Die in vitro-Generierung naiver T-Zellen wäre ein wichtiger Fortschritt in der Therapie verschiedenster Erkrankungen mit T-Zelldefizienz (HIV, Immundefekte, Stammzell-transplantierte Patienten). Zur Erreichung dieses Ziels wurden in der vorliegenden Arbeit zwei Teilprojekte bearbeitet: a) die Bestimmung der Frequenz CD34+ Stammzellen in Knochenmark, Nabelschnurblut und Leukapheresat, die über ein bevorzugtes lymphoides Differenzierunspotential verfügen. Desweiteren wurde in diesem Zusammenhang nach zwei Phänotypen spezifischer lymphoider Progenitorpopulationen gesucht: CD34+lin-CD45RAhiCD7+ und CD34+lin- CD10+CD24-. b) die Auswertung von in vitro Zellkulturversuchen, bei denen mit Hilfe einer neuartigen Zellkulturmatrix, eine Generierung naiver T-Zellen aus humanen CD34+ Stammzellen möglich sein soll. Unsere Analysen ergaben, dass die CD34+lin-CD45RAhiCD7+ Progenitorpopulation im Knochenmark und im Leukapheresat zu identifizieren war, im Nabelschnurblut jedoch unter der Nachweisgrenze lag. Ebenso konnte die CD34+lin-CD10+CD24- Progenitorpopulation im Knochenmark, Leukapheresat und Nabelschnurblut gefunden werden, allerdings in deutlich niedrigeren Frequenzen als bislang berichtet. Interessanterweise lag der Anteil Linienmarker-negativer Zellen, d.h. der unreifen Vorläuferzellen, im Knochenmark signifikant höher als im Leukapheresat und Nabelschnurblut. Eine mögliche Erklärung dafür könnte sein, daß ins periphere Blut nur reifere Subpopulationen von Progenitorzellen mobilisiert werden. In den Zellkulturversuchen zeigte sich, daß auch mit Hilfe einer neuartigen 3D- Zellkulturmatrix weder mit humanen Hautfibroblasten noch mit humanen Thymusfragmenten als Stromazellquelle aus CD34+ peripheren Blutstammzellen T-Zellen in vitro generiert werden konnten. Es entstanden vielmehr überwiegend Zellen mit monozytärem Phänotyp, und die CD3+ T- Zellen, die in einigen Versuchen gemessen worden waren, erwiesen sich als Residuen aus dem Thymusgewebe. Diese Ergebnisse stehen somit im Widerspruch zu einer publizierten methodischen Arbeit, die mit murinem Thymusgewebe als Stromazellquelle erfolgreich naive T-Zellen generieren konnte. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass lymphoide Progenitoren in klinischen Routinepräparaten wie Knochenmark oder Leukapheresat in niedriger Frequenz natürlicherweise enthalten sind. Da mit derzeit verfügbaren Kultursystemen die in vitro Generierung reifer T- Zellen schwierig bzw. noch nicht möglich ist, stellt sich die Frage, ob nicht zumindest lymphoide Progenitoren in einem noch weiter zu optimierenden in vitro Zellkultursystem differenziert werden können. Durch Kotransplantation dieser Zellen könnte man die Frequenz der lymphoiden Progenitoren im Blut erhöhen und dadurch die T- Zellregeneration beschleunigen. Dieser Ansatz wird in Nachfolgeexperimenten unserer Arbeitsgruppe weiter verfolgt. / The in vitro generation of naive T cells would be an important progress in the therapy of different illnesses with T cell deficiency (HIV, immunodeficiencies, patients with stem cell transplantations). In order to achieve this goal, two partial projects were processed throughout the present work: a) determination of the frequency CD34+ stem cells in bone marrow, umbilical cord blood, and leukapheresate, which have a preferred lymphoid differentiation potential. Furthermore, in this context, two phenotypes of specific lymphoid progenitor populations were sought after: CD34+lin-CD45RAhiCD7+ and CD34+lin-CD10+CD24-. b) evaluation of in vitro cell culture tests in which a generation of naive T-cells from human CD34+ stem cells is supposed to be possible using a new cell culture matrix. Our analyses revealed that the CD34+lin-CD45RAhiCD7+ progenitor population in the bone marrow and in the leukapheresate could be identified but was under the detection limit in the umbilical cord blood. Likewise, the CD34+lin-CD10+CD24- progenitor population in the bone marrow, the leukapheresate, and the umbilical cord blood could be found, although, in considerably lower frequencies than what has been reported until now. Interestingly, the proportion of lineage marker negative cells, i.e. the immature precursor cells, was significantly higher in the bone marrow than in the leukapheresate and the umbilical blood. One possible explanation for this could be that only more mature subpopulations of progenitor cells are mobilized into the peripheral blood. The cell culture tests demonstrated that, even with the help of a new 3D cell culture mixture, neither human skin fibroblasts nor human thymus fragments as a stromal cell source were able to generate T cells from CD34+ peripheral cells. Rather, predominantly cells with a monocytic phenotype were formed and the CD3+ T cells that had been measured in some tests proved to be residues from the thymus tissue. Thus, these results are contradictory to a published methodical work that successfully generates naive T cells with murine thymus tissue as a stromal cell source. In summary, one can determine that lymphoid progenitors are contained naturally in clinical routine preparations such as bone marrow or leukapheresate in low frequency. As the in vitro generation of mature T cells is difficult / not yet possible using the currently available culture systems, the question arises whether not at least lymphoid progenitors can be differentiated in a still to be optimized in vitro cell culture system. Through co-transplantation of these cells, one could increase the frequency of the lymphoid progenitors in the blood, thus accelerating the T cell regeneration. This approach will be pursued further in follow-up experiments by our work group.

In der vorliegenden Arbeit gelang es die Bedeutung sowie die Aktivierung und Mobilisierung der koronaren Gefäßwand-residenten Stammzellen bei der Angiogenese des Herzgewebes mittels Cardiac Angiogenesis Assay präzise zu charakterisieren und beeinflussende Faktoren zu identifizieren. / In the present work the activation and mobilisation of vascular wall resident stem cells of coronary vessels could be characterised during the angiogenesis of cardiac tissue using the Cardiac Angiogenesis Assay. Moreover influencing factors were identified.

Tumore bestehen nicht nur aus malignen Zellen, sondern ebenfalls aus einer Vielzahl an nicht tumorigenen Zellen, die den Tumor auf vielfältige Weise unterstützen und den Tumor vor therapeutischen Maßnahmen schützen. Die Frage der Herkunft dieser Zellen insbesondere in einem nicht vaskularisierten Tumor ist daher auch für die Entwicklung zukünftiger Therapeutika relevant. In dieser Arbeit wurde eine Methode etabliert, die im dreidimensionalen Raum die Untersuchung des Einflusses von Tumorzellen auf die vaskuläre Adventitia am Model der Mausaorta ermöglicht. Dazu erfolgte die Einbettung von Alginatbeads aus verschiedenen Tumorzelllinien in eine gemeinsame Kollagenmatrix mit murinen Aortenringen. Während des zehntägigem Versuchszeitraums wurde die Aussprossung von Zellen aus den Aortenringen beobachtet und quantifiziert. Es wurde festgestellt, dass die Auswanderung während des Versuchszeitraums zunimmt und dass die Konfrontation mit der Zytokinmischung der Tumorzellen zu einer stärkeren Aussprossung führt, als die Stimulation mit VEGF oder keine Stimulation. Eine gerichtete Auswanderung der Zellen in Richtung der Tumorbeads konnte nicht nachgewiesen bzw. bestätigt werden. Kapilläre Aussprossungen waren nur in geringem Ausmaß zu beobachten. Bei Charakterisierung der ausgewanderten Zellen mittels immunhistochemischer Färbungen waren keine F4/80-positiven und nur einzelne CD34-positive Zellen zu finden. CD31-positive Endothelzellen stellten die Mehrheit der ausgewanderten Zellen bei Tumorzellkonfrontation. Perizyten, die mit dem Marker NG2 gefärbt wurden, stellten eine Mehrheit der migrierten Zellen bei allen Bedingungen. Die in dieser Arbeit etablierte Methode des Aortenring-Bead-Konfrontationsassays ermöglicht es, in Echtzeit den Einfluss von Tumorzellen auf die Gefäßwand im dreidimensionalen Raum zu beobachten. Der Aortenring-Bead-Konfrontationsassay bietet eine Vielzahl an Variationsmöglichkeiten und stellt daher eine vielversprechende Möglichkeit dar, die Lücke zwischen zweidimensionalen in vitro-Experimenten und kostenintensiven in vivo-Versuchen zu schließen. / Tumours do not only consist of malignant cells but also of a multitude of non-tumorigenic cells. They support the tumour in various ways and also protect the tumour from therapeutic measures. Exploring the origin of these cells in particular in a non-vascularized neoplasia is therefore important for the development of new therapeutics. In this work a method was established to study the influence of tumour cells on the vascular adventita of the mouse aorta. A co-cultivation of alginate beads of different tumour cell lines and murine aortic rings in a common collagen matrix was performed. The sprouting of the cells from the aortic ring was observed and quantified during the ten-day experimental period. The sprouting increased during cultivation time and confrontation with the cytokine mixture generated from tumour cells resulted in more sprouting than stimulation with VEGF alone or controls without any stimulation. Directed migration towards the tumour beads was not observed. Only a few capillary outgrowths could be observed. Characterization of the migrated cells by immunohistochemical staining revealed no F4/80-positive and only single CD34-positive cells. The majority of sprouting cells was positive for endothelial cell marker CD31 when confronted with tumour beads. Pericytes, stained with antibodies for NG2 represented the majority of sprouting cells in all conditions performed. The method of aortic ring – bead confrontation developed in this work allows to study the influence of tumour cells on the vascular wall in a three-dimensional space. This method offers several variations. It is a promising opportunity to bridge the gap between two-dimensional in vitro experiments and expensive in vivo studies.

In einem Tiermodell der Multiplen Sklerose (MS), der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), sind Mikroglia als parenchymale ZNS-Makrophagen an der Pathogenese beteiligt. Während der EAE kann eine Expansion dieser Zellen beobachtet werden. Es gibt Hinweise für die Existenz adventitieller Vorläuferzellen, die in der Lage sind, sich in myeloide Zellen zu differenzieren. In der vorliegenden Arbeit wurde dies in der MP4-EAE und in einem Depletionsmodell mittels einem Colony-stimulating-factor-1-R-(Csf1-R)-Inhibitor untersucht. Eine immunhistochemische Analyse zeigte, dass Zellen im Rückenmark im Verlauf der EAE vorhanden sind, die sowohl ein adventitielles Antigen (fetal liver kinase 1, Flk1), als auch Antigene von Mikroglia (ionized calcium-binding adapater molecule 1, Iba1 und F4/80) exprimieren. Es scheint, dass parallel zur Mikrogliaexpansion die Flk1-Expression über die unterschiedlichen Stadien hinweg abnahm. Eine mögliche Interpretation könnte sein, dass sich Flk1+ Zellen im Laufe der EAE zu Mikroglia differenzieren. Mithilfe eines Laminin-Antikörpers konnte gezeigt werden, dass die Gefäßintegrität währenddessen scheinbar intakt blieb. NESTIN (neuroepithelial stem cell protein)+/Iba1+ Zellen im Verlauf der EAE im Parenchym des Rückenmarks könnten auf die Teilung entdifferenzierter ZNS-Makrophagen oder auf die Beteiligung von Perizyten mit myeloidem Differenzierungspotenzial hinweisen. Diese Erkenntnisse lassen vermuten, dass die Mikrogliaexpansion im Rahmen der EAE aus mehreren Quellen gespeist werden könnte. Um dieser Komplexität entgegenzuwirken, wurde die Mikrogliarepopulation in einem Depletionsmodell untersucht. Es ließ sich keine Abnahme der Flk1-Expression bei gleichzeitiger Repopulation feststellen. Die Repopulation Iba1+ Zellen und die allgemeine Zellteilungsaktivität erschienen unabhängig von der Gefäßentfernung. Des Weiteren wurden in der EAE potenzielle meningeale Zellen mit myeloidem Differenzierungspotenzial entdeckt. Abschließend lässt sich vermuten, dass adventitielle Vorläuferzellen für Mikroglia existieren könnten, allerdings könnten diese in unterschiedlichen Milieus unterschiedlich zur Geltung kommen. / In an animal model for multiple sclerosis (MS) - experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) - microglia are involved in the pathogenesis as parenchymal CNS macrophages. An expansion of these cells can be observed during EAE. There is a hint for the existence of adventitial progenitor cells that are able to differentiate into myeloid cells. In the present study, this was investigated in MP4-EAE and in a depletion model with a Csf1-R-(Csf1-R)- inhibitor. Immunohistochemical analysis showed that during EAE, cells are present in the spinal cord that display both an adventitial antigen (fetal liver kinase 1, Flk1) and antigens from microglia (ionized calcium-binding adapater molecule 1, Iba1 and F4/80). It was found that Flk1 expression decreased at different stages in parallel with microglial expansion. A possible interpretation could be that Flk1+ cells differentiate into microglia during the course of EAE. Using a laminin antibody, it was shown that vascular integrity appeared to remain intact during this process. NESTIN (neuroepithelial stem cell protein)+/Iba1+ cells in the spinal cord parenchyma during the course of EAE could indicate the division of end-differentiated CNS macrophages or the involvement of pericytes with myeloid differentiation potential. These findings suggest that the microglia expansion within the EAE could be fed from several sources. To address this complexity, the microglial population was analysed in a depletion model. No decrease in Flk1 expression was observed with simultaneous repopulation. The repopulation of Iba1+ cells and the general cell division activity appeared to be independent of the vessel distance. Furthermore, potential meningeal cells with myeloid differentiation potential were detected in the EAE. In conclusion, it can be surmised that adventitial progenitor cells for microglia may exist, although these may be expressed differently in different milieus.

Die Therapie von Patienten mit fortgeschrittener sensorineuraler Schwerhörigkeit oder Taubheit mit auditorischen Implantaten ist heute Standard in der medizinischen Versorgung. Durch direkte elektrische Stimulation der noch vorhanden auditorischen Neurone wird versucht, die physiologische Informationsübertragung entlang der Hörbahn künstlich nachzubilden. Strukturierte Halbleiterelektrodenträger aus Silizium stellen dabei eine mögliche Alternative zu den herkömmlichen Kabelbündel-Elektrodenträgern heutiger Implantate dar. Durch die Möglichkeit der Abstandsverringerung zwischen Stimulationselektroden und Nervenfasern sowie durch die Möglichkeit der Erhöhung der Anzahl an Stimulationselektroden könnte die Leistungsfähigkeit heutiger Implantate verbessert werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Wachstumsverhalten corticaler neuronaler Vorläuferzellen der Maus auf strukturierten Siliziumhalbleitern zu untersuchen und das Wachstumsverhalten näher zu charakterisieren. Zwei unterschiedliche Oberflä-chenstrukturen wurden durch den Einsatz der Elektronenstrahllithografie auf Silizi-umwafern erzeugt. Zylinder auf der Oberfläche der Halbleiter wurden als Modellstruktur gewählt, um eine erhöhte Anzahl an Elektrodenkontakten zu simulieren und die neuronale Interaktion mit diesen zu untersuchen. Daneben wurden Furchen auf Siliziumoberflächen verwendet, um die Wachstumsrichtung der neuronalen Zellen zu beeinflussen. Die durchgeführten Untersuchungen konnten zeigen, dass strukturierte Halbleiter-elektrodenträger in zukünftigen auditorischen Implantaten grundsätzlich eine Alternative zu den Kabelbündel-Elektrodenträgern heutiger Implantate sein könnten. Durch den Einsatz der Elektronenstrahllithografie konnten Siliziumwafer mit präziser Oberflächenstrukturierung hergestellt werden und deren Biokompatibilität durch Kultivierung neuronaler Zellen gezeigt werden. Die Geometrie der eingeätzten Oberflächenstruktur hatte dabei entscheidenden Einfluss auf das Wachstumsverhalten der Zellen. Während durch Furchen die Orientierung der Neurone gezielt beeinflusst werden konnte und die Neuritenlängen mit zunehmender Ätztiefe abnahmen, konnten derartige Effekte bei den untersuchten Zylindern nicht beobachtet werden. Die durchgeführten rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen gaben Auf-schluss über die Interaktion der Neurite mit der Oberflächenstruktur. Auf vertikalen Wachstumsstress reagierten die kortikalen neuronalen Vorläuferzellen unabhängig von der Oberflächenstruktur mit der Ausbildung von neuronalen Brücken. Der Modus der Brückenbildung war bei beiden Strukturen dabei gleich, jedoch wurden unterschiedliche Verankerungspunkte an der Siliziumoberfläche beobachtet. Darüber hinaus konnte durch Echtzeituntersuchungen an lebenden Zellen gezeigt werden, dass diese während des Wachstums ihre Lage verändern konnten und somit nicht dauerhaft mit der Oberfläche verbunden waren. Die Ergebnisse zeigen, dass die beiden untersuchten Oberflächenstrukturen grundsätzlich für den Einsatz auf zukünftigen Halbleiterelektrodenträgern geeignet sind, jedoch noch weiterführende Untersuchungen nötig sind, um diese weiter zu optimieren. / The treatment of patients with advanced sensorineural hearing loss or deafness with auditory implants is standard in health care today. Structured silicon semiconductors could be an alternative to the conventional wire-bundle-electrodes of today's implants. The possibility of reducing the distance between stimulation electrodes and nerve fibers as well as the possibility of increasing the number of stimulation electrodes could improve the performance of today's implants. Aim of the present study was to investigate the growth behavior of cortical neuronal precursor cells of the mouse on structured silicon semiconductors and to characterize the growth behavior. Two different surface structures were created on silicon semiconductors through the use of electron beam lithography. Cylinders on the surface of the semiconductors were chosen as model structure for an increased number of electrode contacts. In addition, grooves on Silicon surfaces were used to influence the direction of the axonal outgrowth. The investigations showed that structured semiconductors basically could be an alternative to the cable-bundle-electrodes of today's implants. The geometry of the surface structure had decisive influence on the growth behavior of cells. While the orientation of the neurons could be influenced by grooves and the axon lengths with etching depth declined, such effects were not observed at the cylinders. Investigations on the scanning electron microscope showed the interaction of the axons with the surface structure. The neuronal precursor cells responded to vertical growth stress regardless of the surface structure with the formation of neural bridges. The mode of bridging was basically equal on both surfaces, but different anchor points on the silicon surface were observed. In real time studies on living cells the dynamic of neuronal growth was investigated. The Observation shoes, that neurons could change their position during growth and that they were not permanently connected to the surface. The results shows that the two observed semiconductor surfaces are generally suitable for the use in auditory implants. Further investigations should follow to optimize the surface structures for future implants.

The goal of the project VascuBone is to develop a tool box for bone regeneration, which on one hand fulfills basic requirements (e.g. biocompatibility, properties of the surface, strength of the biomaterials) and on the other hand is freely combinable with what is needed in the respective patient's situation. The tool box will include a variation of biocompatible biomaterials and cell types, FDA-approved growth factors, material modification technologies, simulation and analytical tools like molecular imaging-based in vivo diagnostics, which can be combined for the specific medical need. This tool box will be used to develop translational approaches for regenerative therapies of different types of bone defects. This project receives funding from the European Union's Seventh Framework Program (VascuBone 2010). The present study is embedded into this EU project. The intention of this study is to assess the changes of the global gene expression patterns of endothelial progenitor cells (EPCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) after direct cell-cell contact as well as the influence of conditioned medium gained from MSCs on EPCs and vice versa. EPCs play an important role in postnatal vasculogenesis. An intact blood vessel system is crucial for all tissues, including bone. Latest findings in the field of bone fracture healing and repair by the use of tissue engineering constructs seeded with MSCs raised the idea of combining MSCs and EPCs to enhance vascularization and therefore support survival of the newly built bone tissue. RNA samples from both experimental set ups were hybridized on Affymetrix GeneChips® HG-U133 Plus 2.0 and analyzed by microarray technology. Bioinformatic analysis was applied to the microarray data and verified by RT-PCR. This study gives detailed information on how EPCs and MSCs communicate with each other and therefore gives insights into the signaling pathways of the musculoskeletal system. These insights will be the base for further functional studies on protein level for the purpose of tissue regeneration. A better understanding of the cell communication of MSCs and EPCs and subsequently the targeting of relevant factors opens a variety of new opportunities, especially in the field of tissue engineering. The second part of the present work was to develop an ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) for a target protein from the lists of differentially expressed genes revealed by the microarray analysis. This project was in cooperation with Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany. The development of the ELISA aimed to have an in vitro diagnostic tool to monitor e.g. the quality of cell seeded tissue engineering constructs. The target protein chosen from the lists was klotho. Klotho seemed to be a very promising candidate since it is described in the literature as anti-aging protein. Furthermore, studies with klotho knock-out mice showed that these animals suffered from several age-related diseases e.g. osteoporosis and atherosclerosis. As a co-receptor for FGF23, klotho plays an important role in bone metabolism. The present study will be the first one to show that klotho is up-regulated in EPCs after direct cell-cell contact with MSCs. The development of an assay with a high sensitivity on one hand and the capacity to differentiate between secreted and shedded klotho on the other hand will allow further functional studies of this protein and offers a new opportunity in medical diagnostics especially in the field of metabolic bone disease. / Das Ziel des durch die europäische Union geförderten Projekts VascuBone ist die Entwicklung einer tool box zur Knochenregeneration, die einerseits sämtliche Grundanforderungen erfüllt, beispielsweise an die Biokompatibilität, Oberflächenbeschaffenheit und Robustheit der Biomaterialien, und andererseits frei an den Bedarf der individuellen Patientensituation angepasst werden kann. Sie beinhaltet unterschiedlichste biokompatible Materialien und Zelltypen, FDA-zugelassene Wachstumsfaktoren, materialmodifizierende Technologien sowie Simulations- und analytische Werkzeuge, wie die auf molekularer Bildgebung basierende in-vivo-Diagnostik (MRI und PET/CT), die für den spezifischen medizinischen Bedarf kombiniert werden können. Die tool box wird für die Entwicklung translationaler Ansätze in der regenerativen Medizin für unterschiedliche Arten von Knochendefekten verwendet (VascuBone 2010). Eingebettet in dieses EU-Projekt sollten in der vorliegenden Arbeit die molekularen Grundlagen und Änderungen der globalen Genexpressionsmuster von endothelialen Vorläuferzellen (EPCs) und mesenchymalen Stammzellen (MSCs) nach direktem Zell-Zell-Kontakt sowie nach Gabe von konditioniertem Medium untersucht werden. EPCs spielen eine wichtige Rolle in der postnatalen Vaskulogenese. Ein intaktes Blutgefäßsystem ist überlebensnotwendig für alle Gewebe, einschließlich Knochen. Neueste Erkenntnisse in der Knochenheilung und -regeneration durch die Nutzung von Tissue-Engineering-Konstrukten, die mit MSCs besiedelt wurden, förderten die Idee, MSCs und EPCs zu kombinieren, um die Vaskularisierung – und somit das Überleben – des neu gebildeten Knochengewebes zu begünstigen. Die RNA-Proben aus beiden Versuchsansätzen wurden für die Microarray-Analysen auf Affymetrix GeneChips® HG-U133 Plus 2.0 hybridisiert. Die Array-Daten wurden bioinformatisch ausgewertet und mittels RT-PCR verifiziert. Die vorliegende Arbeit gibt detailliert Aufschluss darüber, wie MSCs und EPCs miteinander kommunizieren, und erlaubt somit wichtige Einblicke in Signalwege des muskuloskelettalen Systems. Dies wiederum ermöglicht weitere funktionelle Studien auf Proteinebene zum Zwecke der Geweberegeneration. Das bessere Verständnis der Zellkommunikation zwischen MSCs und EPCs und somit die gezielte Adressierung von relevanten Faktoren eröffnet völlig neue Möglichkeiten in der klinischen Anwendung, insbesondere im Bereich Tissue Engineering. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte in Kooperation mit der Firma Immundiagnostik AG, Bensheim, ein ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) aufgebaut werden. Ziel war es, für ein geeignetes Protein aus den zu erwartenden Listen regulierter Gene ein in-vitro-diagnostisches Nachweisverfahren zu entwickeln, das ggf. später als Qualitätsnachweis für erfolgreich besiedelte Tissue-Engineering-Konstrukte herangezogen werden könnte. Als geeigneter Kandidat wurde Klotho ausgewählt. Klotho gilt als anti-aging-Protein, da Klotho-knock-out-Mäuse alle alterstypischen Erkrankungen wie Osteoporose oder Arteriosklerose zeigen. Als Co-Rezeptor für FGF23 spielt Klotho außerdem eine wichtige Rolle im Knochenstoffwechsel. Diese Studie ist die erste, die zeigt, dass in EPCs nach direktem Zell-Zell-Kontakt mit MSCs Klotho hochreguliert wird. Die Entwicklung eines sensitiven und differenzierten Nachweises von sezerniertem Klotho sowie der von der Membran proteolytisch abgespaltenen Form von Klotho, eröffnet völlig neue Möglichkeiten in der klinischen Diagnostik, insbesondere im Bereich der Knochenstoffwechselerkrankungen

Die Neubildung von Neuronen persistiert lebenslang in der Subgranularzellschicht des Hippocampus und der Subventrikularzone des Großhirns und wird als adulte Neuroge-nese bezeichnet. Es wird vermutet, dass diese beim erwachsenen Menschen einen rele-vanten Einfluss auf degenerative Veränderungen, verschiedene neurologische Krank-heitsbilder und auf die (Dys-)Funktion des Gedächtnisses hat. Im Tiermodell wurde eine Verringerung der Neurogenese nach chronischer Morphingabe nachgewiesen. Vorarbeiten zeigten einen Zusammenhang zwischen chronischem Heroinmissbrauch und reaktiver Astrogliose, Mikrogliose und einer vermehrten Expression des polysialylated neural cell adhesion molecule im humanen Hippocampus. Daraus leitet sich die Hypothese ab, dass chronischer Heroinmissbrauch, als Modell für eine Abhängigkeitserkrankung, einen Einfluss auf die adulte humane Neurogenese hat. Es wurden in Formalin fixierte Gewebeproben aus dem Hippocampus von Verstorbenen mit einer letalen Heroinintoxikation und mit bekanntem Heroinmissbrauch (n = 20) un-tersucht und mit einer nach Alter und Geschlecht angepassten Kontrollgruppe (n = 28) verglichen. Hierbei wurden spezifische Neurogenesemarker mittels immunhistochemi-scher Methoden angewendet und ausgewertet. Es bestand eine generell sehr geringe zelluläre Proliferationsrate und eine signifikante Reduktion Musashi-1 positiver neuro-naler Vorläuferzellen bei gleichzeitig unveränderter Anzahl Nestin positiver reifender und Calretinin positiver migrierender postmitotischer Neurone. Zudem wurde ein ver-ändertes Calretinin-Expressionsmuster als Hinweis auf eventuelle funktionelle neuronale Defizite bei Drogenabhängigen festgestellt. Der potentielle Einfluss von chronischem Heroinmissbrauch auf die adulte humane Neurogenese wird erstmals gezeigt. Die Ergebnisse weisen auf eine negative Beeinflus-sung im Stadium neuronaler Vorläuferzellen und der Zellfunktion migrierender Neurone in der Fallgruppe im Vergleich zu einer gesunden Kontrollgruppe hin. Diese Hemmung der Neurogenese könnte eine Erklärungsmöglichkeit für kognitive Defizite und Funktionsstörungen des Gedächtnisses infolge chronischen Drogenkonsums bieten und zugleich eine Bedeutung bei der Entstehung von Abhängigkeitserkrankungen haben. Insofern könnte sich hier ein Ansatzpunkt für zukünftige Therapiestrategien derartiger Erkrankungen oder ihrer Folgen bieten.

Die Neubildung von Neuronen persistiert lebenslang in der Subgranularzellschicht des Hippocampus und der Subventrikularzone des Großhirns und wird als adulte Neuroge-nese bezeichnet. Es wird vermutet, dass diese beim erwachsenen Menschen einen rele-vanten Einfluss auf degenerative Veränderungen, verschiedene neurologische Krank-heitsbilder und auf die (Dys-)Funktion des Gedächtnisses hat. Im Tiermodell wurde eine Verringerung der Neurogenese nach chronischer Morphingabe nachgewiesen. Vorarbeiten zeigten einen Zusammenhang zwischen chronischem Heroinmissbrauch und reaktiver Astrogliose, Mikrogliose und einer vermehrten Expression des polysialylated neural cell adhesion molecule im humanen Hippocampus. Daraus leitet sich die Hypothese ab, dass chronischer Heroinmissbrauch, als Modell für eine Abhängigkeitserkrankung, einen Einfluss auf die adulte humane Neurogenese hat. Es wurden in Formalin fixierte Gewebeproben aus dem Hippocampus von Verstorbenen mit einer letalen Heroinintoxikation und mit bekanntem Heroinmissbrauch (n = 20) un-tersucht und mit einer nach Alter und Geschlecht angepassten Kontrollgruppe (n = 28) verglichen. Hierbei wurden spezifische Neurogenesemarker mittels immunhistochemi-scher Methoden angewendet und ausgewertet. Es bestand eine generell sehr geringe zelluläre Proliferationsrate und eine signifikante Reduktion Musashi-1 positiver neuro-naler Vorläuferzellen bei gleichzeitig unveränderter Anzahl Nestin positiver reifender und Calretinin positiver migrierender postmitotischer Neurone. Zudem wurde ein ver-ändertes Calretinin-Expressionsmuster als Hinweis auf eventuelle funktionelle neuronale Defizite bei Drogenabhängigen festgestellt. Der potentielle Einfluss von chronischem Heroinmissbrauch auf die adulte humane Neurogenese wird erstmals gezeigt. Die Ergebnisse weisen auf eine negative Beeinflus-sung im Stadium neuronaler Vorläuferzellen und der Zellfunktion migrierender Neurone in der Fallgruppe im Vergleich zu einer gesunden Kontrollgruppe hin. Diese Hemmung der Neurogenese könnte eine Erklärungsmöglichkeit für kognitive Defizite und Funktionsstörungen des Gedächtnisses infolge chronischen Drogenkonsums bieten und zugleich eine Bedeutung bei der Entstehung von Abhängigkeitserkrankungen haben. Insofern könnte sich hier ein Ansatzpunkt für zukünftige Therapiestrategien derartiger Erkrankungen oder ihrer Folgen bieten.:I. Inhaltsverzeichnis 1 II. Bibliografische Zusammenfassung 2 III. Abkürzungsverzeichnis 3 1. Einführung 4 1.1. Drogenabhängigkeit und Epidemiologie 4 1.2. Heroin 6 1.3. Hippocampus 9 1.4. Adulte Neurogenese 11 1.5. Aufgabenstellung und Ziel der Arbeit 14 2. Materialen und Methoden 18 2.1. Fall- und Kontrollgruppe 18 2.2. Toxikologisch-chemische Untersuchungen 20 2.3. Immunhistochemie 21 2.4. Immunfluoreszenz und konfokale Mikroskopie 25 2.5. Quantifizierung, Datenanalyse und Statistik 26 3. Ergebnisse 28 3.1. Deskriptive Datenanalyse 28 3.2. Musashi-1 30 3.3. Nestin 31 3.4. Calretinin 32 3.5. Ki-67 34 3.6. Doublecortin 35 3.7. Doppelimmunfluoreszenz 36 4. Diskussion 37 4.1. Neurogenese – Proliferation (Ki-67) 38 4.2. Neurogenese – Differenzierung (MSI-1, Nestin) 39 4.3. Neurogenese – Reifung (Calretinin) 42 4.4. Methodische Grenzen und Fehlerbetrachtung 43 4.5. Fazit und Ausblick 46 5. Zusammenfassung der Arbeit 48 6. Literaturverzeichnis 52 7. Anlagen 1-8 65 IV. Selbständigkeitserklärung 73 V. Curriculum vitae 74 VI. Publikationen 75 VII. Danksagung 76

Mammals cannot re-form heavily damaged bones as in large fracture gaps, whereas zebrafish efficiently regenerate bones even after amputation of appendages. However, the source of osteoblasts that mediate appendage regeneration is controversial. Several studies in zebrafish have shown that osteoblasts are generated by dedifferentiation of existing osteoblasts at injured sites, but other observations suggest that de novo production of osteoblasts also occurs. In this study, we found from cell-lineage tracing and ablation experiments that a group of cells reserved in niches serves as osteoblast progenitor cells (OPCs) and has a significant role in fin ray regeneration. Besides regeneration, OPCs also supply osteoblasts for normal bone maintenance. We further showed that OPCs are derived from embryonic somites, as is the case with embryonic osteoblasts, and are replenished from mesenchymal precursors in adult zebrafish. Our findings reveal that reserved progenitors are a significant and complementary source of osteoblasts for zebrafish bone regeneration.

Die Entwicklung komplexer Verhaltensweisen, welche das Entstehen von Kultur, Wissenschaft, Kunst und Literatur ermöglichten, wurden mit der Expansion des Neokortex im Laufe der menschlichen Evolution in Verbindung gebracht. Unterschiede in der Neuronenanzahl von Säugetieren sowie die einzigartige Intelligenz des Menschen wurden mit dieser Expansion assoziiert. Es gibt Hinweise darauf, dass Variationen in der Neuronenanzahl von Säugetieren durch Unterschiede in der proliferativen Kapazität von neuralen Vorläuferzellen (engl. NPCs) widergespiegelt werden. Daher kann die Untersuchung der Mechanismen, welche die Proliferation von NPCs fördern, dazu beitragen, die Expansion des menschlichen Neokortex besser zu verstehen. Differenzen in der proliferativen Kapazität von NPCs zwischen den Säugetierarten wurden mit dem Auftreten genetischer Neuheiten während der Evolution in Verbindung gebracht. Mehrere spezifisch menschliche Gene wurden als treibende Kräfte der Expansion des menschlichen Neokortex identifiziert. Dennoch wurde die Mehrheit der Veränderungen im menschlichen Genom in nicht-kodierenden Bereichen beschrieben, was darauf hindeutet, dass Veränderungen der Genregulations-Sequenzen sowie deren Auswirkung auf das Genexpressions-Muster an der Expansion des menschlichen Neokortex beteiligt sein könnten. Der transkriptomische Vergleich zwischen sich entwickelnden Gehirnen von Maus, einer Spezies mit kleinem Gehirn, und Mensch hat die Bedeutung der extrazellulären Nische während der Gehirnentwicklung hervorgehoben. Dennoch wurden Studien der Genregulations-Mechanismen von differentiell exprimierten Genen (engl. DEG), die mit der extrazellulären Nische in Verbindung gebracht werden, noch nicht beschrieben. In dieser Arbeit wurde nach DEG zwischen sich entwickelndem Neokortex von Maus und Mensch gesucht und drei Kandidatengene, namentlich Acan, Lamc2 und Ereg, auf Grund ihrer Assoziation mit der extrazellulären Nische, ausgewählt. Die Gene Acan und Lamc2 kodieren für zwei Proteine der extrazellulären Matrix (engl. ECM), AGGRECAN und die Gamma-2- Untereinheit von LAMININ-5, während Ereg für den Wachstumsfaktor EPIREGULIN kodiert. Für alle drei Gene ist die Expression während der menschlichen, aber nicht der murinen Gehirnentwicklung vorhanden. In dieser Studie wurden alle drei Proteine, AGGRECAN, LAMININ-5 und EPIREGULIN, untersucht, um ihre Rolle bei der Proliferation von NPCs zu bestimmen. Allerdings zeigte nur EPIREGULIN, dass es die Proliferation von NPCs durch den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (engl. EGFR) im sich entwickelnden Neokortex der Maus förderte. Zusätzlich zeigte die Ablation von EREG in menschlichen kortikalen Organoiden eine Verringerung der NPC-Proliferation und der Neuronenbildung. Interessanterweise förderte EPIREGULIN die Proliferation von NPCs in Gorilla-, nicht aber in menschlichen kortikalen Organoiden. Schließlich identifizierten wir potenzielle Enhancer-Regionen in der Nähe des menschlichen EREG-Gens, die an der Regulation der EREG-Expression während der Neokortexentwicklung beteiligt sein könnten. Zusammenfassend legt diese Studie nahe, dass inter-spezies Unterschiede in der EREG-Expression, vermittelt durch Chromatin-Regulation, die Proliferation von NPCs während der Gehirnentwicklung fördern könnte, was zu einer erhöhten Neuronenbildung und zur Expansion des Neokortex beitragen haben könnte.