improvements has been achieved, since the Temozolomide (TMZ) was implemented in 2005 as a standard chemotherapeutic agent in the treatment of GBMs. One of the reasons for the failure of new therapies may be related to the mistaken conduct of in vitro experiments, using exorbitant doses of drugs and short periods of time to evaluate their therapeutic efficacy, not matching the clinical reality of the disease. Thus, the objective of this study is to characterize the in vitro effects of TMZ, mimicking clinical parameters, such as plasma concentration and the drug schedule regimen in patients, in addition to investigate a possible adjuvant drug to combine with TMZ. First, a new method to analyze long-term in vitro and in vivo outcomes was proposed in order to quantify the antitumor effects of different interventions. Then, the major acute mechanisms triggered by TMZ were confirmed and its antitumor effects were preserved until one week after the end of drug exposure period. Nevertheless, all tested GBM cells maintained a survival subpopulation after TMZ treatment that recovered it proliferative capacity within 28 days. Through the new proposed methodology, it was concluded that none tested mechanism or assay in this work was able to predict the proliferative behavior of the surviving cells, showing the importance of in vitro chronic analysis to evaluate the therapeutic effectiveness of a treatment. After, Vinblastine (VBL) and Mebendazole (MBZ) were tested as a potential adjuvant drug to be used in combination with TMZ and both presented a strong initial decrease in the proliferation, followed by a regrowth of the surviving subpopulation. However, when combined with TMZ, they caused a complete blockade in cell proliferation along the analyzed period (60 days), except in U138 and C6 cell lines, which exhibited similar decrease when VBL or MBZ were used alone. Next, MBZ, TMZ and VBL (MTV) were combined in a single treatment to be tested in C6 and U138 and the cell proliferation was significantly decreased in 28 days for both GBM cell lines. Therefore, analyzing the chronic effects using this new analytical approach seems to be a more suitable way to investigate the therapeutic effectiveness of a new treatment regimen and the combination of TMZ, VBL and MBZ appear to represent a promising therapeutic strategy to be in vivo tested, as new suggestion treatment for this tumor type.
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Novas abordagens terapêuticas para glioblastoma baseadas no ensaio de resposta a terapias em culturas derivadas de pacientes

Kipper, Franciele Cristina January 2017 (has links)
Gliomas são tumores do sistema nervoso central caracterizados por alta invasibilidade e mortalidade. Inúmeros esforços foram feitos nas últimas décadas para melhorar a sobrevida dos pacientes, porém o último marco no tratamento se deu pela implementação da temozolomida (TMZ) combinada a ressecção cirúrgica e a radioterapia (RTX) em 2005. O projeto do atlas do genoma humano do câncer (TCGA) sequenciou tumores de mais de 500 pacientes com diagnóstico de glioblastoma (GBM) e categorizou os tumores em quatro subtipos moleculares, baseados na expressão, mutações e deleções de genes. Essas alterações genéticas já foram correlacionadas à melhora na sobrevida e à sensibilidade a terapia, porém, até o momento estudos prospectivos falham em direcionar o tratamento dos pacientes baseados nas características moleculares. Em busca de melhorar o entendimento sobre a correlação entre a sensibilidade a terapia in vitro e características genotípicas e fenotípicas, nós realizamos culturas primárias de células derivadas de tumores do sistema nervoso central de 23 pacientes (24 biopsias diferentes). As células foram crescidas em DMEM/F12 suplementado com soro fetal bovino e expostas aos tratamentos em doses e tempos semelhantes aos encontrados na clínica. Foram realizadas análises de viabilidade celular sete dias após o início do tratamento para 11 culturas primárias, ou as culturas foram tratadas por cinco dias em combinação, ou não, com RTX (sem RTX: 16 culturas; com RTX: 9 culturas) seguidos de sete dias em meio livre de droga, ao fim dos quais as células remanescentes foram contadas. A radioterapia e fármacos que agem sobre o citoesqueleto (vincristina, vimblastina, paclitaxel e mebendazole) sozinhos foram os tratamentos mais eficientes em reduzir a população celular. Uma segunda rodada de tratamento com TMZ, paclitaxel e a combinação de procarbazina, CCNU e vincristina (PCV) sugere que a resistência não é estável, e sucessivas exposições ao mesmo, ou a um fármaco diferente, podem ter seus efeitos somados na diminuição do crescimento populacional ou na massa tumoral final. Ao administrar PCV e paclitaxel nas células em cultura observamos um aumento nos níveis de autofagia que correlaciona com o declínio da população. Combinações desses fármacos com concentrações plasmáticas de um bloqueador da autofagia (cloroquina) não são capazes alterar o crescimento populacional. Resultados de análises do banco disponibilizado pelo TCGA mostram que alguns pacientes não apresentam aumento na sobrevida após tratamento com TMZ, e que essa falha no tratamento correlaciona com a baixa expressão de alguns genes nos seus tumores, por exemplo, aqueles com baixa expressão de FGFR3 e AKT2. As culturas primárias e linhagens celulares com menor expressão desses genes foram sensíveis in vitro a combinação de TMZ com dois fármacos que agem sobre o citoesqueleto: vimblastina e mebendazole (TVM). Essa associação retarda o crescimento de linhagens e culturas primárias resistentes a TMZ, além de induzir parada no ciclo celular, senescência e aumento da expressão de Notch3. Devido a falha na terapia padrão, ao baixo custo e aos resultados promissores essa associação de TVM poderia ser testada em pacientes cujos tumores apresentam baixos níveis de AKT2 e FGFR3. / Gliomas are tumors of the central nervous system with high invasiveness and mortality. Efforts have been done in last decades to improve patients overall survival, but the last treatment gain was given by the introduction of temozolomide (TMZ) combined with surgical resection and radiotherapy (RTX), in 2005. The cancer genome atlas (TCGA) consortion sequenced tumors from 500 patients with glioblastoma diagnosis and clustered tumors into four molecular subtypes, based on gene expression, mutations and deletions. Theses genetic alterations are associated with improved overal survival and sensitivity to therapy, but up to date, prospective studies have failed to address patients’ treatment based on molecular characteristics. In order to better understand the correlation among sensitivity in vitro and genotypic and phenotypic characteristics, we performed patient-derived cell cultures of central nervous system tumors from 23 patients (24 biopsies). Cells were grown in DMEM/F12 supplemented with fetal bovine serum and treated at doses and times similars to those administered in patients. Cell viability analyses were performed seven days after start of treatment for 11 cultures or cultures were treated for five days plus RTX (without RTX: in 16 cultures; with RTX: in 9 cultures) followed by seven day in drug-free medium, at the end, the remaining amount of cells were counted. RTX and drugs acting on cytoskeleton (vincristine, vinblastine, paclitaxel and mebendazole) alone were the most efficient treatments to reduce the population. A second round of treatment with TMZ, paclitaxel and the combination of procarbazine, CCNU and vincristine (PCV) suggests that the resistance is not stable, and repeated exposures to the same, or to another drug, could have additional effects in population or tumor mass reduction. PCV and paclitaxel treated cells showed an increase in autophagy levels correlated with reduction in population. Combining these drugs with plasmatic concentrations of an autophagy inhibitor (chloroquine) did not change population growth. Results from TCGA databank showed that some patients did not benefit in overal survival after TMZ treatment and this correlates with expression of some genes, for example, those harboring tumors with FGFR3 and AKT2 low expression. Patient-derived cultures and cell lines with low expression of these genes were sensitive in vitro to the combination of TMZ with two drugs that act on cytoskeleton: vinblastine and mebendazole (TVM). This association slowed the growth of patient-derived and cell lines tolerant to TMZ, besides inducing cell cycle arrest, senescence and increased Notch3 expression. In the case of failure of standard therapy, low cost and promising results, TVM association could be tested in patients harboring FGFR3Low/AKT2Low tumors.
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Avaliação dos efeitos antitumorais agudos e crônicos em resposta ao tratamento com temozolomida e sua combinação com vimblastia e mebendazole em células de glioblastoma

Silva, Andrew Oliveira January 2016 (has links)
Apesar dos progressos na compreensão da biologia dos Glioblastomas (GBM), poucos avanços terapêuticos foram obtidos, desde que a Temozolomida (TMZ) foi implementada, em 2005, como quimioterápico padrão no tratamento de GBMs. Uma das justificativas para o insucesso de novas terapias, pode estar relacionada com a condução equivocada dos experimentos in vitro, que utilizam doses exorbitantes dos fármacos e curtos períodos de tempo para avaliar sua eficácia terapêutica, não refletindo a realidade clínica da doença. Desta forma, o objetivo deste trabalho é caracterizar in vitro os efeitos da TMZ, mimetizando parâmetros clínicos, como dose plasmática e regime de tratamento em pacientes, e investigar possíveis fármacos de ação adjuvante à TMZ. Primeiramente, uma nova metodologia de análise de ensaios de proliferação celular a longo prazo foi proposta, a fim de quantificar os efeitos antitumorais crônicos de diferentes intervenções in vitro e in vivo. Em seguida, foram confirmados os principais mecanismos agudos desencadeados por TMZ e constatou-se a conservação do seu efeito antitumoral até uma semana após o fim do período de exposição ao fármaco. Apesar disso, em todas células de GBM testadas, houve a manutenção de subpopulações sobreviventes que readquiriram sua capacidade proliferativa, dentro do período de 28 dias. Aplicando a nova metodologia proposta, constatou-se que nenhum mecanismo ou ensaio utilizado neste trabalho foi capaz de predizer o comportamento proliferativo das células sobreviventes, mostrando a importância da análise crônica in vitro para avaliar a eficácia terapêutica de um tratamento. Então, o potencial adjuvante de Vimblastina (VBL) e Mebendazole (MBZ) foi testado e ambos causaram redução inicial na população, seguida de um recrescimento das células sobreviventes. Quando combinadas com TMZ, viu-se um completo bloqueio na proliferação durante todo o período analisado, menos em U138 e C6, que apresentaram efeitos semelhantes à utilização isolada de VBL ou MBZ. Já a combinação de MBZ, TMZ e VBL (MTV) reduziu consideravelmente a proliferação de C6 e U138, em 28 dias de análise. Portanto, a análise da proliferação celular in vitro a longo prazo, através desta nova abordagem proposta, parece ser uma forma mais adequada de investigar a eficácia terapêutica novos regimes de tratamento, e as combinações entre TMZ, VBL e MBZ parecem representar uma estratégia terapêutica promissora de ser testada em ensaios in vivo, como nova sugestão de tratamento para este tipo tumoral. / Despite the progress in understanding the biology of glioblastoma (GBM), little therapeutic improvements has been achieved, since the Temozolomide (TMZ) was implemented in 2005 as a standard chemotherapeutic agent in the treatment of GBMs. One of the reasons for the failure of new therapies may be related to the mistaken conduct of in vitro experiments, using exorbitant doses of drugs and short periods of time to evaluate their therapeutic efficacy, not matching the clinical reality of the disease. Thus, the objective of this study is to characterize the in vitro effects of TMZ, mimicking clinical parameters, such as plasma concentration and the drug schedule regimen in patients, in addition to investigate a possible adjuvant drug to combine with TMZ. First, a new method to analyze long-term in vitro and in vivo outcomes was proposed in order to quantify the antitumor effects of different interventions. Then, the major acute mechanisms triggered by TMZ were confirmed and its antitumor effects were preserved until one week after the end of drug exposure period. Nevertheless, all tested GBM cells maintained a survival subpopulation after TMZ treatment that recovered it proliferative capacity within 28 days. Through the new proposed methodology, it was concluded that none tested mechanism or assay in this work was able to predict the proliferative behavior of the surviving cells, showing the importance of in vitro chronic analysis to evaluate the therapeutic effectiveness of a treatment. After, Vinblastine (VBL) and Mebendazole (MBZ) were tested as a potential adjuvant drug to be used in combination with TMZ and both presented a strong initial decrease in the proliferation, followed by a regrowth of the surviving subpopulation. However, when combined with TMZ, they caused a complete blockade in cell proliferation along the analyzed period (60 days), except in U138 and C6 cell lines, which exhibited similar decrease when VBL or MBZ were used alone. Next, MBZ, TMZ and VBL (MTV) were combined in a single treatment to be tested in C6 and U138 and the cell proliferation was significantly decreased in 28 days for both GBM cell lines. Therefore, analyzing the chronic effects using this new analytical approach seems to be a more suitable way to investigate the therapeutic effectiveness of a new treatment regimen and the combination of TMZ, VBL and MBZ appear to represent a promising therapeutic strategy to be in vivo tested, as new suggestion treatment for this tumor type.
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Novas abordagens terapêuticas para glioblastoma baseadas no ensaio de resposta a terapias em culturas derivadas de pacientes

Kipper, Franciele Cristina January 2017 (has links)
Gliomas são tumores do sistema nervoso central caracterizados por alta invasibilidade e mortalidade. Inúmeros esforços foram feitos nas últimas décadas para melhorar a sobrevida dos pacientes, porém o último marco no tratamento se deu pela implementação da temozolomida (TMZ) combinada a ressecção cirúrgica e a radioterapia (RTX) em 2005. O projeto do atlas do genoma humano do câncer (TCGA) sequenciou tumores de mais de 500 pacientes com diagnóstico de glioblastoma (GBM) e categorizou os tumores em quatro subtipos moleculares, baseados na expressão, mutações e deleções de genes. Essas alterações genéticas já foram correlacionadas à melhora na sobrevida e à sensibilidade a terapia, porém, até o momento estudos prospectivos falham em direcionar o tratamento dos pacientes baseados nas características moleculares. Em busca de melhorar o entendimento sobre a correlação entre a sensibilidade a terapia in vitro e características genotípicas e fenotípicas, nós realizamos culturas primárias de células derivadas de tumores do sistema nervoso central de 23 pacientes (24 biopsias diferentes). As células foram crescidas em DMEM/F12 suplementado com soro fetal bovino e expostas aos tratamentos em doses e tempos semelhantes aos encontrados na clínica. Foram realizadas análises de viabilidade celular sete dias após o início do tratamento para 11 culturas primárias, ou as culturas foram tratadas por cinco dias em combinação, ou não, com RTX (sem RTX: 16 culturas; com RTX: 9 culturas) seguidos de sete dias em meio livre de droga, ao fim dos quais as células remanescentes foram contadas. A radioterapia e fármacos que agem sobre o citoesqueleto (vincristina, vimblastina, paclitaxel e mebendazole) sozinhos foram os tratamentos mais eficientes em reduzir a população celular. Uma segunda rodada de tratamento com TMZ, paclitaxel e a combinação de procarbazina, CCNU e vincristina (PCV) sugere que a resistência não é estável, e sucessivas exposições ao mesmo, ou a um fármaco diferente, podem ter seus efeitos somados na diminuição do crescimento populacional ou na massa tumoral final. Ao administrar PCV e paclitaxel nas células em cultura observamos um aumento nos níveis de autofagia que correlaciona com o declínio da população. Combinações desses fármacos com concentrações plasmáticas de um bloqueador da autofagia (cloroquina) não são capazes alterar o crescimento populacional. Resultados de análises do banco disponibilizado pelo TCGA mostram que alguns pacientes não apresentam aumento na sobrevida após tratamento com TMZ, e que essa falha no tratamento correlaciona com a baixa expressão de alguns genes nos seus tumores, por exemplo, aqueles com baixa expressão de FGFR3 e AKT2. As culturas primárias e linhagens celulares com menor expressão desses genes foram sensíveis in vitro a combinação de TMZ com dois fármacos que agem sobre o citoesqueleto: vimblastina e mebendazole (TVM). Essa associação retarda o crescimento de linhagens e culturas primárias resistentes a TMZ, além de induzir parada no ciclo celular, senescência e aumento da expressão de Notch3. Devido a falha na terapia padrão, ao baixo custo e aos resultados promissores essa associação de TVM poderia ser testada em pacientes cujos tumores apresentam baixos níveis de AKT2 e FGFR3. / Gliomas are tumors of the central nervous system with high invasiveness and mortality. Efforts have been done in last decades to improve patients overall survival, but the last treatment gain was given by the introduction of temozolomide (TMZ) combined with surgical resection and radiotherapy (RTX), in 2005. The cancer genome atlas (TCGA) consortion sequenced tumors from 500 patients with glioblastoma diagnosis and clustered tumors into four molecular subtypes, based on gene expression, mutations and deletions. Theses genetic alterations are associated with improved overal survival and sensitivity to therapy, but up to date, prospective studies have failed to address patients’ treatment based on molecular characteristics. In order to better understand the correlation among sensitivity in vitro and genotypic and phenotypic characteristics, we performed patient-derived cell cultures of central nervous system tumors from 23 patients (24 biopsies). Cells were grown in DMEM/F12 supplemented with fetal bovine serum and treated at doses and times similars to those administered in patients. Cell viability analyses were performed seven days after start of treatment for 11 cultures or cultures were treated for five days plus RTX (without RTX: in 16 cultures; with RTX: in 9 cultures) followed by seven day in drug-free medium, at the end, the remaining amount of cells were counted. RTX and drugs acting on cytoskeleton (vincristine, vinblastine, paclitaxel and mebendazole) alone were the most efficient treatments to reduce the population. A second round of treatment with TMZ, paclitaxel and the combination of procarbazine, CCNU and vincristine (PCV) suggests that the resistance is not stable, and repeated exposures to the same, or to another drug, could have additional effects in population or tumor mass reduction. PCV and paclitaxel treated cells showed an increase in autophagy levels correlated with reduction in population. Combining these drugs with plasmatic concentrations of an autophagy inhibitor (chloroquine) did not change population growth. Results from TCGA databank showed that some patients did not benefit in overal survival after TMZ treatment and this correlates with expression of some genes, for example, those harboring tumors with FGFR3 and AKT2 low expression. Patient-derived cultures and cell lines with low expression of these genes were sensitive in vitro to the combination of TMZ with two drugs that act on cytoskeleton: vinblastine and mebendazole (TVM). This association slowed the growth of patient-derived and cell lines tolerant to TMZ, besides inducing cell cycle arrest, senescence and increased Notch3 expression. In the case of failure of standard therapy, low cost and promising results, TVM association could be tested in patients harboring FGFR3Low/AKT2Low tumors.
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Estudo da Expressão dos Genes DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, MGMT e Efeitos da Zebularina em Glioblastoma / Estudo da Expressão dos Genes DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, MGMT e Efeitos da Zebularina em Glioblastoma

Moreno, Daniel Antunes 24 August 2012 (has links)
Os gliomas são tumores que surgem a partir de células da glia e são considerados os mais comuns do sistema nervoso central. São subdivididos em quatro grupos: astrocitoma pilocítico (grau I), astrocitoma difuso (grau II), astrocitoma anaplásico (grau III) e glioblastoma (grau IV ou GBM). Entre esses, o GBM é o tumor mais agressivo e mais freqüente. Apesar de ser encontrado em qualquer faixa etária, esse tumor é raro em crianças. Atualmente a cirurgia seguida de radioterapia e quimioterapia com temozolomida (TMZ) tem sido utilizado como protocolo de tratamento padrão para a maioria dos pacientes e mesmo assim a sobrevida se mantem extremamente baixa. Além disso, grande parte dos pacientes não respondem ao tratamento com TMZ indicando a necessidade de agentes quimioterápicos alternativos. A zebularina (ZB) é um agente inibidor de DNA metiltransferases (iDNMTs) estável, pouco tóxico, que promove radiosensibilização e tem mostrado efeitos promissores em diversos tipos de neoplasias, entretanto pouco se sabe a respeito dos efeitos da ZB em glioblastoma. Os objetivos deste trabalho foram analisar a expressão dos genes DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, MGMT em 5 amostras de substâncias brancas (SB), 6 linhagens de GBM e 33 amostras de gliomas (13 grau I, 2 grau II e 18 grau IV), correlacionar a expressão desses genes com os diferentes graus de gliomas e analisar os efeitos da ZB combinada ou não com TMZ em linhagens de GBM irradiadas e não irradiadas. Para análise da expressão gênica foi realizada a técnica de PCR em tempo Real. Os ensaios de proliferação celular, clonogênico, radiação e apoptose foram realizados em 3 linhagens de GBM (U251, SF188 e T98G) e uma de fibroblastos (MRC5). Também foi realizado o ensaio de proliferação celular em 5 culturas primárias de GBM tratadas com zebularina. Os genes DNMT3A e MGMT mostraram expressão maior nas amostras de SB comparando-se com gliomas e linhagens de GBM. O gene DNMT3B foi mais expresso nas linhagens de GBM comparando-se com as SB. O gene DNMT1 não mostrou diferenças significativas entre as amostras analisadas. Os ensaios de proliferação celular mostraram diminuição na proliferação com doses a partir de 50-100µM de ZB e de 250-500µM de TMZ nas linhagens e a partir de 50µM de ZB para as culturas primárias de GBM. As combinações de ZB com TMZ não mostraram sinergia na grande maioria das doses testadas. A ZB aumenta a apoptose nas 3 linhagens com doses a partir de 100µM. A ZB e TMZ mostraram diminuição na formação de colônias com as doses de 100µM e 10µM nas linhagens U251 e SF188 não irradiadas e irradiadas com 2, 4 e 6 Gy. A linhagem T98G expressa o gene MGMT, mostrou resistência a 10µM de TMZ e respondeu ao tratamento com 100µM de ZB. Também foi observado que 10µM de TMZ é mais citotóxico do que 100µM de ZB em fibroblastos não irradiados e irradiados (2Gy). Os resultados obtidos neste estudo mostram que a ZB pode representar um alvo terapêutico interessante para o estudo em glioblastoma. / Gliomas arise from glial cells and are the most common central nervous system tumors. They are divided in four groups: pilocytic astrocytoma (grade I), difuse astrocytoma (grade II), anaplastic astrocytoma (grade III) and glioblastoma (grade IV or GBM). GBM is the most frequent and aggressive glioma. This type of tumor can occur in any age but its rare in children. Actually, surgery, radiotherapy and temozolomide (TMZ) adjuvant/concomitant chemotherapy has been the standard treatment protocol but the survival is extremely poor. In addition most patients do not respond to TMZ indicating the need for alternative chemotherapeutic agents. Zebularine (ZB) is a DNA metiltransferase inhibitor (DNMTi) stable, slight toxic that has been showed promise effects in cancer including radiosensitivity but little is known about ZB in glioblastoma. The objectives of this study were analyze DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, MGMT gene expression profile in 5 samples of normal brain, 6 GBM cell lines and 33 glioma samples (13 grade I, 2 grade II e 18 grade IV), correlate with different gliomas grades and analyze the effects of ZB isolate and in combination with TMZ in irradiated and non irradiated GBM cell lines. Gene expression assays was made using Real Time PCR. Proliferation, clonogenic, radiation and apoptosis assays were realized in three GBM cell lines (U251, SF88, T98G) and one fibroblast cell line (MRC5). We also made proliferation assays in 5 primary cultures of samples of GMB. MGMT and DNMT3A genes showed higher expression in normal brain compared to gliomas and GBM cell lines. DNMT3B gene showed higher expression in GBM cell lines compared with normal brain and DNMT1 showed no significant differences among samples analyzed. We observed decrease of cell proliferation from 50-100µM of ZB and 250-500µM of TMZ on GBM cell lines and from 50µM of ZB for primary GBM samples. It was not observed synergy in the most combinations doses of ZB and TMZ (Calcusyn software). It was observed that 100µM of ZB and 10µM of TMZ decrease colony formation on U251 and SF188 cell lines non irradiated and irradiated with 2, 4, and 6Gy. T98G that express MGMT, did not respond to TMZ but showed response to ZB. It was also observed that 10µM of TMZ is more cytotoxic than 100µM of ZB in fibroblast cell line non irradiated and irradiated with 2Gy. ZB increase apoptosis from 100µM on the three GBM cell lines. Results obtained in this study can indicate that ZB may be an interestig therapeutic target for future studies in glioblastoma.
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Expressão dos genes EGFR, PTEN, MGMT e IDH1/2 e dos microRNAs miR-181b, miR-145, miR-149 e miR128a em neuroesferas em linhagens de glioblastoma submetidos ao tratamento com radiação ionizante e temozolomida / Expression of EGFR, PTEN, MGMT and IDH1 / 2 Genes and the MicroRNAs miR-181b, miR-145, miR-149 and miR-128a in Neurospheres In Glioblastoma Lineages Undergoing Treatment with Ionizing Radiation and Temozolomide

Almeida, Thiago Lins da Costa 17 June 2016 (has links)
Introdução: O glioblastoma multiforme é a neoplasia maligna primária mais prevalente do sistema nervoso central. Enquanto apresenta aumento em sua incidência, mantém a perspectiva de sobrevida global aproximada de 14 meses. Objetivos: O presente estudo objetiva avaliar a expressão dos genes EGFR, PTEN, MGMT e IDH1/2 e dos microRNAs miR-181b, miR-145, miR-149 e miR-128a em neuroesferas (NE) e células aderidas (CA), a partir das linhagens celulares (T98G e U343) submetidas ao tratamento com temozolomida (TMZ) e com radiação ionizante (RI) isolados e em associação (TMZ+RI). Material e métodos: As linhagens celulares T98G e U343 foram tratadas com TMZ, RI e TMZ+RI. A verificação da expressão dos genes e miRNAs foi realizada utilizando o método de PCR em tempo real. Resultados: Observamos: a) o aumento na expressão do IDH1 após RI (4-fold) e TMZ+RI (5-fold) nas NE (T98G); o aumento na expressão do IDH2 (20-fold) nas NE (T98G), após TMZ, e do IDH2 (3-fold) nas CA (U343) submetidas à TMZ+RI; b) a redução na expressão do EGFR após TMZ; o aumento dessa expressão nas NE (T98G), após RI (2-fold) e TMZ+RI (3-fold), e a sua diminuição nas CA (U343) submetidas à TMZ e TMZ+RI; c) a redução na expressão PTEN nas NE (T98G), após TMZ e RI, e sua expressão nas NE (3-fold) frente à TMZ+RI; d) aumento na expressão de MGMT nas NE (T98G) nos grupos RI (10-fold) e TMZ+RI (25-fold). Quanto a expressão de miRNAs, foram identificados os seguintes resultados: a) as CA (U343) expressaram: miR-181b após TMZ (60-fold), RI (20-fold) e TMZ+RI (40- fold); e miR-128a após TMZ (500-fold), RI (200-fold) e TMZ+RI (600-fold); b) as NE (T98G) após TMZ+RI expressaram: miR-181b (30-fold), miR-149 (40-fold), miR-145 (300-fold) e miR-128a (40-fold); c) as NE (U343) após RI hiperexpressaram miR-149 e miR-145 (ambos em 4000-fold). Conclusão: A RI apresentou-se como fator independente e determinante para a radiorresistência das NE, entretanto não observamos ação de complementariedade de regulação dos oncomiRs observados sobre a expressão dos genes estudados. Esta é a primeira análise na literatura que correlaciona a expressão de genes e de miRNAs através das intervenções TMZ, RI e TMZ+RI sobre células aderidas e neurosferas. / Introduction: Glioblastoma multiforme is the most prevalent primary malignant neoplasm of the central nervous system. It has increased its incidence, while the overall survival remains over 14 months. Objectives: This study aims to evaluate the expression of the following genes EGFR, PTEN, MGMT and IDH1/2 and microRNAs miR-181b, miR-145, miR-149 and miR-128a in adhered cells (AC) and neurospheres (NS) from cell lines (T98G and U343) which were submitted to temozolomide (TMZ) and ionizing radiation (IR), isolated and associated (TMZ + IR). Methods: The cell lines T98G and U343 were treated with TMZ, IR and TMZ+IR. The analysis of gene expression and miRNAs was performed using the PCR in real time. Results: This study demonstrated: a) an improvement in the expression of IDH1 after IR (4-fold) and TMZ + IR (5-fold) in the NS (T98G); increased expression of IDH2 (20-fold) in the NS (T98G) after TMZ and IDH2 (3-fold) in AC (U343) submitted to TMZ + IR; b) reduction in EGFR expression after TMZ; increase this expression in NS (T98G) after IR (2-fold) and TMZ + IR (3-fold), and a decrease in AC (U343) submitted to TMZ and TMZ + IR; c) reduction in PTEN expression in NS (T98G) after TMZ and IR, and its improvement in NS (3-fold) when compared to TMZ + IR; d) increase in the expression of MGMT in NS (T98G) in IR groups (10-fold) and TMZ + IR (25-fold). It was also identified the expression of miRNAs results as: a) AC (U343) expressed more miR-181b after TMZ (60-fold), IR (20-fold) and TMZ + IR (40-fold); and miR- 128a improved after TMZ (500-fold), IR (200-fold) and TMZ + IR (600-fold); b) NS (T98G) after TMZ + IR expressed: miR-181b (30-fold); miR-149 (40-fold); miR-145 (300-fold) and miR-128a (40-fold); c) NS (U343) after IR huge expressed miR-149 and miR-145 (both in 4000-fold). Conclusion: IR was an independent and determining radio resistance factor in NS. However, we observed no complementarity action of oncomiRs regulation. This is the first study in the literature correlating gene expression, and miRNAs through TMZ, IR and IR + TMZ interventions in AC and NS.
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Avaliação da resposta celular mediada pelo quimioterápico temozolomida associada ao inibidor do reparo do DNA metoxiamina em linhagens de glioblastoma. / Assessment of cellular responses mediated by temozolomide combined with metoxiamina, an inhibitor of DNA repair, in glioblastoma cell lines.

Montaldi, Ana Paula de Lima 08 April 2009 (has links)
Os gliomas compreendem mais de 70% de todos os tumores cerebrais primários. Mesmo com tratamento agressivo, a média de sobrevivência relatada para estes tumores é geralmente menor do que 1 ano após o diagnóstico. A quimioterapia baseada em agentes alquilantes, como a temozolomida (TMZ), tem mostrado, em média, uma modesta resposta e pequeno aumento da sobrevida. As principais lesões causadas pela TMZ são os aductos N7-metil-G e N3-metil-A, que são processados pelo reparo por excisão de base (BER), compreendendo mais de 80% das lesões induzidas no DNA pela TMZ. Há evidência de que a resistência a este quimioterápico pode ser causada em parte por um eficiente processo de reparo via BER, mas poucos estudos têm focalizado essa abordagem. Metoxiamina (MX) é um inibidor do reparo via BER que tem sido atualmente investigado como um possível aliado no combate a vários tipos de tumores, aumentando os efeitos citotóxicos de drogas, tais como a TMZ. No presente trabalho, foram avaliadas as respostas celulares de células de glioblastoma (GBM) ao tratamento com a TMZ, associada ou não à MX. Foram analisados parâmetros como citotoxicidade (24 h, Kit XTT), sobrevivência celular (120 h, Kit XTT) e clonogênica (10 dias após o tratamento), danos no DNA pelo Ensaio Cometa (2, 6, 12 e 24 h), a indução de apoptose (24, 48 e 72 h) e alterações na expressão gênica e transcricional (24, 48 e 72h) de genes envolvidos na via de reparo por BER. Sob tratamento das linhagens de GBM (U87, U343, U251, U138 e T98G) a diferentes concentrações de TMZ (100 a 1000 M), o efeito citotóxico foi observado em células analisadas após 120 h, sendo que a linhagem T98G foi a mais resistente ao tratamento com TMZ e foi a única a apresentar diferenças significativas entre o tratamento sozinho e combinado (p 0,05). Assim, foi selecionada a linhagem T98G para os demais experimentos e estudar as possíveis vias implicadas na resistência a essa droga. A sobrevivência clonogênica das células T98G foi reduzida, sob tratamento com a TMZ (100 a 800 M), com diferença significativas para as concentrações superiores a 400 M. Observou-se que o efeito da TMZ foi acentuado quando associada ao inibidor, com diferenças significativas para todas as concentrações testadas. A droga induziu uma maior porcentagem de danos no DNA (Ensaio Cometa) para ambos os tratamentos (400 e 600 M) e nos tempos de 2 e 6 h, com diferenças significativas entre os tratamentos (TMZ e TMZ+MX), somente na concentração de 600 M/2 h. Entretanto esses danos se equipararam nos tempos seguintes. A indução de apoptose analisada nas células T98G mostrou a freqüência máxima de 24,2% no tempo de 72h, na concentração de 600 M de TMZ, enquanto que uma maior indução de apoptose (47,7%) foi observada para a mesma concentração no tratamento combinado (TMZ + MX), resultando em diferenças significativas. A análise de expressão gênica realizada para os genes APE1, FEN1 e XRCC1, mostraram que houve uma menor indução dos genes APE1 e FEN1 no tratamento combinado. A expressão da proteína APE1 (analisada por Western blot) foi menos intensa em todos os tempos de tratamento combinado (TMZ + MX), possivelmente pelo bloqueio dos sítios AP causado pelo inibidor MX. A proteína FEN1 mostrou-se menos expressa na comparação dos tratamentos, nos tempos de 48 e 72 h, indicando uma inibição de proteínas da via BER downstream à remoção de sítios AP por APE1, possivelmente pela ligação de MX. PCNA teve sua expressão protéica aumentada no tratamento combinado, nos tempos de 24 h, e principalmente em 48 h, sugerindo uma indução devida a um aumento de danos no DNA. Portanto, os resultados dos ensaios realizados com a associação da TMZ à MX demonstraram a influência do tratamento combinado sobre a expressão de proteínas envolvidas no reparo via BER, o que contribuiu para uma redução da capacidade proliferativa das células T98G em decorrência da maior indução de danos por aductos DNA-MX não reparados, resultando também em aumento de morte celular apoptótica. Esses dados mostram que a modulação do reparo via BER pode constituir uma estratégia promissora para aumentar a eficácia do tratamento com a TMZ, o que poderá futuramente embasar a escolha de procedimentos terapêuticos que resultem numa maior eficácia do tratamento de gliomas com agentes alquilantes. / Gliomas represent more than 70% of primary brain tumors. Even following an aggressive therapies, the mean survival rate of patients with these tumors is less than one year after diagnosis. Chemotherapy based on alkyklating agents, such as temozolomide (TMZ) has been reported to increase the survival rate. N7-metyl-G and N3-metyl-A adducts comprise more than 80% of the DNA lesions induced by TMZ and are processed by the base excision repair process (BER). There is evidence in the literature suggesting that the resistance to TMZ could be caused, in part, by an efficient repair by BER pathway, although few studies have focused on this subject. Metoxiamine (MX) is an effective BER inhibitor, which has been investigated as a conceivable treatment for different kinds of tumor, due to its synergistic effect with antitumoral drugs, such as TMZ. In the present study, the cellular responses to TMZ treatment associated or not with MX were evaluated in giloblastoma (GBM) cell lines. Several parameters were analyzed, such as cytotoxicity (24 h), cellular survival (120 h) and clonogenic efficiency (10 days after treatment), DNA damage and repair kinetics (after 2, 6, 12 and 24 h of recovery time), apoptosis induction (24, 48 and 72 h) and alterations in gene expression (24, 48 e 72h) for genes playing role in BER pathway. The treatment with TMZ 100 -1000 M (during 24 h) was cytotoxic for all GBM cell lines tested (U87, U343, U251, U138 and T98G), as analyzed after 120 h, with the T98G cell line being be the most resistant to TMZ; besides, T98G was the only one to present significant differences (p 0,05) in survival rates measured between TMZ treatment and TMZ combined with MX. Thus, T98G cells were selected for the subsequent experiments and for the study of the pathways implicated in TMZ resistance. The clonogenic efficiency of T98G cells was reduced under TMZ treatment (100 - 800 M) with significant differences for treatments above 400 M. In addition, the combined treatment TMZ plus MX significantly increased the cytotoxic effects, even for the lowest concentration. The comet assay showed higher percentage of DNA damage for both treatment modalities (TMZ and TMZ+MX) at 2 and 6 h of recovery, with significant differences between treatments for 2 h. Following 12 and 24 h of recovery, the amount of DNA damage reached the control levels, indicating the repair of DNA breaks. Apoptosis induction in T98G cells showed the highest frequency (24.2%) at 72h for 600 M TMZ, while the highest apoptosis induction (47.7%) was observed for the same concentration combined to MX. Quantitative gene expression analysis performed for three genes, APE1, FEN1 and XRCC1, showed a reduced expression of APE1 and FEN1 for the combined treatment. Western blot analysis demonstrated that APE1 was less expressed for all kind of treatments, probably due to AP-sites blockade caused by the inhibitor MX. In addition, FEN1 showed low levels of expression at 48h and 72h, indicating the inhibition of BER pathway downstream to the AP removal by APE1. On the other hand, PCNA expression was higher for the combined treatment (24h and mainly 48h), suggesting its induction probably due to increased DNA damage. Therefore, the present results demonstrated that the association of TMZ with MX interfered with the expression of proteins involved in BER, thus, reducing the clonogenic efficiency of T98G cells, probably as a consequence of the high production of unrepaired DNA-MX adducts, leading to cell death, including apoptosis. These data show that the modulation of BER is a promising strategy for magnifying the therapeutic impact of TMZ, and in the next future, this strategy may embrace the option to establish novel and efficient therapy protocols for the treatment of gliomas with alkylating agents.
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Expressão dos genes EGFR, PTEN, MGMT e IDH1/2 e dos microRNAs miR-181b, miR-145, miR-149 e miR128a em neuroesferas em linhagens de glioblastoma submetidos ao tratamento com radiação ionizante e temozolomida / Expression of EGFR, PTEN, MGMT and IDH1 / 2 Genes and the MicroRNAs miR-181b, miR-145, miR-149 and miR-128a in Neurospheres In Glioblastoma Lineages Undergoing Treatment with Ionizing Radiation and Temozolomide

Thiago Lins da Costa Almeida 17 June 2016 (has links)
Introdução: O glioblastoma multiforme é a neoplasia maligna primária mais prevalente do sistema nervoso central. Enquanto apresenta aumento em sua incidência, mantém a perspectiva de sobrevida global aproximada de 14 meses. Objetivos: O presente estudo objetiva avaliar a expressão dos genes EGFR, PTEN, MGMT e IDH1/2 e dos microRNAs miR-181b, miR-145, miR-149 e miR-128a em neuroesferas (NE) e células aderidas (CA), a partir das linhagens celulares (T98G e U343) submetidas ao tratamento com temozolomida (TMZ) e com radiação ionizante (RI) isolados e em associação (TMZ+RI). Material e métodos: As linhagens celulares T98G e U343 foram tratadas com TMZ, RI e TMZ+RI. A verificação da expressão dos genes e miRNAs foi realizada utilizando o método de PCR em tempo real. Resultados: Observamos: a) o aumento na expressão do IDH1 após RI (4-fold) e TMZ+RI (5-fold) nas NE (T98G); o aumento na expressão do IDH2 (20-fold) nas NE (T98G), após TMZ, e do IDH2 (3-fold) nas CA (U343) submetidas à TMZ+RI; b) a redução na expressão do EGFR após TMZ; o aumento dessa expressão nas NE (T98G), após RI (2-fold) e TMZ+RI (3-fold), e a sua diminuição nas CA (U343) submetidas à TMZ e TMZ+RI; c) a redução na expressão PTEN nas NE (T98G), após TMZ e RI, e sua expressão nas NE (3-fold) frente à TMZ+RI; d) aumento na expressão de MGMT nas NE (T98G) nos grupos RI (10-fold) e TMZ+RI (25-fold). Quanto a expressão de miRNAs, foram identificados os seguintes resultados: a) as CA (U343) expressaram: miR-181b após TMZ (60-fold), RI (20-fold) e TMZ+RI (40- fold); e miR-128a após TMZ (500-fold), RI (200-fold) e TMZ+RI (600-fold); b) as NE (T98G) após TMZ+RI expressaram: miR-181b (30-fold), miR-149 (40-fold), miR-145 (300-fold) e miR-128a (40-fold); c) as NE (U343) após RI hiperexpressaram miR-149 e miR-145 (ambos em 4000-fold). Conclusão: A RI apresentou-se como fator independente e determinante para a radiorresistência das NE, entretanto não observamos ação de complementariedade de regulação dos oncomiRs observados sobre a expressão dos genes estudados. Esta é a primeira análise na literatura que correlaciona a expressão de genes e de miRNAs através das intervenções TMZ, RI e TMZ+RI sobre células aderidas e neurosferas. / Introduction: Glioblastoma multiforme is the most prevalent primary malignant neoplasm of the central nervous system. It has increased its incidence, while the overall survival remains over 14 months. Objectives: This study aims to evaluate the expression of the following genes EGFR, PTEN, MGMT and IDH1/2 and microRNAs miR-181b, miR-145, miR-149 and miR-128a in adhered cells (AC) and neurospheres (NS) from cell lines (T98G and U343) which were submitted to temozolomide (TMZ) and ionizing radiation (IR), isolated and associated (TMZ + IR). Methods: The cell lines T98G and U343 were treated with TMZ, IR and TMZ+IR. The analysis of gene expression and miRNAs was performed using the PCR in real time. Results: This study demonstrated: a) an improvement in the expression of IDH1 after IR (4-fold) and TMZ + IR (5-fold) in the NS (T98G); increased expression of IDH2 (20-fold) in the NS (T98G) after TMZ and IDH2 (3-fold) in AC (U343) submitted to TMZ + IR; b) reduction in EGFR expression after TMZ; increase this expression in NS (T98G) after IR (2-fold) and TMZ + IR (3-fold), and a decrease in AC (U343) submitted to TMZ and TMZ + IR; c) reduction in PTEN expression in NS (T98G) after TMZ and IR, and its improvement in NS (3-fold) when compared to TMZ + IR; d) increase in the expression of MGMT in NS (T98G) in IR groups (10-fold) and TMZ + IR (25-fold). It was also identified the expression of miRNAs results as: a) AC (U343) expressed more miR-181b after TMZ (60-fold), IR (20-fold) and TMZ + IR (40-fold); and miR- 128a improved after TMZ (500-fold), IR (200-fold) and TMZ + IR (600-fold); b) NS (T98G) after TMZ + IR expressed: miR-181b (30-fold); miR-149 (40-fold); miR-145 (300-fold) and miR-128a (40-fold); c) NS (U343) after IR huge expressed miR-149 and miR-145 (both in 4000-fold). Conclusion: IR was an independent and determining radio resistance factor in NS. However, we observed no complementarity action of oncomiRs regulation. This is the first study in the literature correlating gene expression, and miRNAs through TMZ, IR and IR + TMZ interventions in AC and NS.

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