In dieser Dissertation wurden murine Aorta-Explantate im experimentellen Ansatz des "Aortic Ring Assay" über elf Tage kultiviert, erstmalig die Differenzierung zu F4/80(+)-Makrophagen gezeigt und eine nahezu vollständige Depletion dieser Zellen durch Clodronat-Liposomen bewirkt. Diese Adventitia-generierten Makrophagen wurden als die Hauptquelle des lokal gebildeten VEGF nachgewiesen. Die daraus resultierende Depletion des parakrin wirkenden VEGF resultierte in einer teilweisen Konservierung der CD34(+) „Vaskulogenen Zone“ der aortalen Adventitia. Zu der Bestätigung dieser Ergebnisse wurde experimentell über den VEGF-Rezeptor-Blocker E7080 in das VEGF-VEGFR-2 System eingegriffen. Die Versuchsansätze mit diesem Rezeptorblocker resultierten in einem ähnlichen Ergebnis wie die Versuche unter Makrophagen-Depletion. / In this dissertation murine aortic explants were cultivated for eleven days, using the method of “Aortic Ring Assay”. For the first time the differentiation to F4/80(+) macrophages and its depletion via clodronate liposomes could be described. These adventitia derived macrophages were identified to be the main source of the local VEGF. The depletion resulted in a lack of paracrine operating VEGF, thus partly preserving the CD34(+) vasculogenic zone within the aortal adventitia. To confirm these findings the VEGF-Receptor was blocked due to the VEGF-Receptor blocker E7080. These experiments resulted in almost the same findings compared to macrophage depletion.

After almost two decades of extensive research, some controversy has remained regarding the self-renewal of resident macrophages of the central nervous system (CNS). Concurrently, the vessel wall has emerged as a potentially ubiquitous niche for stem and progenitor cells, including committed macrophage precursors. It is conceivable that their occurrence in the CNS might explain the brain-resident hematopoietic potential, which has repeatedly been observed but not yet characterized in detail. In this work, the presence of hematopoietic progenitors inside and outside the vessel wall was studied in the adult mouse brain, as well as their possible contribution to the resident macrophage pool. An immunohistological analysis did not corroborate CD45+ SCA-1+ macrophage progenitors, which have been characterized in peripheral arteries, in the circle of Willis. Accordingly, the ex vivo culture of CNS vessels did not provide evidence for de novo formation of macrophages, but for the extensive proliferative capacity of mature cells. However, when analyzing whole brain suspensions in colony-forming unit (CFU) assays, rare Iba1- Cx3cr1- (immature) clonogenic cells were detected, which were enriched at the cerebral surface/meninges and differentiated into macrophages in culture. Intravenous antibody injection and cell sorting confirmed their residence behind the blood-brain barrier. Intriguingly, brain-derived CFUs produced a unique pattern of colony types compared to cells from bone marrow (BM) or blood. Still they displayed the same immunophenotype as BM-resident myeloid progenitors (CD45lo, LIN-, SCA-1-, IL7Rα-, c-KIT+) and could be further stratified into a progenitor hierarchy giving rise to all erythro-myeloid cell types in vitro. This similarity was substantiated by labeling of their progeny in Flt3Cre x Rosa26mT/mG mice, which indicated a descendance from hematopoietic stem cells. While forced repopulation of brain macrophages using the CSF-1R inhibitor PLX5622 did not point to a role of progenitors in in vivo microglia/macrophage maintenance, recent advances in hematology imply that they might be involved in CNS immunosurveillance. In conclusion, though there was no evidence for adventitial macrophage precursors in the CNS, this study confirms the presence of myeloid progenitors in the adult brain and provides the anatomical and phenotypical details necessary to elucidate their relevance in neuroinflammation. / Nach fast zwei Jahrzehnten intensiver Forschung wird der Selbsterhalt residenter Makrophagen im zentralen Nervensystem (ZNS) immer noch kontrovers diskutiert. Gleichzeitig hat sich die Gefäßwand als eine potentiell ubiquitäre Nische für Stamm- und Vorläuferzellen herausgestellt, einschließlich determinierter Vorläufer für Makrophagen. Dass diese auch im ZNS vorhanden sind, könnte die wiederholten Berichte über hämatopoetisches Potenzial im Gehirn erklären, welches bisher nicht genau charakterisiert wurde. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die Existenz hämatopoetischer Vorläuferzellen sowohl innerhalb als auch außerhalb der Gefäßwände des Gehirns erwachsener Mäuse untersucht. Weiterhin wurde deren Beitrag zu residenten Makrophagen-Populationen überprüft. Eine immunhistologische Analyse konnte CD45+ SCA-1+ Makrophagen-Vorläufer, wie sie in peripheren Arterien beschrieben wurden, im Circulus arteriosus Willisii nicht bestätigen. Entsprechend lieferte die Kultur von ZNS-Gefäßen keine Hinweise auf eine Neubildung von Makrophagen, zeigte aber ein hohes Teilungsvermögen reifer Zellen auf. Allerdings wurden in colony-forming unit assays mit Hirnzellsuspensionen seltene Iba1- Cx3cr1- (unreife) klonogene Zellen detektiert, die im Bereich der Hirnhaut angereichert waren und in Kultur zu Makrophagen differenzierten. Eine intravenöse Antikörperinjektion und Zellsortierung belegten, dass sie sich hinter der Blut-Hirn-Schranke befanden. Klonogene Zellen des Hirns erzeugten ein eigentümliches Muster an Kolonietypen, welches sich von dem des Knochenmarks und des Blutes unterschied. Trotzdem glichen sie in ihrem Immunphänotyp myeloiden Vorläuferzellen des Knochenmarks (CD45lo, LIN-, SCA-1-, IL7Rα-, c-KIT+) und konnten weiter in eine Hierarchie von Vorläufern aufgespalten werden, die in vitro alle erythro-myeloiden Zelltypen hervorbrachte. Diese Ähnlichkeit wurde dadurch unterstrichen, dass ihre Nachkommen in Flt3Cre x Rosa26mT/mG Mäusen markiert wurden, was eine Abstammung von hämatopoetischen Stammzellen anzeigte. Während die induzierte Repopulation von Hirn-Makrophagen mit Hilfe des CSF-1R Inhibitors PLX5622 keine Vorläuferbeteiligung beim Erhalt von Mikroglia/Makrophagen in vivo vermuten ließ, deuten neue Erkenntnisse im Bereich der Hämatologie darauf hin, dass die beschriebenen Vorläufer in die immunologische Überwachung des ZNS involviert sein könnten. Wenngleich keine Anhaltspunkte für adventitielle Makrophagen-Vorläufer im ZNS gefunden wurden, bestätigt diese Arbeit die Existenz myeloider Vorläufer im adulten Hirn und liefert notwendige anatomische und phänotypische Informationen, um deren Bedeutung im Rahmen entzündlicher Prozesse des ZNS aufzuklären.

In einem Tiermodell der Multiplen Sklerose (MS), der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), sind Mikroglia als parenchymale ZNS-Makrophagen an der Pathogenese beteiligt. Während der EAE kann eine Expansion dieser Zellen beobachtet werden. Es gibt Hinweise für die Existenz adventitieller Vorläuferzellen, die in der Lage sind, sich in myeloide Zellen zu differenzieren. In der vorliegenden Arbeit wurde dies in der MP4-EAE und in einem Depletionsmodell mittels einem Colony-stimulating-factor-1-R-(Csf1-R)-Inhibitor untersucht. Eine immunhistochemische Analyse zeigte, dass Zellen im Rückenmark im Verlauf der EAE vorhanden sind, die sowohl ein adventitielles Antigen (fetal liver kinase 1, Flk1), als auch Antigene von Mikroglia (ionized calcium-binding adapater molecule 1, Iba1 und F4/80) exprimieren. Es scheint, dass parallel zur Mikrogliaexpansion die Flk1-Expression über die unterschiedlichen Stadien hinweg abnahm. Eine mögliche Interpretation könnte sein, dass sich Flk1+ Zellen im Laufe der EAE zu Mikroglia differenzieren. Mithilfe eines Laminin-Antikörpers konnte gezeigt werden, dass die Gefäßintegrität währenddessen scheinbar intakt blieb. NESTIN (neuroepithelial stem cell protein)+/Iba1+ Zellen im Verlauf der EAE im Parenchym des Rückenmarks könnten auf die Teilung entdifferenzierter ZNS-Makrophagen oder auf die Beteiligung von Perizyten mit myeloidem Differenzierungspotenzial hinweisen. Diese Erkenntnisse lassen vermuten, dass die Mikrogliaexpansion im Rahmen der EAE aus mehreren Quellen gespeist werden könnte. Um dieser Komplexität entgegenzuwirken, wurde die Mikrogliarepopulation in einem Depletionsmodell untersucht. Es ließ sich keine Abnahme der Flk1-Expression bei gleichzeitiger Repopulation feststellen. Die Repopulation Iba1+ Zellen und die allgemeine Zellteilungsaktivität erschienen unabhängig von der Gefäßentfernung. Des Weiteren wurden in der EAE potenzielle meningeale Zellen mit myeloidem Differenzierungspotenzial entdeckt. Abschließend lässt sich vermuten, dass adventitielle Vorläuferzellen für Mikroglia existieren könnten, allerdings könnten diese in unterschiedlichen Milieus unterschiedlich zur Geltung kommen. / In an animal model for multiple sclerosis (MS) - experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) - microglia are involved in the pathogenesis as parenchymal CNS macrophages. An expansion of these cells can be observed during EAE. There is a hint for the existence of adventitial progenitor cells that are able to differentiate into myeloid cells. In the present study, this was investigated in MP4-EAE and in a depletion model with a Csf1-R-(Csf1-R)- inhibitor. Immunohistochemical analysis showed that during EAE, cells are present in the spinal cord that display both an adventitial antigen (fetal liver kinase 1, Flk1) and antigens from microglia (ionized calcium-binding adapater molecule 1, Iba1 and F4/80). It was found that Flk1 expression decreased at different stages in parallel with microglial expansion. A possible interpretation could be that Flk1+ cells differentiate into microglia during the course of EAE. Using a laminin antibody, it was shown that vascular integrity appeared to remain intact during this process. NESTIN (neuroepithelial stem cell protein)+/Iba1+ cells in the spinal cord parenchyma during the course of EAE could indicate the division of end-differentiated CNS macrophages or the involvement of pericytes with myeloid differentiation potential. These findings suggest that the microglia expansion within the EAE could be fed from several sources. To address this complexity, the microglial population was analysed in a depletion model. No decrease in Flk1 expression was observed with simultaneous repopulation. The repopulation of Iba1+ cells and the general cell division activity appeared to be independent of the vessel distance. Furthermore, potential meningeal cells with myeloid differentiation potential were detected in the EAE. In conclusion, it can be surmised that adventitial progenitor cells for microglia may exist, although these may be expressed differently in different milieus.