La sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la démence fronto-temporale (DFT) sont deux maladies qui constituent un continuum clinico-pathologique. La mutation de FUS, une protéine nucléaire à fonctions multiples, provoque des cas familaux de SLA, et ces mutations provoquent une redistribution sub-cellulaire de FUS, du noyau vers le cytoplasme. Certains cas de DFT présentent une telles distribution anormale en l’absence de mutations de FUS. Il n’est pas connu si la maladie est provoquée par une perte de la fonction nucléaire de FUS et/ou un gain de fonction cytoplasmique.Nous avons généré et caractérisé une lignée de souris exprimant une forme cytoplasmique de FUS (Fus-ΔNLS). La localisation exclusive de FUS dans le cytoplasme provoque la mort des motoneurones via un gain de fonction dans les motoneurones eux-mêmes. Une localisation cytoplasmique partielle de FUS est suffisante pour développer un phénotype de la SLA et de DFT. Les mécanismes élucidés permettront de comprendre les bases des SLA/DFT. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Frontotemporal dementia (FTLD) are now considered as a unique clinicopathological spectrum referred to as ALS/FTLD. Cytoplasmic aggregation of the physiologically nuclear FUS protein is a hallmark feature of a subset of ALS/FTLD. It remains unknonwn whether the critical pathogenic event relies on a loss of FUS normal nuclear functions, a toxic gain of function of FUS in the cytoplasm, or a combination of both.To answer this question we have generated a conditional mouse model expressing truncated FUS without nuclear localization signal - FusΔNLS. Our data showed that complete cytoplasmic mislocalization of truncated FUS protein within spinal motor neurons is a major determinant of motor neuron degeneration via toxic gain of function. A partial mislocalization of truncated FUS protein was sufficient to trigger key features of ALS and of FTLD.These studies allowed the elucidation of mechanisms underlying FUS role in ALS/FTLD, and will hopefully lead to development of therapies for these devastating diseases.

Récemment, notre laboratoire a décrit plusieurs patients atteints d’une forme sévère et progressive de dystonie présentant des mutations de novo dans le gène du récepteur bêta de l’acide rétinoïque (RARB). RARB est un facteur de transcription activé lors de sa liaison à l’acide rétinoïque (AR), un élément essentiel au bon développement du cerveau. Des études de transfection indiquent que ces mutations augmentent l’activité transcriptionnelle de RARB, suggérant qu’elles confèrent un gain de fonction (GDF) à la protéine. La dystonie est typiquement expliquée par un dysfonctionnement du striatum, la structure où RARB est principalement exprimé. Chez la souris, la perte de fonction de Rarb entraîne une réduction des neurones striatonigraux et des anomalies motrices, suggérant une perturbation du développement des circuits striataux. Nous avons ainsi émis l’hypothèse selon laquelle la dystonie des patients porteurs de mutations de GDF serait causée par un accroissement de la signalisation de RARB, pouvant perturber l’homéostasie des mêmes circuits que ceux affectés par une diminution de la signalisation de Rarb. En utilisant la technologie CRISPR-Cas9, nous avons généré des souris portant la mutation p.R394C, homologue de la p.R387C retrouvée chez plusieurs patients. Ces souris RarbR394C/+ présentent des anomalies locomotrices rappelant celles d’autres modèles murins de dystonie, ainsi qu’une diminution des neurones striatopallidaux. Ceci suggère que les mutations de GDF de RARB induisent la dystonie en perturbant l’équilibre dans la signalisation dopaminergique striatale. Finalement, cette étude pourrait contribuer à comprendre les troubles neurodégénératifs moteurs, comme les maladies de Huntington et de Parkinson, dans lesquels la signalisation de l’AR semble être compromise. / We previously described several patients with a severe and progressive form of early-onset dystonia who carried de novo mutations in the retinoic acid receptor beta gene (RARB). RARB is a transcription factor that is activated upon binding to retinoic acid (RA), whose signaling is required for proper development of the brain. Transfection studies indicate that these de novo mutations increase RARB transcriptional activity, suggesting that they confer a gain-of-function (GOF) propriety to the protein. Dystonia is typically explained by some dysfunction of the striatum, a region where RARB is predominantly expressed. Interestingly, loss of Rarb function in mice leads to a reduction of striatonigral neurons and motor abnormalities, suggesting a disruption in early development of striatal circuits. We hypothesized that the motor impairment of patients with RARB GOF mutations is caused by increased RARB signaling in the striatum, possibly disrupting homeostatic control of the same pathways as those affected by decreased Rarb signaling. Using CRISPR-Cas9 technology, we generated mice carrying the mutation p.R394C, which is homologous to the GOF mutation p.R387C found in several patients. These RarbR394C/+ mice show locomotor impairments reminiscent of that of other mouse models of dystonia, along with a decreased striatopallidal neuronal population. Our data suggest that GOF mutations in RARB induce dystonia by disrupting striatal dopaminergic signaling necessary for functional equilibrium. This work might also shed light on common neurodegenerative disorders of the basal ganglia including Huntington’s and Parkinson’s disease, in which RA and RARB signaling appear to be compromised.

Le syndrome d'Evans est défini par l'existence concomitante ou séquentielle de cytopénies auto-immunes, le plus souvent, anémie hémolytique et thrombopénie immunologique. Chez l'enfant, il peut être secondaire à une infection, une maladie auto-immune systémique ou un déficit immunitaire primitif. Alternativement, chez une grande partie des patients, l'étiologie n'est pas clairement identifiée. Les patients atteints de syndrome d'Evans présentent parfois d'autres atteintes, telles une auto-immunité d'organe, une lymphoprolifération bénigne ou un déficit immunitaire. L'objectif de ce travail était d'identifier des causes génétiques chez des enfants présentant un syndrome d'Evans sans étiologie sous-jacente identifiée. Nous avons centré notre étude sur des formes sévères à début pédiatrique en faisant l'hypothèse qu'une maladie monogénique serait plus fréquente dans ce groupe de patients. Nous avons mis à profit les technologies de séquençage haut débit « nouvelle génération » (NGS) pour réaliser et analyser le séquençage de l'exome de patients et de certains de leurs apparentés afin de mettre en évidence des gènes candidats potentiels. Ce travail a permis l'identification de 4 gènes candidats : LRBA, CTLA-4, STAT3 (mutations gain de fonction) et NFKBIA. L'implication des 3 premiers gènes dans de nouvelles maladies monogéniques où l'auto-immunité est au premier plan a été confirmée par d'autres équipes au cours de ce travail. Pour chacun de ces gènes, nous avons poursuivi 2 objectifs complémentaires : d'une part, tenter de valider l'implication des gènes identifiés dans la maladie des patients. Nous avons pour cela utilisé des approches et techniques variées : biochimie et protéomique afin d'identifier des partenaires protéiques, microscopie confocale pour localiser les protéines et leurs interactions, tests cellulaires in vitro pour mettre en évidence un défaut fonctionnel, marquages en cytométrie en flux pour identifier des modifications dans les sous-populations lymphocytaires. D'autre part, nous avons recherché d'autres mutations de ces gènes chez des patients de phénotype clinique similaire. Nous avons ainsi constitué et exploré 3 cohortes de patients présentant des mutations de LRBA, CTLA-4 ou STAT3. Nous avons rassemblé une cohorte de 18 patients porteurs d'une mutation de LRBA, répartis dans 11 familles. Cela nous a permis de préciser et d'étendre le spectre clinique de cette maladie de découverte récente, avec en particulier des atteintes articulaires sévères s'associant à un diabète précoce, ou des entéropathies. Nous avons identifié 15 nouvelles mutations de transmission autosomique récessive dans le gène LRBA, codant une protéine de fonction inconnue dont l'absence entraine une maladie principalement caractérisée par une poly-auto-immunité. Nous avons identifié 29 partenaires protéiques potentiels de LRBA et précisé la localisation de LRBA dans les différents compartiments cellulaires. Nous avons également établi une cohorte de 12 patients dans 10 familles présentant un déficit en CTLA-4 par haplo-insuffisance. Au delà de la mise en évidence de 9 nouvelles mutations, nous avons décrit une famille où la variation est transmise de façon autosomique récessive. Dans les déficits en LRBA et CTLA-4, nous avons mis en évidence une diminution du pourcentage de lymphocytes T régulateurs parmi les PBMC et une diminution de l'expression de CTLA-4 dans les lymphocytes T activés. Ceci corrobore l'interaction entre ces 2 protéines décrite en parallèle par une autre équipe. Nous avons montré que les spectres cliniques des déficits en LRBA et CTLA-4, fortement chevauchant dans les premières descriptions publiées, pourraient se différencier, malgré l'implication des lymphocytes T régulateurs dans ces 2 maladies. (...) / Evans syndrome is defined by the occurence of autoimmune cytopenias, either at the same time or sequential, mainly autoimmune hemolytic anemia and immune thrombocytopenia. In children, it may be secondary to infections, systemic autoimmune disease, or primary immune deficiency, though in most patients, its etiology isn't obvious. Patients affected with Evans syndrome can also present other features, such as autoimmunity toward a particular organ, benign lymphoproliferation or immunodeficiency. The main goal of this work was to identify genetic causes in children presenting an Evans syndrome without a known underlying etiology. We focused our study on severe, early onset forms of the disease, with the hypothesis that a monogenic disease would be more frequent in this group of patients. Taking advantage of high throughput "Next Generation" sequencing (NGS) techniques, we sequenced and analyzed exome from patients and their relatives in search for adequate candidate genes. We identified 4 candidate genes: LRBA, CTLA-4, STAT3 (gain-of-function mutations), and NFKBA. Implication of the first 3 genes in new monogenic diseases with autoimmunity as a key feature was also confirmed by others during the course of this work. For each gene, we pursued 2 complementary goals: First, we sought to validate the implication of the gene in the patients' disease. To do so, we used various techniques and approaches: biochemistry and proteomics to identify protein partners, confocal microscopy to localize proteins and interactions, in vitro cellular assays to bring to light functional defect, flow cytometry to identify changes in lymphocytes subpopulations. We also looked for other mutations of each gene in patients with a similar clinical presentation. Hence we created and explored 3 cohorts of patients presenting with mutations of LRBA, CTLA-4 or STAT3. We constituted a cohort of 18 patients with LRBA mutations within 11 families. We then were able to precise and extend the clinical spectrum of this recently described disease. In particular, we observed patients with severe chronic arthritis associated with diabetes mellitus or enteropathies. We identified 15 new mutations of autosomal recessive transmission in the LRBA gene, coding a protein of unknown function, which absence is responsible for a disease mainly characterized by autoimmune features. We identified 29 candidate protein partners of LRBA and precized LRBA localisation in cell compartiments. We also established a cohort of 12 patients within 10 families presenting CTLA-4 haploinsufficiency. Beyond describing 9 new mutations, we report a family with autosomal recessive transmission.In LRBA and CTLA-4 deficiencies, we showed a decrease of regulatory T lymphocyte subset proportion among PBMC and a decrease of CTLA-4 expression in activated T cells. These results support the interaction between these 2 proteins, described concurrently by another team. We showed that the clinical spectra of these 2 diseases, although widely overlapping in first published reports, could be different despite a role of regulatory T cells in both. Hence, organ-specific autoimmunity and lymphoproliferation are more frequent in LRBA deficiency whereas granuloma and hypogammaglobulinemia are more present in CTLA-4 deficiency. Theses results suggests a role of genetic modifyers, which remain to identify. Among our cohort of patients with Evans syndrome, we also identified 5 patients within 5 families presenting gain-of-function mutations of STAT3. 3 of those mutations were reported by others during our work and appeared de novo in our patients. Functional validation of the 4th one is in progress. The last mutation follows a recessive transmission and could exemplify a new transmission modality of this disease. (...)