Chez l’ensemble des organismes, la capacité des cellules à se polariser est une propriété nécessaire à la croissance, à la division, à la mobilité, à la différenciation ou encore au trafic intracellulaire. Les GTPases de la famille Rho jouent des rôles prépondérants dans la régulation de ces mécanismes. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, nous étudions la manière dont le régulateur RhoGAP Rgd1p des protéines Rho3 et Rho4 est lui-même régulé au cours de la croissance polarisée. Nous avons montré que la protéine Rgd1 est localisée au fond du bourgeon lors de la croissance isotropique du bourgeon puis sous forme d’un anneau au cou du bourgeon lors de la cytocinèse. Nous avons également montré que le trafic intracellulaire, notamment l’exocytose et les phosphoinosotides tels que le PdtIns(4)P et le PdtIns(4,5)P2 ont un rôle majeur dans la régulation spatio-temporelle de la protéine Rgd1. Ces mécanismes permettraient d’acheminer la protéine RhoGAP au niveau des sites de croissances afin d’agir sur les protéines Rho3 et Rho4. / In all organisms, the ability of cells to polarize is a property necessary for growth, cell division, mobility, cell differentiation or intracellular trafficking. GTPases of the Rho family play central roles in the regulation of these mechanisms. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, we study how the regulator RhoGAP Rgd1p of Rho3 and Rho4 proteins may be itself regulated during polarized growth. We showed that the protein Rgd1 is located at the bud tip during isotropic growth of the bud and form a ring at the bud neck during cytokinesis. We also showed that the intracellular traffic, especially the exocytosis and phosphoinosotides as the PdtIns(4)P and PdtIns(4,5)P2 have a major role in the spatio-temporal regulation of the Rgd1 protein. These mechanisms would deliver the RhoGAP protein at growth sites to act on Rho3 and Rho4 proteins.

Les GTPases de la famille Rho sont les principaux régulateurs du remodelage du cytosquelette d’actine lors de la migration et l’invasion cellulaire. En particulier, deux membres de cette famille sont importants dans ce processus : les GTPases RhoA et Rac1. En effet, il existe une balance d’activité de ces GTPases, responsables respectivement de la contraction cellulaire et de la formation d’extensions cytoplasmiques, des étapes clefs de la migration. L’objectif de ce travail de thèse a été d’étudier la régulation de ces protéines dans la migration et l’invasion cellulaire. Pour cela, plusieurs stratégies ont été entreprises. Tout d’abord, une étude structure/fonction de la protéine p190RhoGAP-A (p190A), un des régulateurs majeurs de la GTPase RhoA, a été réalisée. Cette étude a permis de mettre en évidence un domaine, appelé PLS pour « protrusion localization sequence », permettant à cette protéine de se localiser au niveau des extensions membranaires appelées « replis membranaires » et « lamellipodes » où RhoA est régulée localement. D’autre part, un mutant délété de ce domaine, appelé PLSp190A, ne peux pas se localiser au niveau de ces structures et a un impact négatif sur leur formation et la migration cellulaire. De plus, l’analyse de ce mutant a révélé que le domaine PLS était impliqué dans la régulation négative de p190A. Ainsi, nous avons mis en évidence un nouveau domaine de p190A responsable de sa localisation intracellulaire et de sa fonction. La deuxième partie de ce travail de thèse a été consacrée à la mise en place d’un outil de mesure de l’activité des GTPases Rho par la technologie Alphascreen. Ce test a permis de mesurer l’activité de Rac1 in vitro et in cellulo mais a également été appliqué à un crible en vue d’identifier de nouvelles molécules régulatrices de Rac1. Ainsi, ce travail de thèse, en abordant par plusieurs angles la régulation des GTPases de la famille Rho, a permis d’apporter des informations et des outils pour la compréhension des mécanismes complexes régissant la capacité des cellules à se mouvoir dans leur environnement. / RhoGTPases are major regulators of the actin cytoskeleton during cell migration and invasion. Particularly, the two members of the RhoGTPase family, RhoA and Rac1 play important roles in these processes. Indeed, a reciprocal balance between these GTPases’activity that leads to cell contraction and cell protrusion formation, determines cell movement. The aim of this PhD thesis was to study the regulation of RhoA and Rac1 during cell migration and invasion. To this end, various strategies were undertaken.We first performed a structure/function analysis of p190RhoGAP-A (p190A), a major negative regulator of RhoA. This led to the identification of a protrusion localization sequence (“PLS”) necessary and sufficient for p190A targeting to actin-based structures. A p190A mutant deleted of the PLS domain (PLS), does not localize to ruffles and lamellipodia, where RhoA is locally regulated during cell migration. This analysis also revealed that the PLS is required for the negative regulation of p190A activity. Finally, p190APLS expression has a dominant negative effect on the formation of actin protrusions and cell migration. Thus, we identified a novel functional domain of p190A required for its proper subcellular localization and functions. The second part of this PhD thesis was focused on the design of an Alphascreen technology-based assay to study GTPases activity. This assay allowed the measurement of Rac1 activity in vitro and in cellulo. Moreover, we used this assay to screen for new regulators of Rac1 activity. In conclusion, this work provides new insights and new tools for the understanding of RhoGTPase involvement in cell migration.

La polarité cellulaire est un phénomène biologique essentiel du monde vivant. Chez la levure Candida albicans, sa capacité à croître sous une forme hyperpolarisée semble être un élément déterminant de sa pathogénicité. Nous avons entrepris d’identifier les éléments moléculaires d’une structure essentielle à cette croissance hyphale, le Spitzenkörper, afin de mieux comprendre le rôle de ce corps apical dans la croissance polarisée. Nous nous sommes également intéressés à la régulation des protéines Rho3 et Rho4 impliquées dans la croissance polarisée de C. albicans, à travers l’identification et l’étude de la protéine RhoGAP commune à ces deux protéines Rhos, la protéine Rgd1.Chez la levure Saccharomyces cerevisiæ, les protéines Rho3 et Rho4 sont également impliquées dans le contrôle de la croissance polarisée, et sont régulées par la protéine Rgd1. Le laboratoire, à l’origine de la découverte de ce régulateur commun, étudiait des aspects de croissance polarisée contrôlée par les protéines Rho3 et Rho4, à travers l’étude de la régulation de la protéine Rgd1. Nous avons notamment mis en évidence que Rgd1p est modifiée au niveau post-traductionnel par des phosphorylations. La kinase Ipl1 de la famille des kinases Aurora est un des acteurs de cette modification. Différents éléments indiquent que le complexe phosphatase Glc7-Bud14 serait également impliqué dans le contrôle de l’état de phosphorylation de Rgd1p, de façon antagoniste à la kinase Ipl1 / Cell polarity is an essential process for living organisms. In the yeast Candida albicans, its ability of hyperpolarized growth seems to be a decisive element for its pathogenicity. We undertook to identify molecular elements of an essential structure for hyphal growth, named Spitzenkörper, to better understand the role of this apical body in polarised growth. We also studied regulation of Rho3 and Rho4 proteins implicated in C. albicans polarised growth, through identification and study of a shared RhoGAP protein, named Rgd1.In the yeast Saccharomyces cerevisiæ, Rho3 and Rho4 proteins are also implicated in polarised growth control, and are regulated by Rgd1 protein. The laboratory, which identified this shared regulator, studied polarised growth aspects controlled by Rho3 and Rho4 proteins, through study of Rgd1p regulation. We showed that Rgd1p is post-translationally modified, by phosphorylations. The Ipl1 kinase, an Aurora family member, is implicated in this modification. Several elements indicate that the Glc7-Bud14 phosphatase complex would be also implicated in the control of Rgd1 phosphorylation state, antagonistically to Ipl1p