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Estudos estruturais e funcionais de septinas humanas: a ligação e hidrólise de GTP por SEPT3 e a busca de parceiros funcionais de SEPT1, SEPT5 e SEPT7 / Functional and structural studies of human septins: GTP hydrolyse and binding, and screening of functional partners to SEPT1, SEPT5 e SEPT7

Macêdo, Joci Neuby Alves 24 September 2010 (has links)
Septinas são proteínas que pertencem a super família das GTPases e que foram inicialmente identificadas em Saccharomyces cerevisae, mas logo em seguida, também em eucariotos superiores, exceto em plantas. Estas proteínas estão envolvidas em uma variedade de processos celulares tais como segregação de cromossomos, polaridade celular, dinâmica da membrana, tráfego de vesículas, exocitose, apoptose, entre outros. Mutações ou alterações no padrão de expressão de septinas são associadas com vários cânceres e doenças neurológicas. Objetivando contribuir com informações funcionais sobre tais proteínas, as septinas humanas 1, 5 e 7 foram usadas como iscas em ensaios de duplo híbrido em leveduras visando à identificação de seus parceiros protéicos. Após a varredura de bibliotecas de cDNA de leucócitos e cérebro fetal humano, os parceiros protéicos predominantemente encontrados foram outras septinas de grupos diferentes aos das iscas. As interações septina-septina envolveram o domínio de ligação a GTP. Ainda, outros parceiros, diferentes de septinas, foram também identificados nas bibliotecas e estes se mostraram funcionalmente relacionados à endocitose, à regulação da atividade de GTPases, ao tráfego intracelular, aos ciclos de sumoilação, à manutenção da placa metafásica e à maturação do centrossomo. Algumas destas funções são inéditas e foram pela primeira vez relacionadas às septinas. Este trabalho também esteve voltado à caracterização biofísica das septinas 3 e 5 (SEPT3 e SEPT5). Muitos protocolos diferentes foram desenvolvidos na tentativa de obter amostras homogêneas de SEPT5, mas não foram bem sucedidos. Por outro lado, SEPT3 recombinante, destituída do domínio amino-terminal (SEPT3GC) foi eficientemente produzida em E. coli. O estado monomérico de SEPT3GC em solução foi confirmado por cromatografia de exclusão molecular e espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS). SEPT3GC mostrou-se ativa e capaz de hidrolizar GTP in vitro. A afinidade de SEPT3GC por GTPγS e GDP foi avaliada por calorimetria de titulação isotérmica (ITC), sendo que o KD de SEPT3GC para GTPγS foi de 5,43 μM e a ligação para este nucleotídeo foi dependente de Mg2+. A ligação para GDP não foi detectável. Agregados de SEPT3GC induzidos por temperatura foram capazes de ligar a sonda fluorescente tioflavina-T, sugerindo uma natureza amilóide para tais estruturas. / Septins are proteins that belong to the superfamily of GTPases, which were initially identified in Saccharomyces cerevisiae, and then in higher eukaryotes, except plants. These proteins are involved in a variety of cellular processes such as chromosome segregation, cell polarity, membrane dynamics, vesicle trafficking, exocytosis, apoptosis, among others. Mutations or changes in the expression of septins have been associated with various cancers and neurological diseases. Aiming to provide functional information about these proteins, the human septins 1, 5 and 7 were used as baits in yeast two-hybrid assay in order to identify their protein partners. After screening cDNA libraries from human leukocytes and fetal brain, the protein partners predominantly found were septins from others groups. The septin-septin interactions involved the GTP binding domain. Others non-septins interactors have also been identified in the libraries and were functionally related to endocytosis, the regulation of the GTPase activity, intracellular trafficking, sumoylation, maintenance of metaphase plate and centrosome maturation. Some of these functions are new and were related to the septins for the first time. This work also focused on the biophysical characterization of the septins 3 and 5 (SEPT3 and SEPT5). Many different protocols were developed aiming to obtain homogeneous samples of SEPT5, but were not successful. On the other hand, recombinant SEPT3, without the amino-terminal domain (SEPT3GC), was produced in a homogeneous form in E. coli. SEPT3GC is monomeric in solution as confirmed by size exclusion chromatography and small-angle X-ray scattering (SAXS). Also, SEPT3GC has shown to be active and able to hydrolyze GTP in vitro. The SEPT3GC affinity by GTPγS and GDP were evaluated by isothermal titration calorimetry (ITC). The KD for GTPγS was about 5,43 μM and it was observed to be Mg2+ dependent. The binding to GDP was not detectable. SEPT3GC aggregates induced by temperature were able to bind the thioflavin-T fluorescent probe, suggesting an amyloid nature for such structures.
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Estudos estruturais da septina humana SEPT11 / STRUCTURAL STUDIES OF THE HUMAN SEPTIN SEPT11

Hoff, Caroline 29 August 2008 (has links)
Septinas são proteínas de ligação ao nucleotídeo de guanina (GTP). Foram inicialmente identificadas em fungos e atuam na fase final da divisão celular. Posteriormente, também verificaram que esta família de proteínas está presente em outros eucariotos com exceção de plantas. Septinas são purificadas de fungos Saccharomyces cerevisiae, Drosophila e cérebro de mamíferos na forma de heterofilamentos e são constituídas de três regiões principais: um N-terminal variável, um domínio central GTPase altamente conservado e um domínio coiled-coil C-terminal. Sabe-se que existem pelo menos catorze genes que codificam septinas em humanos, no entanto, há poucas informações estruturais sobre elas. Destas catorze septinas, somente três (septinas 2, 6 e 7) tiveram parte de suas estruturas cristalográficas determinada, principalmente os domínios GTPase. A família das septinas pode ser dividida em quatro subgrupos baseado em similaridade seqüencial. Um deles (grupo II) é formado por SEPT6, SEPT8, SEPT10, SEPT11 e a recém-descoberta SEPT14. A proteína SEPT11 foi descrita pela primeira vez em 2004 e detectada em vários tecidos humanos. Faz parte de complexos com outras septinas na formação de heterofilamentos e pode estar envolvida no transporte tubular e filtração glomerular nos rins. Para apresentar os estudos com a proteína SEPT11 nós a dividimos em domínios estruturais: SEPT11NG (domínios N-terminal e GTPase), SEPT11G (domínio GTPase), SEPT11GC (domínios GTPase e C-terminal) e SEPT11NGC (domínios N-terminal, GTPase e C-terminal). Os genes dos domínios estruturais SEPT11G e SEPT11GC foram clonados em vetor de expressão bacteriano, e SEPT11NG em vetor de propagação bacteriano. Tanto SEPT11G quanto SEPT11GC foram produzidos em E. coli e purificados com sucesso. O espectro de dicroísmo celular (CD) e o emprego de técnicas computacionais mostraram que a SEPT11 apresenta um perfil característico de proteínas do tipo &#945/&#946 coerente com a estrutura observada para SEPT6. Os estudos de espalhamento de luz a 350 nm mostraram que a proteína sofre um forte processo de agregação em temperaturas maiores que 30&#176C, parecido com outras septinas (incluindo SEPT4 e SEPT2) e condizentes com estudos de estabilidade térmica acompanhados por CD. Resultados de cromatografia de exclusão molecular indicam que SEPT11G foi produzida na forma de um homodímero (como também visto para SEPT4, SEPT2 e SEPT7) e SEPT11GC na forma de um monômero. Todos estes dados sugerem que as proteínas heterólogas descritas aqui enovelaram corretamente e assumiram sua estrutura nativa. Porém também foi demonstrado que a SEPT11G não apresentava nenhum nucleotídeo ligado (GDP ou GTP) mesmo quando purificada na presença dos mesmos. Resultados de modelagem da SEPT11G baseado no domínio GTPase da SEPT6 não revelaram nenhuma diferença significativa em torno do sítio ativo capaz de explicar a incapacidade da SEPT11 em ligar GTP/GDP. Especulamos que no caso da SEPT11 (e possivelmente outras septinas do grupo II), a presença de outras septinas e a montagem do heterofilamento sejam necessárias para estabilizar a interação entre GTP e a proteína. / Septins are GTP-binding proteins. They were originally identified in fungi and act during the final stages of cell division. Subsequently, they were also identified in other eukaryotic with the exception of plants. Septins are purified from Saccharomyces cerevisiae, Drosophila, and mammalian brain in the form of heterofilaments and consist of three principal regions: a variable N-terminal domain, a central highly conserved GTP-binding domain and a coiled-coil domain at the C-terminus. It is known that there are at least 14 human septin genes but as yet, there is still relatively little structural information concerning their protein products. Of these, only three (septins 2, 6 and 7) have had part of their three-dimensional structure (principally the GTPase domain) determined by X-ray crystallography. The septin family can be divided into four subgroups on the basis of sequence similarity. One of them (group II) is composed of SEPT6, SEPT8, SEPT10, SEPT11 and SEPT14. SEPT11 was described for the first time in 2004 and was observed to be expressed in several human tissues. It is described as forming part of heterofilamentous complexes with other septins and may be involved in the glomerular filtration in the kidney. In order to characterize the SEPT11 protein, it was initially divided into its component structural domains and several constructs elaborated: SEPT11NG (N-terminal and GTPase domain), SEPT11G (GTPase domain), SEPT11GC (GTPase domain and C-terminal) and SEPT11NGC (N-terminal, GTPase and C-terminal domains). The genes corresponding to SEPT11G and SEPT11GC were cloned in an expression vector and SEPT11NG into a bacterial propagation vector. Both SEPT11G and SEPT11GC were successfully produced in E. coli and subsequently purified. Both circular dichroism spectra and computational techniques indicated that SEPT11 exhibited that both proteins were of the &#945/&#946 type, as anticipated, coherent with the structure of SEPT6. Light scattering measurements at 350 nm showed that the protein undergoes a process of aggregation at temperatures above 30&#176C, similar to other septins (SEPT2 and SEPT4) and consistent with thermal stability studies using circular dichroism. Results of size exclusion chromatography indicated that SEPT11G formed dimers (similar to SEPT2, SEPT4 and SEPT7) and SEPT11GC apparently formed monomers only. All of these experimental data suggest that the heterologously expressed proteins described here folded into their native conformation. On the other hand, we also demonstrated that SEPT11G was nucleotide free even when purified in the presence of excess GTP or GDP. Homology modeling of the GTPase domain of SEPT11 failed to reveal any significant differences with respect to SEPT6 which would explain this lack of binding activity. We speculate that in the case of SEPT11 (and possibly other members of the group II septins) the presence of partner septins and the formation of the heterofilaments are essential for stable nucleotide binding.
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Estudos estruturais da septina humana SEPT11 / STRUCTURAL STUDIES OF THE HUMAN SEPTIN SEPT11

Caroline Hoff 29 August 2008 (has links)
Septinas são proteínas de ligação ao nucleotídeo de guanina (GTP). Foram inicialmente identificadas em fungos e atuam na fase final da divisão celular. Posteriormente, também verificaram que esta família de proteínas está presente em outros eucariotos com exceção de plantas. Septinas são purificadas de fungos Saccharomyces cerevisiae, Drosophila e cérebro de mamíferos na forma de heterofilamentos e são constituídas de três regiões principais: um N-terminal variável, um domínio central GTPase altamente conservado e um domínio coiled-coil C-terminal. Sabe-se que existem pelo menos catorze genes que codificam septinas em humanos, no entanto, há poucas informações estruturais sobre elas. Destas catorze septinas, somente três (septinas 2, 6 e 7) tiveram parte de suas estruturas cristalográficas determinada, principalmente os domínios GTPase. A família das septinas pode ser dividida em quatro subgrupos baseado em similaridade seqüencial. Um deles (grupo II) é formado por SEPT6, SEPT8, SEPT10, SEPT11 e a recém-descoberta SEPT14. A proteína SEPT11 foi descrita pela primeira vez em 2004 e detectada em vários tecidos humanos. Faz parte de complexos com outras septinas na formação de heterofilamentos e pode estar envolvida no transporte tubular e filtração glomerular nos rins. Para apresentar os estudos com a proteína SEPT11 nós a dividimos em domínios estruturais: SEPT11NG (domínios N-terminal e GTPase), SEPT11G (domínio GTPase), SEPT11GC (domínios GTPase e C-terminal) e SEPT11NGC (domínios N-terminal, GTPase e C-terminal). Os genes dos domínios estruturais SEPT11G e SEPT11GC foram clonados em vetor de expressão bacteriano, e SEPT11NG em vetor de propagação bacteriano. Tanto SEPT11G quanto SEPT11GC foram produzidos em E. coli e purificados com sucesso. O espectro de dicroísmo celular (CD) e o emprego de técnicas computacionais mostraram que a SEPT11 apresenta um perfil característico de proteínas do tipo &#945/&#946 coerente com a estrutura observada para SEPT6. Os estudos de espalhamento de luz a 350 nm mostraram que a proteína sofre um forte processo de agregação em temperaturas maiores que 30&#176C, parecido com outras septinas (incluindo SEPT4 e SEPT2) e condizentes com estudos de estabilidade térmica acompanhados por CD. Resultados de cromatografia de exclusão molecular indicam que SEPT11G foi produzida na forma de um homodímero (como também visto para SEPT4, SEPT2 e SEPT7) e SEPT11GC na forma de um monômero. Todos estes dados sugerem que as proteínas heterólogas descritas aqui enovelaram corretamente e assumiram sua estrutura nativa. Porém também foi demonstrado que a SEPT11G não apresentava nenhum nucleotídeo ligado (GDP ou GTP) mesmo quando purificada na presença dos mesmos. Resultados de modelagem da SEPT11G baseado no domínio GTPase da SEPT6 não revelaram nenhuma diferença significativa em torno do sítio ativo capaz de explicar a incapacidade da SEPT11 em ligar GTP/GDP. Especulamos que no caso da SEPT11 (e possivelmente outras septinas do grupo II), a presença de outras septinas e a montagem do heterofilamento sejam necessárias para estabilizar a interação entre GTP e a proteína. / Septins are GTP-binding proteins. They were originally identified in fungi and act during the final stages of cell division. Subsequently, they were also identified in other eukaryotic with the exception of plants. Septins are purified from Saccharomyces cerevisiae, Drosophila, and mammalian brain in the form of heterofilaments and consist of three principal regions: a variable N-terminal domain, a central highly conserved GTP-binding domain and a coiled-coil domain at the C-terminus. It is known that there are at least 14 human septin genes but as yet, there is still relatively little structural information concerning their protein products. Of these, only three (septins 2, 6 and 7) have had part of their three-dimensional structure (principally the GTPase domain) determined by X-ray crystallography. The septin family can be divided into four subgroups on the basis of sequence similarity. One of them (group II) is composed of SEPT6, SEPT8, SEPT10, SEPT11 and SEPT14. SEPT11 was described for the first time in 2004 and was observed to be expressed in several human tissues. It is described as forming part of heterofilamentous complexes with other septins and may be involved in the glomerular filtration in the kidney. In order to characterize the SEPT11 protein, it was initially divided into its component structural domains and several constructs elaborated: SEPT11NG (N-terminal and GTPase domain), SEPT11G (GTPase domain), SEPT11GC (GTPase domain and C-terminal) and SEPT11NGC (N-terminal, GTPase and C-terminal domains). The genes corresponding to SEPT11G and SEPT11GC were cloned in an expression vector and SEPT11NG into a bacterial propagation vector. Both SEPT11G and SEPT11GC were successfully produced in E. coli and subsequently purified. Both circular dichroism spectra and computational techniques indicated that SEPT11 exhibited that both proteins were of the &#945/&#946 type, as anticipated, coherent with the structure of SEPT6. Light scattering measurements at 350 nm showed that the protein undergoes a process of aggregation at temperatures above 30&#176C, similar to other septins (SEPT2 and SEPT4) and consistent with thermal stability studies using circular dichroism. Results of size exclusion chromatography indicated that SEPT11G formed dimers (similar to SEPT2, SEPT4 and SEPT7) and SEPT11GC apparently formed monomers only. All of these experimental data suggest that the heterologously expressed proteins described here folded into their native conformation. On the other hand, we also demonstrated that SEPT11G was nucleotide free even when purified in the presence of excess GTP or GDP. Homology modeling of the GTPase domain of SEPT11 failed to reveal any significant differences with respect to SEPT6 which would explain this lack of binding activity. We speculate that in the case of SEPT11 (and possibly other members of the group II septins) the presence of partner septins and the formation of the heterofilaments are essential for stable nucleotide binding.
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Estudos estruturais e funcionais de septinas humanas: a ligação e hidrólise de GTP por SEPT3 e a busca de parceiros funcionais de SEPT1, SEPT5 e SEPT7 / Functional and structural studies of human septins: GTP hydrolyse and binding, and screening of functional partners to SEPT1, SEPT5 e SEPT7

Joci Neuby Alves Macêdo 24 September 2010 (has links)
Septinas são proteínas que pertencem a super família das GTPases e que foram inicialmente identificadas em Saccharomyces cerevisae, mas logo em seguida, também em eucariotos superiores, exceto em plantas. Estas proteínas estão envolvidas em uma variedade de processos celulares tais como segregação de cromossomos, polaridade celular, dinâmica da membrana, tráfego de vesículas, exocitose, apoptose, entre outros. Mutações ou alterações no padrão de expressão de septinas são associadas com vários cânceres e doenças neurológicas. Objetivando contribuir com informações funcionais sobre tais proteínas, as septinas humanas 1, 5 e 7 foram usadas como iscas em ensaios de duplo híbrido em leveduras visando à identificação de seus parceiros protéicos. Após a varredura de bibliotecas de cDNA de leucócitos e cérebro fetal humano, os parceiros protéicos predominantemente encontrados foram outras septinas de grupos diferentes aos das iscas. As interações septina-septina envolveram o domínio de ligação a GTP. Ainda, outros parceiros, diferentes de septinas, foram também identificados nas bibliotecas e estes se mostraram funcionalmente relacionados à endocitose, à regulação da atividade de GTPases, ao tráfego intracelular, aos ciclos de sumoilação, à manutenção da placa metafásica e à maturação do centrossomo. Algumas destas funções são inéditas e foram pela primeira vez relacionadas às septinas. Este trabalho também esteve voltado à caracterização biofísica das septinas 3 e 5 (SEPT3 e SEPT5). Muitos protocolos diferentes foram desenvolvidos na tentativa de obter amostras homogêneas de SEPT5, mas não foram bem sucedidos. Por outro lado, SEPT3 recombinante, destituída do domínio amino-terminal (SEPT3GC) foi eficientemente produzida em E. coli. O estado monomérico de SEPT3GC em solução foi confirmado por cromatografia de exclusão molecular e espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS). SEPT3GC mostrou-se ativa e capaz de hidrolizar GTP in vitro. A afinidade de SEPT3GC por GTPγS e GDP foi avaliada por calorimetria de titulação isotérmica (ITC), sendo que o KD de SEPT3GC para GTPγS foi de 5,43 μM e a ligação para este nucleotídeo foi dependente de Mg2+. A ligação para GDP não foi detectável. Agregados de SEPT3GC induzidos por temperatura foram capazes de ligar a sonda fluorescente tioflavina-T, sugerindo uma natureza amilóide para tais estruturas. / Septins are proteins that belong to the superfamily of GTPases, which were initially identified in Saccharomyces cerevisiae, and then in higher eukaryotes, except plants. These proteins are involved in a variety of cellular processes such as chromosome segregation, cell polarity, membrane dynamics, vesicle trafficking, exocytosis, apoptosis, among others. Mutations or changes in the expression of septins have been associated with various cancers and neurological diseases. Aiming to provide functional information about these proteins, the human septins 1, 5 and 7 were used as baits in yeast two-hybrid assay in order to identify their protein partners. After screening cDNA libraries from human leukocytes and fetal brain, the protein partners predominantly found were septins from others groups. The septin-septin interactions involved the GTP binding domain. Others non-septins interactors have also been identified in the libraries and were functionally related to endocytosis, the regulation of the GTPase activity, intracellular trafficking, sumoylation, maintenance of metaphase plate and centrosome maturation. Some of these functions are new and were related to the septins for the first time. This work also focused on the biophysical characterization of the septins 3 and 5 (SEPT3 and SEPT5). Many different protocols were developed aiming to obtain homogeneous samples of SEPT5, but were not successful. On the other hand, recombinant SEPT3, without the amino-terminal domain (SEPT3GC), was produced in a homogeneous form in E. coli. SEPT3GC is monomeric in solution as confirmed by size exclusion chromatography and small-angle X-ray scattering (SAXS). Also, SEPT3GC has shown to be active and able to hydrolyze GTP in vitro. The SEPT3GC affinity by GTPγS and GDP were evaluated by isothermal titration calorimetry (ITC). The KD for GTPγS was about 5,43 μM and it was observed to be Mg2+ dependent. The binding to GDP was not detectable. SEPT3GC aggregates induced by temperature were able to bind the thioflavin-T fluorescent probe, suggesting an amyloid nature for such structures.
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High Throughput Screening for Modulators of LRRK2 GTPase Activity

Gray, Derrick Allen 06 1900 (has links)
Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Parkinson's disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder that affects over 10 million people. Treatments for PD are limited to symptom mitigation with no means of stopping or slowing disease progression. Mutations within the protein leucine- rich repeat kinase 2 (LRRK2) are the most common cause of familial PD and are indistinguishable from the more common sporadic cases. Identifying molecules capable of modulating LRRK2 GTPase activity may serve as the foundation for future development of novel PD therapeutics. We recently discovered that the G-domain (ROC) of LRRK2 is capable of transitioning between monomer and dimer form in solution upon GTP/GDP binding. R1441C/G/H pathogenic mutations were demonstrated to alter this dynamic shifting toward a monomeric ROC conformation while decreasing GTPase activity. Using our ROC dimeric crystal structure, we strategically introduced disulfide bonds to generate locked monomer and locked dimer states. Monomeric ROC was shown to increase GTPase activity while the dimeric form decreased activity. Solvent mapping performed using the dimeric ROC crystal structure and a homology model of the ROC monomer revealed a binding hotspot at the ROC dimeric interface and adjacent to the R1441 residue in the monomeric model. In this study our goal was to identify more compounds capable of influencing GTPase activity. We performed high throughput screening of ROC against two compound libraries (LOPAC1280 and ChemBridge 50K) in a GTP binding assay. Twenty-three hits were identified and four compounds were further investigated in dose-response experiments. 3,4-Methylenedioxy-beta nitrostyrene (MNS) was demonstrated to decrease GTP binding and inhibit GTPase activity (IC50=23.92μM) while the compound N-phenylanthranilic acid increased GTP binding (EC50=4.969μM) and decreased GTPase activity. Identification of these compounds is the first step in the development of a novel PD therapeutic targeting the G-domain of LRRK2.
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Estudos estruturais e bioquímicos das septinas 7 e 9 humanas / Structural and biochemical studies of human septins 7 e 9

Alessandro, Fernando 07 June 2010 (has links)
As proteínas pertencentes à família das septinas foram originalmente descobertas em 1971 em decorrencia de estudos genéticos em células mutantes. Essas proteínas encontradas em fungos e animais, mas não em plantas apresentam como principais características a presença de um domínio conservado de ligação aos nucleotídeos de guanina (GTP) e a formação de filamentos homo- e hetero-oligoméricos, que são estruturas altamente organizadas. Estudos filogenéticos e moleculares em humanos identificaram 14 septinas que são divididas em 4 grupos (I, II, III e IV). Estas moléculas associam-se com membranas celulares, actina, microtúbulos do citoesqueleto e estão envolvidas em inúmeros processos que ocorrem no córtex celular e requerem organização espacial, tais como: citocinese, ciclo celular, formação de barreiras de difusão, alinhamento de fuso. Alterações na expressão das septinas estão associadas a vários tipos de tumores e a doenças de Parkinson e Alzheimer. Neste trabalho, com o objetivo de obter informações estruturais e bioquímicas das septinas 7 e 9 humanas. Este projeto é parte de um esforço conjunto coordenado pelo Prof. Dr. Richard C. Garratt e conhecido informalmente como Septimoma. As construções recombinantes SEPT 7, SEPT 7G, e SEPT 9G foram expressas em Escherichia coli e as proteínas recombinantes obtidas. As análises em eletroforese SDS-Page e em gel nativo indicam que essas proteínas foram purificadas com sucesso. A atividade GTPase e o estado oligomérico na forma dimérica foram verificados. Estudos de dicroísmo circular e fluorescência determinaram que esses recombinantes são formados por uma mistura de estruturas secundárias &alfa; e β, e também que o C e o N terminais aumentam a estabilidade das proteínas. Foram obtidos cristais da SEPT 7G e, por meio da técnica de raios-X, foi determinado um modelo tridimensional da proteína com resolução de 3,4o. / Proteins belonging to the septin family were originally discovered in 1971 through genetic studies of mutant cells. These proteins found in fungi and animals, but not in plants present, as their main characteristics, a conserved guanine nucleotide-binding domain (GTP) and they also form homo and hetero-oligomeric filaments that are highly organized structures. Phylogenetic and molecular studies in humans have identified 14 septins which are divided into 4 subfamilies (groups I, II, III and IV). These molecules associate with cell membranes, actin, cytoskeleton microtubules and they are related to a number of processes that take place in the cell cortex and that require spatial organization, such as cytokinesis, cell cycle, diffusion barrier formation and spindle alignment. Alterations in the expression of septins are associated with several types of tumors and with Parkinsons and Alzheimers diseases. In this work, with the goal of obtaining structural and biochemical information of human septins 7 and 9, the recombinants SEPT 7, SEPT 7G and SEPT 9G were expressed in E. coli. Analyses both in SDS-Page electroforesis and in native gel suggest that these proteins were purified successfully for they are soluble and homogeneous. GTpase activity has been verified in all of these recombinants, which shows that these proteins are present in native form and that additional molecules are not needed for this activity. It was possible to determine through different techniques such as molecular exclusion chromatography and SAXS that all the molecules in solution are grouped as dimeric form. Circular dichroism and fluorescence spectroscopic studies have determined both that such recombinants are formed by means of a mixture of &alfa; and β secondary structures and that the C and N-terminals increase the stability of proteins. Protein stability studies under different pH and temperature conditions show that the raise of the latter produces a greater molecular aggregation. Measurements of fluorescence emissions have indicated that the SEPT 7, SEPT 7G and SEPT 9G form structures of amyloid-like filaments found in many septins. Crystal structures of SEPT 7G have been obtained and, by means of the X-ray technique, a 3-D model of the protein has been determined with a resolution of 3.4o. It has been possible to predict, with molecular modeling studies, regions formed by loops that showed low electronic density in the GTPase crystallographic model. Therefore, it has been possible to add more structural information to this domain and to form the complete polypeptide without cuts.
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Estudos estruturais e bioquímicos das septinas 7 e 9 humanas / Structural and biochemical studies of human septins 7 e 9

Fernando Alessandro 07 June 2010 (has links)
As proteínas pertencentes à família das septinas foram originalmente descobertas em 1971 em decorrencia de estudos genéticos em células mutantes. Essas proteínas encontradas em fungos e animais, mas não em plantas apresentam como principais características a presença de um domínio conservado de ligação aos nucleotídeos de guanina (GTP) e a formação de filamentos homo- e hetero-oligoméricos, que são estruturas altamente organizadas. Estudos filogenéticos e moleculares em humanos identificaram 14 septinas que são divididas em 4 grupos (I, II, III e IV). Estas moléculas associam-se com membranas celulares, actina, microtúbulos do citoesqueleto e estão envolvidas em inúmeros processos que ocorrem no córtex celular e requerem organização espacial, tais como: citocinese, ciclo celular, formação de barreiras de difusão, alinhamento de fuso. Alterações na expressão das septinas estão associadas a vários tipos de tumores e a doenças de Parkinson e Alzheimer. Neste trabalho, com o objetivo de obter informações estruturais e bioquímicas das septinas 7 e 9 humanas. Este projeto é parte de um esforço conjunto coordenado pelo Prof. Dr. Richard C. Garratt e conhecido informalmente como Septimoma. As construções recombinantes SEPT 7, SEPT 7G, e SEPT 9G foram expressas em Escherichia coli e as proteínas recombinantes obtidas. As análises em eletroforese SDS-Page e em gel nativo indicam que essas proteínas foram purificadas com sucesso. A atividade GTPase e o estado oligomérico na forma dimérica foram verificados. Estudos de dicroísmo circular e fluorescência determinaram que esses recombinantes são formados por uma mistura de estruturas secundárias &alfa; e β, e também que o C e o N terminais aumentam a estabilidade das proteínas. Foram obtidos cristais da SEPT 7G e, por meio da técnica de raios-X, foi determinado um modelo tridimensional da proteína com resolução de 3,4o. / Proteins belonging to the septin family were originally discovered in 1971 through genetic studies of mutant cells. These proteins found in fungi and animals, but not in plants present, as their main characteristics, a conserved guanine nucleotide-binding domain (GTP) and they also form homo and hetero-oligomeric filaments that are highly organized structures. Phylogenetic and molecular studies in humans have identified 14 septins which are divided into 4 subfamilies (groups I, II, III and IV). These molecules associate with cell membranes, actin, cytoskeleton microtubules and they are related to a number of processes that take place in the cell cortex and that require spatial organization, such as cytokinesis, cell cycle, diffusion barrier formation and spindle alignment. Alterations in the expression of septins are associated with several types of tumors and with Parkinsons and Alzheimers diseases. In this work, with the goal of obtaining structural and biochemical information of human septins 7 and 9, the recombinants SEPT 7, SEPT 7G and SEPT 9G were expressed in E. coli. Analyses both in SDS-Page electroforesis and in native gel suggest that these proteins were purified successfully for they are soluble and homogeneous. GTpase activity has been verified in all of these recombinants, which shows that these proteins are present in native form and that additional molecules are not needed for this activity. It was possible to determine through different techniques such as molecular exclusion chromatography and SAXS that all the molecules in solution are grouped as dimeric form. Circular dichroism and fluorescence spectroscopic studies have determined both that such recombinants are formed by means of a mixture of &alfa; and β secondary structures and that the C and N-terminals increase the stability of proteins. Protein stability studies under different pH and temperature conditions show that the raise of the latter produces a greater molecular aggregation. Measurements of fluorescence emissions have indicated that the SEPT 7, SEPT 7G and SEPT 9G form structures of amyloid-like filaments found in many septins. Crystal structures of SEPT 7G have been obtained and, by means of the X-ray technique, a 3-D model of the protein has been determined with a resolution of 3.4o. It has been possible to predict, with molecular modeling studies, regions formed by loops that showed low electronic density in the GTPase crystallographic model. Therefore, it has been possible to add more structural information to this domain and to form the complete polypeptide without cuts.

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