This thesis is based on a genomic study of the epithelial fusion and wound healing processes using Drosophila melanogaster as a model system. The aimed of the work is to study the genomic differences between cells actively involved in wound healing and neighboring cells not actively involved in wound healing. To achieve this objective we standardized a new system to culture imaginal discs in vitro. This new system that is healing permissive recapitulate the entire wound healing processes. Using the line pucE69-A-Gal4/UAS-GFP, which express puc-GFP in the leading edge cells of the wound, a large amount of cells actively involved in healing (puc-GFP positives) and their neighboring cells (puc-GFP negatives) were sorted. RNA from the different cells populations were extracted and hybridized to affymetrix chips. The obtained data were further analyzed using different statistical analyses. Finally, 302 genes appeared upregulated and 209 genes were downregulated with a fold chage higher and lower of 2 and -2 respectively. However, during the normal development of imaginal discs, puc-GFP is not only express in cells involved in healing, it is also present in cells of the stalk and the peripodial sheet of the disc. This cells that also express puc-GFP are not involved in the wound healing process and could lead to contamination. To solve this problem a second analysis including wounded and not wounded discs were performed. Dual statistical analyses allow us to identify three different subpopulation: dw1_dnw1_dd1 subpopulation, in which genes appear modified not only in wounded discs but also in unwounded discs, but differentially; dw1_dnw0_dd1 subpopulation, in which genes appear modified only in wounded dicsc; dw0_dnw1_dd1 subpopulation, in which genes appear modified only in unwounded discs. Gene ontology (GO) analyses were done for those genes that were modified during wound healing showing overrepresented categories during wound healing (for example genes related to actin regulation, immune response, cells movements, of transduction factors). To investigate the potential role of selected genes in wound healing, we aimed to employ an in vivo healing model using the Gal4-UAS system. Different Gal4 drivers were used to interfere with the expression of those genes upregulated in “healing” cells (UAS-RNAi lines) and to reload back by overexpression those genes downregulated (UAS lines). To test all these lines in the wound healing model is an enormous task that would take long time, for that reason we decided to perform a previous analysis of their functionality in a heterologous morphogenetic epithelial model (similar to wound healing), the thorax fusion. In brief, 89 UAS-RNAi lines (43 % of those tested) corresponding to 54 genes (44 %) displayed thorax closure phenotypes ranging from weak cleft to embryonic lethality. For the UAS construct, 18 of them (42 %) corresponding to 11 genes (44%) also lead to thorax fusion defects. Once identified a set of genes whose overexpression or interference elicit defects in thorax closure and may have a role in wound healing, a secondary screen employing an imaginal disc healing assay was performed for those lines that produces stronger phenotypes during thorax closure. In summary, downregulation of different genes that appear modified during healing by RNAi overexpression has leaded us to identify new genes necessaries for a proper closure completion. Fundamental processes for wound healing are affected, like actin accumulation in leading edge cells, peripodial epithilia movement, or tissue relaxation. The aimed of this project was not only to generate a comprehensive database of those genes whose expression is altered during wound repair in Drosophila, but also identify genes and highly conserved pathways which are likely to be of crucial importance for wound healing by comparing our data to those obtained in vertebrates healing model systems. We set up a collaborative project with a series of groups performing transcriptional analysis in humans and mice in order to identify those genes conserved through the phylogeny. After a comparative study to identify Drosophila homologues for those genes that appear modified in vertebrates functional analysis were done in vertebrates using a scratch assay and in Drosophila using the Gal4-UAS system. These genes, functionally relevant in healing models across phylogeny constitute potential candidates for deep translational studies. / Esta tesis se basa en el estudio de los procesos morfogenéticos de fusión de epitelios y cicatrización utilizando Drosophila melanogaster como organismo modelo. Ya que esta tesis se basa en un análisis por microarray de las células involucradas activamente en el proceso de cicatrización en comparación con aquellas células vecinas no implicadas activamente en dicho proceso, se estandarizó un nuevo sistema para cultivar discos imaginales in vitro. Gracias a este sistema, que recapitula todos los procesos que ocurren durante la cicatrización, se pudieron aislar una gran cantidad de tanto de células activamente involucradas en la cicatrización (puc-GFP positivas) como de sus vecinas no involucradas (puc-GFP negativas). Una vez obtenidas las distintas poblaciones celulares se realizaron las extracciones de RNA y posteriores hibridaciones en chip de Affymetrix. Los datos obtenidos se analizaron mediante diferentes estudios estadísticos, resaltando 302 genes regulados positivamente y 209 genes regulados negativamente con un fold change por encima o por debajo de 2 y -2 respectivamente. También se realizaron análisis de la ontología génica (GO) de los genes que aparecían modificados, lo que nos permitió ver que categorías génicas aparecían mas representadas (como por ejemplo genes implicados en la regulación de la actina, la respuesta inmune, el movimiento celular o factores de activación de la transducción). Una vez realizados los análisis estadísticos se procedió al análisis funcional de aquellos genes que aparecían modificados. Ya que realizar un cribado en cicatrización era un proceso largo y tedioso se decidió hacer un cribado previo utilizando el modelo de fusión del tórax. Para ello se sobreexpresaron RNA de interferencia mediante un driver que digiere su expresión a la zona dorsal del tórax. Se testaron 206 líneas UAS-RNAi para disminuir la expresión de 123 genes y 21 líneas UAS para sobreexpresar aquellos genes que aparecían regulados negativamente. De estos 89 líneas UAS-RNAi (43 % de los testados) correspondiente a 54 genes (44 %) y 18 líneas UAS (42 %) correspondientes a 11 genes (44%) presentaban problemas de fusión de tórax. Aquellos genes que producían fenotipos mas fuertes estaban relacionados con factores de transcripción, con la regulación de la actina o las adhesiones celulares (esperable ya que ya se ha descrito previamente la importancia de estos factores durante la cicatrización), y de forma preliminar, fueron estudiados durante el proceso de cicatrización, identificando nuevos genes implicados en el mismo.

Tesi realitzada al Centre de Recerca en Agrigenòmica (CRAG) / The general objective of this PhD thesis is to investigate the mechanistic bases for plant hormones Brassinosteroids (BRs) action in plant vascular development. To this end, we have used a multidisciplinary approach by combining mathematical modeling with exhaustive analysis of the BRs mutants vascular phenotypes. Furthermore, high throughput proteomic techniques with accurate confocal microscopy to identify new components of the BR signaling pathway with cellular resolution have been performed. Our work describes for the first time the composition of BRI1 and BRL3 receptor protein complexes in Arabidopsis. These results represent a conceptual advance for the molecular understanding of BR signaling pathway in plant development, as disclose several key points beyond the current state of the art. Despite their cellular specificity and their role as functional BR receptors the study of BRL receptors has been neglected and no reports have been published on them. Several barriers may have hampered the study of BRL pathways in the plant. Despite BRL being functional BR receptors, obstacles in: (i) the visualization of vascular inner tissues, (ii) the biological variability that exists within the shoot stem vasculature where BRL proteins are localised, and (iii) the lack of an apparent phenotype for the brl mutants, altogether might have hampered the study of these receptors. This PhD thesis challenges the study of the functional role of BRL receptors by using multidisciplinary approaches ranging from systems biology to quantitative biochemistry and high-resolution microscopy. The purification and identification of BRL3-receptor protein complex has permitted to assign a specific role for BRL3 receptor in planta, independently from the BRI1 main receptor (also reported in this study). To better understand the function of the BRL receptors in planta and to investigate novel BR specific functions in distinct cell-types, we have carried different approaches: 1. Investigate the contribution of BRs to the vascular development in the shoot of Arabidopsis plants by comprehensive phenotypic analysis of vascular-patterning defects in BR-signaling and synthesis mutants. 2. Biochemical characterization of BRI1 and BRL3 signalosome complexes by MS- analysis. 3. Functional characterization of BRL3 signalosome in plant growth and development by genetic analysis of candidate interactors identified by MS analysis. First, a role for BRs in regulating vascular development in the shoot inflorescence stem of Arabidopsis has been demonstrated. Based on our experimental results, mathematical modeling (in collaboration with Physicists at the group of Dr. Ibañes, UB) was mutually beneficial to jointly establish the role of auxin in plant vascular patterning. Our initial experimental approach accounted for exhaustive analysis of BRs mutants while did not concern auxin hormone action. Through computational and modeling predictions, it was found that BRs alone were not sufficient to create the VB patterning, suggesting the requirement of auxin transport for the VB formation. Thus, our results unveil coordinated roles for auxin and BRs in establishing the vascular patterning within Arabidopsis shoots. Second, experimental evidence for two different BR perception complexes, BRI1 and BRL3 complexes, operating at distinct and specific cell types is provided. Several BRI1 interactors and downstream signaling components have been identified by extensive proteomic studies while no evidence for the composition of the native BRI1 receptor complex has been reported. Additionally, BRL receptors have been described to be active BR receptors that play specific roles in Arabidopsis yet no study on BRL receptor complexes composition nor downstream signaling components has been shown. Here we disclose the composition of both BRI1 and BRL3 receptor complexes providing novel candidate interactors and components to the BR signaling field. Of note, identification of the BRL3 receptor complex composition in combination with high-resolution microscopy and genetic analysis reveals a novel function for BAK1 and BRL1 proteins through interaction with BRL3 in BR-mediated root development. Collectively, these results highlight the power of using multidisciplinary approaches for the study of signaling pathways within specific cellular domains in the plant. / Aquesta tesis doctoral té com a objectiu principal investigar noves funcions de les hormones vegetals esteroides, Brassinoesteroides (BRs), en el desenvolupament del teixit vascular de la planta. Per tal d’assolir aquest objectiu hem utilitzat una aproximació multidisciplinària, combinant models matemàtics i computacionals amb anàlisis exhaustius dels fenotips vasculars de plantes mutants en BRs, en la planta model Arabidopsis thaliana . A més, hem combinat tècniques de proteòmica amb microscopia confocal, amb l’objectiu d’identificar nous components de senyalització de BRs amb una resolució cel•lular. Els nostres resultats indiquen l’inici d’una ruta alternativa a la visió clàssica de la ruta de senyalització dels BRs descrita fins al moment. Tot i que els principals components del senyal ja han estat identificats pel seu homòleg més pròxim, el receptor BRI1, els complexes de BRL1 i BRL3 juntament amb els candidats co-receptors així com els components de la ruta de senyalització encara no s’han descrit. Per tal d’entendre millor la funció d’aquests receptors de BRs i d’investigar funcions de BRs específiques pels diferents tipus cel•lulars, vam plantejar diferents aproximacions: 1. Estudi de la contribució dels Brassinoesteroides en la formació del patró vascular de la tija d’Arabidopsis 2. Identificació de nous components de senyalització del receptor BRL3, involucrats en la regulació del desenvolupament vascular. 3. Caracterització funcional del signalosoma de BRL3 en el creixement i en el desenvolupament de la planta. Aquest estudi demostra que el transport polar de l’auxina i la senyalització de BRs determinen el patró radial dels feixos vasculars de la tija principal de les plantes d’Arabidopsis. Les nostes dades experimentals juntament amb l’elaboració d’un nou model matemàtic ens va permetre entendre com s’elabora el patró radial de la tija d’Arabidopsis, i els resultats es van publicar a la revista PNAS (Ibañes et al., 2009). A més, el nostre estudi demostra la formació de complexes receptors de BRs específics de tipus cel•lular, els quals participen en diferents activitats cel•lulars durant el creixement i desenvolupament de l’arrel. També revela funcions noves i específiques per a la senyalització de BRs a través dels receptor BRL3 en el nínxol de cèl•lules mare de l'arrel d'Arabidopsis.

Osteoporosis is a systemic skeletal disorder and the most common metabolic bone disease. It is recognized as one of the most prevalent problems facing postmenopausal women in western society. The World Health Organization definition of osteoporosis uses bone mineral density (BMD) measurements as the gold standard. The genetic complexity of BMD is incompletely defined. Bone turnover, also called bone remodelling, is a lifelong process that refers to the entire cycle of bone resorption and formation, which determines BMD. In general, the cell biology of an adult bone includes 3 cell types, among others, that have opposite functions: osteoblasts produce the extracellular matrix that becomes mineralized; osteoclasts are responsible for the resorptive actions; and osteocytes are involved in the regulation of both resorption and formation (and are even claimed to dominate the process). A complex signal system between these 3 cell types balances their activities to avoid any over-creation or loss of bone tissue. The bone remodelling equilibrium is in part dominated by a set of protein reactions known as the RANK/RANKL/OPG system. The special importance of the Receptor Activator of NF-kappa-B (RANK) and its interaction with its ligand (RANKL) is that the RANK/RANKL complex is one of the main triggers of osteoclast differentiation and survival. Hence, in-depth analysis of variants in these 2 genes may contribute to the understanding of the genetics of BMD. This study had 4 main objectives: (1) association analysis of putative functional SNPs in evolutionary conserved regions of the RANK and RANKL genes with BMD and the occurrence of fractures in our cohort (BARCOS). (2) Replication of previously associated SNPs, in the BARCOS cohort (3) In-silico study followed by in-vitro functional experiments of the BMD-associated SNP(s) in order to reveal its (their) role(s) in the pathological process of osteoporosis and (4) Characterization of the human RANKL promoter and regulatory regions in-silico and in-vitro. We replicated the association of SNP rs9594738, a genetic variant at 184 kb upstream to RANKL gene, with BMD. Statistical analysis for other SNPs in the RANKL gene failed to be associated with osteoporotic phenotypes. The functional experiments’ results demonstrate that this region surrounding rs9594738, between AKAP11 and RANKL, has the capacity to regulate RANKL, with different effects on its expression in the presence or absence of vitamin D. These results suggest that it may play a role in the RANK/RANKL/OPG equilibrium, and might explain the association between the SNPs in this region and BMD. A transcript of minimum 300 bp (with rs9594738 in a central position) has been detected in this region. The existence of this RNA segment suggests its involvement in alternative functions of the region. We also identified 2 SNPs in the RANK 3’UTR (rs78326403 and rs884205) that are associated with low trauma fractures in our cohort. SNP rs78326403 is associated with wrist/forearm fractures, while SNP rs884205 is associated with spine fractures. In addition, we observed a significant interaction between rs78326403 and the RANKL BMD-associated SNP (rs9594738), highlighting the relevance of both microarchitecture and low BMD as genetically determined predictors of fracture risk that should be assessed using multiple techniques. To conclude, our results highlight the importance of the region between AKAP11 and RANKL on RANKL transcription regulation and suggest that it may play an important role in the RANK/RANKL/OPG equilibrium. Furthermore, the site-dependent associations in the RANK gene might be clinically relevant in the future to better profile a more specific approach to the different types of fractures, both to better understand their underlying mechanisms and to search for site-specific therapeutic strategies. / La osteoporosis es la enfermedad metabólica ósea más frecuente. Está definida como un trastorno esquelético sistémico caracterizado por una disminución de la densidad mineral ósea (DMO) y alteraciones en la microarquitectura del tejido óseo, con un consecuente incremento de la fragilidad ósea y del riesgo de fractura. Su complejidad genética permanece incompletamente definida. La DMO viene marcada por un remodelado óseo basado en ciclos de resorción y formación que suceden a lo largo de toda la vida del organismo. Este proceso, está regulado en parte por un conjunto de reacciones proteicas pertenecientes al sistema conocido como RANK/RANKL/OPG. La especial importancia de RANK, así como la interacción de éste con su ligando RANKL, recae en el hecho que, son factores clave tanto en el desencadenamiento de la diferenciación como de la supervivencia osteoclástica. El estudio se centra en el análisis detallado de variantes pertenecientes a ambos genes, seguido del estudio funcional correspondiente. Se ha replicado la asociación del SNP rs9594738 con la DMO, una variante genética localizada a 184 kb 5' del gen RANKL. Los resultados del estudio funcional muestran que la región que engloba dicha variante actúa como un regulador distal de RANKL, ejerciendo efectos en su expresión que varían en presencia ó ausencia de vitamina D. Además, se identificaron dos SNPs (rs78326403 y rs884205) en el 3’UTR de RANK, asociados con fracturas por bajo traumatismo en nuestra cohorte. Por último, una interacción significativa entre rs78326403 y rs9594738 en la determinación del riesgo de fractura, pone de relieve la importancia de la DMO baja y de la microarquitectura como predictores genéticamente determinados del riesgo de fractura que se deben evaluar con el uso de diversas técnicas.

Tesi realitzada al Centre de Recerca en Agrigenòmica (CRAG) / The present PhD thesis work reports the molecular and genetic dissection for the role of plant steroid hormones Brassinosteroids (BRs) in root growth and development of Arabidopsis thaliana (Arabidopsis). A genetic, physiological and cellular analysis of existing BR mutants, together with the discovery of a novel pathway for the control of BR mediated stem cell divisions. The results presented here provide experimental evidence for a role of BRs in stem cell homeostasis in the primary root of Arabidopsis. Specifically, BRs promote columella stem cell differentiation and the division of a set of low mitotic cells called quiescent center (QC) that maintain the surrounding stem cells. Using a microgenomic approach, a novel BR signaling component, BRAVO (Brassinosteroids at Vascular and Organizing Centre) has been identified that is specifically expressed in the stem cells. BRAVO encodes a R2-R3 MYB transcription factor (MYB56) that acts as a negative regulator of BRmediated QC divisions. This study uncovers a fine example of negative regulation model; BRAVO is directly repressed and interacts with BES1 creating a molecular switch that controls QC divisions. The work carried out during this PhD thesis shed light to a new function of brassinosteroids in the regulation of stem cells. BRAVO provides plasticity to the stem cells to response to DNA damage, and at the same time robustness to ensure QC function upon damage. The control of plant stem cell homeostasis is pivotal to understand plant adaptation to environmental changing conditions and provides a new mechanism to understand plants life span. / Aquesta tesi doctoral té com a objectiu principal investigar els efectes de les hormones vegetals esteroides, Brassinosteroids (BRs), durant el desenvolupament de lʼarrel primària dʼArabidopsis thaliana (Arabidopsis). Per tal dʼassolir aquest objectiu hem realitzat una caracterització genètica, fisiològica i anàlisi cel•lular de mutants de BRs. Així mateix, sʼha descobert una nova ruta de senyalització que controla les divisions de les cèl•lules mare mediades per BRs, Els nostres resultats experimentals mostren com els BRs controlen la homeòstasi de les cèl•lules mare de lʼarrel. En concret, els BRs promouen la diferenciació de les cèl•lules mare de la columel•la i la divisió dʼun grup de cèl•lules mitòticament inactives que actuen en el manteniment de les cèl•lules mare, el centre quiescent (QC). Mitjançant un abordatge microgenòmic hem identificat un nou element de la ruta de senyalització dels BRs específic de les cèl•lules mare, BRAVO (Brassinosteroids at Vascular and Organizing Centre). BRAVO és un factor de transcripció R2R3 de la família MYB (MYB56), que actua com a regulador negatiu de les divisions de QC. Els nostres resultats mostren un model de regulació negativa, on BES1 reprimeix directament i interacciona amb BRAVO, creant un interruptor molecular que controla les divisions del QC. El treball realitzat durant aquesta tesis doctoral permet proposar una nova funció dels BRs en el control de les cèl•lules mare. BRAVO dóna plasticitat a les cèl•lules mare per a poder respondre al dany sobre lADN, així com robustesa per evitar-lo. El control de la homeòstasi de les cèl•lules mare en plantes és vital per entendre lʼadaptació dʼaquests organismes sèssils i la longevitat que presenten algunes espècies.

Discovering the master genes necessary to build the eye in an invertebrate model such as S. mediterranea could help us to understand numerous retinopathies and age-related degeneration of the human eye. The aim of this study was to select and determine the functional activity of genes involved in the regeneration and development of the S. mediterranea eye. Gene ontology was the tool used to select the genes; while RNA interference and RNA hybridization provided the first approach towards establishing possible roles in the eye development process. From 45 genes studied, silencing of five opsins, Smed-rhodopsin1, Smed-rhodopsin2, Smed-rhodopsin10, Smed-melanopsin2 and Smed-melanopsin3; four transcription factors, Smed-exd (-pbx), Smed-hox2, Smed-mitf2 and Smed-mitf3; and two ABC transporters, Smed-white and Smed-mrp1-2, specifically inhibited normal eye regeneration in S. mediterranea. This suggested they are relevant for or involved in phototransduction, eye pigment biosynthesis, photoreceptor microtubule transport or eye developmental processes. Smed-melanopsin2 and Smed-melanopsin3 RNAi affected the regeneration of pigment cells and skin pigmentation. Smed-melanopsin3 RNAi produced misrouted photoreceptor axonal fibres and fused pigment cups. 13 out of the 14 opsin or light sensor genes studied had ubiquitous mRNA expression throughout the body, which might be explained by the presence of a dermal light sense, as observed in other flatworms. These proteins might serve as photoentrainment regulators or as photolyases responsible for the repair of photodamaged DNA. Smed-hox1 RNAi inhibited the proper development of anterior structures. Smed-VATP synthase, Smed-kinase, Smed-dye and Smed-centrin transiently inhibited eye regeneration before the inhibition of whole body regeneration. This was followed by death, which might indicate the existence of a photoreceptor ATP synthesis and microvilli transport specificity; or also the importance of these genes in cell survival. Smed-peropsin1, Smed-yy1, Smed-hmt, Smed-tpr1, Smed-tpr2, Smed-kinase, Smed-mrp1-2 and Smed-hox1 have eye expression patterns. Additionally, Smed-hox1 and Smed-mrp1-2 also present inhibition of anterior structures. Smed-white RNAi produced hypopigmented, fused eye cups and photoreceptor cell size reduction. This was probably induced via the damaged pigment cells, due to the dependence between these two cell types. Smed-melanopsin1, Smed-ver and Smed-hox2 have brain lobes-like expression patterns. These RNA sequences might be signalling neuronal cells. Smed-tpr1 mRNA injection induced rapid pharynx autotomy, also provoked by Smed-ver and Smed-white-sf2. All three are melanin biosynthesis-related genes. This ejection suggests the existence of an additional natural mechanism of tissue release, probably provoked for the action of a small amino acid. For the first time, the rabdomeres of the Schmidtea mediterranea eye have been photographed using electron microscopy. These structures are very similar to their homologues in other flatworms. / El objetivo de este estudio ha sido encontrar genes implicados en la regeneración y por consiguiente en el desarrollo de los ojos de S. mediterranea. Para ello se han usado herramientas informáticas de selección de genes homólogos de otras especies, la interferencia con RNA mensajero y la hibridación in situ de mRNA. De los 45 genes estudiados, el RNAi de cinco opsinas Smed-rhodopsin1, Smed-rhodopsin2, Smed-rhodopsin10, Smed-melanopsin2 y Smed-melanopsin3; cuatro factores de transcripción Smed-exd (-pbx), Smed-hox2, Smed-mitf2 y Smed-mitf3; junto con dos transportadores ABC Smed-white y Smed-mrp1-2, inhiben la regeneración normal de los ojos de S. mediterranea. Aunque ninguno de estos genes se expresa en los ojos, la expresión ubicua del mRNA de las opsinas por todo el cuerpo de la planaria podría indicar la presencia de un sentido fotodermal previamente observado en otras planarias. Los mRNA de los genes Smed-peropsin1, Smed-yy1, Smed-hmt, Smed-tpr1, Smed-tpr2, Smed-kinase, Smed-hox1 y Smed-mrp1-2 se expresan en los ojos. La interferencia con RNA de los tres últimos provoca inhibición de las estructuras anteriores. Los genes Smed-kinase, Smed-VATP synthase, Smed-dye y Smed-centrin inhiben la regeneración de los ojos antes de provocar una destrucción celular masiva que desemboca en la muerte del animal. El RNAi de los genes Smed-white, Smed-melanopsin2 y Smed-melanopsin3 afecta a la pigmentación de la piel y en Smed-melanopsin3, además, a las rutas que los axones de los fotoreceptores siguen hasta llegar a los ganglios cerebrales. En los RNAi de Smed-white las células pigmentarias no desaparecen pero cambian de posición, se fusionan en el centro de la cabeza. Smed-melanopsin1, Smed-ver y Smed-hox2 tienen patrones de expresión parecidos a los ganglios cerebrales. RNAi de tres genes implicados con la biosíntesis de pigmentos, Smed-tpr1, Smed-ver y Smed-white-sf2, inducen la autotomía de la faringe. Efecto que sugiere la existencia de un mecanismo natural de expulsión de este órgano. Por primera vez los rabdómeros del ojo de Schmidtea mediterranea han sido fotografiados con microscopía electrónica, siendo éstos similares a los de otras planarias.

Tesi realitzada a l'Institut Hospital del Mar d'Investigacions Mèdiques (IMIM) / Un dels factors pronòstics més importants en la leucèmia limfàtica crònica (LLC) són les categories de risc citogenètic, basades en la detecció de del(13q), trisomia 12, del(11q) i del(17p) per hibridació in situ fluorescent (FISH). Aquests grups són alhora heterogenis, i s'han descrit altres alteracions recurrents de valor pronòstic incert no incloses als panells de FISH utilitzats. L'objectiu global de la tesi doctoral és realitzar la caracterització citogenètica dels pacients amb LLC i correlacionar les dades obtingudes amb el pronòstic d'aquests. Els primers treballs estudien la variabilitat entre els pacients amb LLC i deleció de 13q. El treball 1 compara les característiques dels pacients amb del(13q) monoal•èlica (13qx1) i bial•èlica (13qx2), o amb coexistència d'ambdós clons (13qM) d'una cohort de 627 pacients amb LLC i del(13q) aïllada per FISH. Es va demostrar que, malgrat no presentar diferències significatives al curs clínic, la mediana de nuclis alterats per FISH era superior als pacients amb 13qx2 i 13qM respecte al grup 13qx1, i que les pèrdues bial•èliques podien sorgir com a evolució clonal de les monoal•èliques. D'altra banda, el percentatge de del(13q) per FISH tenia un impacte significatiu al pronòstic. Es va concloure que el pronòstic associat a la del(13q) aïllada es pot estratificar segons el percentatge d'alteració per FISH, i que la pèrdua del segon al•lel de 13q no és suficient per aportar un pitjor pronòstic. El treball 2 s'ha centrat en l'impacte de la detecció d'alteracions de 13q per citogenètica convencional (CC). Es van comparar les característiques dels pacients amb alteracions de 13q14 al cariotip, 25 pacients amb translocacions [t(13q)] i 62 amb delecions intersticials [i-del(13q)], amb un grup de 295 pacients amb del(13q) únicament detectada per FISH [F-del(13q)]. Es van estudiar les alteracions incloses al panell de FISH rutina en LLC i les delecions de RB1. En total es van identificar 25 t(13q) diferents; totes mostraven deleció de D13S319, però només un 32% també presentava pèrdua de RB1. Les medianes de nuclis amb del(13q) dels grup t(13q) i i-del(13q), eren significativament superiors que la del F-del(13q). A més, els pacients amb t(13q) mostraven una incidència major de del(13q) bial•èliques i del(17p) concomitant. La taxa de pèrdua de RB1 era significativament superior al grup i-del(13q). Respecte a l’evolució clínica, el temps fins requerir tractament dels t(13q) i i-del(13q) era significativament més curt que als F-del(13q). En conclusió, l’anàlisi per CC als pacients amb del(13q) permet identificar un subgrup de pacients amb un curs clínic més agressiu. La segona part de la tesi, recollida al treball 3, pretén definir l’aplicabilitat a la pràctica clínica dels microarrays genòmics en la rutina diagnòstica de la LLC. Es van analitzar 70 pacients per microarrays, i es van comparar els resultats amb els obtinguts amb les tècniques utilitzades a la rutina diagnòstica, CC i FISH. La tècnica amb una major taxa de detecció d’alteracions van ser els microarrays. No obstant, els microarrays oferien una menor sensibilitat i no van detectar del(11q) o del(17) identificades per FISH en quatre pacients. A més, la significança clínica de les altres anomalies identificades microarrays no va poder ser demostrada. Es va concloure que l’anàlisi per microarrays és una tècnica vàlida per a l’estudi citogenètic en LLC, però que la completa substitució de la CC i el FISH a la pràctica clínica podia afectar negativament al maneig d’alguns pacients. Globalment, els resultats d’aquesta tesi demostren que l’aplicació combinada de diferents tècniques d’anàlisi citogenètic en LLC permet la identificació d’un ampli ventall d’anomalies, així com una millor caracterització de les alteracions incloses al panell de FISH de la LLC, que poden ser útils per a una millor estratificació pronòstica dels pacients amb LLC. / One of the most important prognostic factors in chronic lymphocytic leukemia (CLL) are cytogenetic risk categories based on the detection of del(13q), trisomy 12, del(11q) and del(17p) by fluorescent in situ hybridization (FISH). However, they are heterogeneous and other alterations have been described. The aim was to perform a cytogenetic characterization of CLL patients and correlate the data with the prognosis. Two of the papers included in the thesis were focused on del(13q). The first analyzes 627 patients with isolated del(13q) by FISH, and compares those who carried monoallelic, biallelic or mosaicism of both 13q deletions. While no significant differences in the outcome was observed, the percentage of del(13q) by FISH had a significant impact on prognosis. In conclusion, del(13q) prognosis can be stratified according to the percentage by FISH, and the loss of the second 13q allele is not enough to trigger a worse outcome. In the second, we compared 25 patients with translocations [t(13q)] and 62 with interstitial deletions [i-del (13q)], with 295 patients with del(13q) only detected by FISH [F-del (13q)]. All the t(13q) showed deletion of the locus D135319, but only 32% also lost RB1. Significant differences in cytogenetic features were observed among groups, this could contribute to the significant shorter time to first treatment observed in t(13q) and i-del(13q) patients. In conclusion, a subgroup of 13q-patients with a poorer outcome can be identified by conventional cytoge n et ics (CC). The third paper compares CC, FISH and microarrays results from 70 patients. Microarray analysis obtained the highest abnormalities detection rate, but showed lower sensitivity and failed to detect some abnormalities identified by FISH. Moreover, clinical significance of other anomalies detected by microarrays could not be demonstrated. In conclusion, microarrays are valid for cytogenetic characterization in CLL. However, the complete replacement of the CC and FISH by microarrays in routine laboratories could negatively affect the management of some patients. Overall, the results show that the combined application of cytogenetic techniques in LLC allow the identification of a wide range of abnormalities, and a better characterization of alterations included in the CLL FISH panel, that may be useful for better prognostic stratification of CLL patients.

Este trabajo ha sido realizado en el Grupo de Cromatina y Enfermedad del Programa de Epigenética y Biología de Cáncer (PEBC) del Institut d’Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) / La presente tesis doctoral se ha centrado en investigar los procesos de desregulación en la metilación del DNA y de microRNAs en dos tipos celulares implicados en la patogenia de la artritis reumatoide, cuya función se encuentra exacerbada en el sinovio de las personas afectadas: fibroblastos sinoviales y osteoclastos. En primer lugar, se han analizado los fibroblastos sinoviales obtenidos de articulaciones procedentes de pacientes con artritis reumatoide, comparando los niveles de metilación del DNA y de expresión de microRNAs entre dos series obtenidas de pacientes y controles. En segundo lugar se ha estudiado el proceso de osteoclastogénesis, por el cual los monocitos, se fusionan y diferencian en osteoclastos multinucleados, capaces de degradar el hueso. Los fibroblastos sinoviales y los osteoclastos son dos tipos celulares que en artritis reumatoide tienen una función aberrante, dado que se encuentran hiperactivos. En la articulación afectada, los fibroblastos sinoviales hiperactivos degradan el cartílago, mientras que los osteoclastos, contribuyen a la destrucción del hueso. Tras un proceso continuado de degradación, la articulación puede perder su función y la persona que padece la AR quedar seriamente afectada. En el caso de los fibroblastos sinoviales, se han extraído de rodillas de personas con artritis reumatoide, y los hemos comparado con controles examinando sus perfiles de metilación de DNA y miRNAs, para investigar las diferencias entre los fibroblastos de pacientes y controles. Las variaciones entre los dos grupos encontradas indican potenciales vías de señalización y genes desregulados en esta enfermedad. Ente los ejemplos más reseñables cabe destacar la hipometilación del gen IL6R, TNFAIP8, HOXA11y CD74. Además, los datos de metilación, expresión de microRNAs así como expresión de mRNA, se integraron para conocer en profundidad las interconexiones entre las diferentes capas de regulación que están detrás del comportamiento aberrante de este tipo celular. Por otro lado, hemos analizado in vitro qué cambios epigenéticos suceden durante la diferenciación de monocitos a osteoclastos. Para ello, hemos realizado un análisis de metilación de DNA durante el proceso de diferenciación de monocitos y osteoclastos derivados de los anteriores, así como de varias series temporales para conocer las dinámicas de metilación. Como resultado hemos descubierto que en este proceso de diferenciación, el perfil de metilación cambia drásticamente. Genes clave en la función del osteoclasto, como la CTSK, ACP5 o TM4SF7, se hipometilan de forma activa, rápidamente, y se sobreexpresan. También genes específicos de monocito, como el CX3CR1 se hipermetilan y silencian específicamente. Además, hemos determinado que el factor de transcripción PU.1, tiene un papel clave en este cambio epigenético, dado que actúa como conector dual en el reclutamiento de la maquinaria epigenética (TET2 y DNMT3b) que va a modificar, en un sentido o en otro (hipometilación e hipermetilación) el epigenoma. La caracterización del mecanismo a nivel molecular en este proceso de diferenciación es clave para posteriormente encontrar vías de señalización que potencialmente puedan ser inhibidas farmacológicamente. Por último, se ha analizado el perfil de expresión de microRNAs en este proceso de diferenciación mieloide. Se ha realizado inicialmente un screening de expresión de 380 miRNAs a varios tiempos (0d, 2d y 21d), centrándonos posteriormente en dos clusters de miRNAs, el miR-212/132 y el miR- 99b/let-7e/125a. Se ha demostrado el papel clave que estos microRNAs desempeñan en el proceso de diferenciación, dado que su inhibición funcional, retrasó la formación de los osteoclastos, así como la expresión de marcadores de osteoclasto, y la represión de genes de linaje alternativo. / ARTICLE 1: Autoimmune rheumatic diseases are complex disorders, whose etiopathology is attributed to a crosstalk between genetic predisposition and environmental factors. Both variants of autoimmune susceptibility genes and environment are involved in the generation of aberrant epigenetic profiles in a cell-specific manner, which ultimately result in dysregulation of expression. In this study we performed DNA methylation and miRNA expression screening of a set of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts and compared the results with those obtained from osteoarthritis patients with a normal phenotype. DNA methylation screening allowed us to identify changes in novel key target genes like IL6R, CAPN8 and DPP4, as well as several HOX genes. A significant proportion of genes undergoing DNA methylation changes were inversely correlated with expression. miRNA screening revealed the existence of subsets of miRNAs that underwent changes in expression. Integrated analysis highlighted sets of miRNAs that are controlled by DNA methylation, and genes that are regulated by DNA methylation and are targeted by miRNAs with a potential use as clinical markers. Our study enabled the identification of novel dysregulated targets in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts and generated a new workflow for the integrated analysis of miRNA and epigenetic control. ARTICLE2: Background: DNA methylation is a key epigenetic mechanism for driving and stabilizing cell-fate decisions. Local deposition and removal of DNA methylation are tightly coupled with transcription factor binding, although the relationship varies with the specific differentiation process. Results: Here we focused on DNA methylation changes during osteoclastogenesis. Hypermethylation and hypomethylation changes took place in several thousand genes, including all relevant osteoclast differentiation and function categories. Hypomethylation occurred in association with changes in 5-hydroxymethylcytosine, a proposed intermediate toward demethylation. Transcription factor binding motif analysis revealed an overrepresentation of PU.1, NF-kB and AP-1 (Jun/Fos) binding motifs in genes undergoing DNA methylation changes. Among these, only PU.1 motifs were significantly enriched in both hypermethylated and hypomethylated genes; ChIP-seq data analysis confirmed its association to both gene sets. Moreover, PU.1 interacts with both DNMT3b and TET2, suggesting its participation in driving hypermethylation and hydroxymethylation-mediated hypomethylation. Consistent with this, siRNA-mediated PU.1 knockdown in primary monocytes impaired the acquisition of DNA methylation and expression changes, and reduced the association of TET2 and DNMT3b at PU.1 targets during osteoclast differentiation. Conclusions: The work described here identifies key changes in DNA methylation during monocyte-to-osteoclast differentiation and reveals novel roles for PU.1 in this process.

La naturaleza genética del gen de la ß-lactamasa SHV-1 ha sido analizada en 97 cepas de Klebsiella pneumoniae procedentes de productos patológicos humanos y no relacionadas epidemiológicamente. Mediante IEEA se detectaron las bandas de pI 7,6 (SHV-1) en 74 cepas, 7,1 (LEN-1) en 13 cepas y 5,4 (TEM-1) en 10 cepas. Entre las 74 cepas SHV-1, 40 mostraron una doble banda; 20 con pI 7,1 y 20 con pI 5,4. La mayoría de las 74 cepas SHV-1 presentaron plásmidos (76,7%). La transferencia por conjugación de la ß-lactamasa SHV-1 sólo fue posible en 5 casos (9,3%). Se realizó una PCR-RFLP SHV-1 específica del DNA cromosómico que resultó positiva para 93 de las 97 cepas y fue negativa únicamente en 4 cepas productoras de TEM-1. También se analizó el DNA cromosómico de las 97 cepas, en un intento de aproximación al locus génico de SHV-1 mediante restricción por endonucleasas (RFLP) y Southern-blot. La digestión con EcoRI mostró al menos una banda positiva de hibridación en 96 cepas; 2 bandas fueron detectadas en 8 muestras. Únicamente en 1 cepa productora de la ß-lactamasa TEM-1 la hibridación fue negativa. El análisis de las secuencias de DNA no mostró diferencias en las regiones promotoras del gen, ni secuencias de fin de la transcripción adicionales; únicamente mutaciones puntuales que determinaron variantes alélicas. Se describieron algunas nuevas variantes que representaron cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína (SHV-27, 28, 32 y 33 y la LEN-2). Como resultado de los estudios de Southern-blot y secuenciación podemos postular que SHV-1 y LEN-1 están situados muy cercanos y en tándem en el cromosoma bacteriano de K. pneumoniae . Nuestros resultados apoyan la hipótesis de que el ancestro de SHV-1 fue originado en el cromosoma bacteriano de K. pneumoniae .Esta tesis obtuvo un Excelente "cum laude" por unanimidad. Como complemento puede consultarse Chaves, J. et al., Antimicrob Agents Chemother 2001;45:2856-61.

Mitofusina 2 (Mfn2) es una proteína de fusión mitocondrial. Las evidencias experimentales demuestran una menor expresión génica de Mfn2 en músculo esquelético de sujetos obesos y pacientes diabéticos de tipo 2. Al inhibir la expresión de Mfn2 en células en cultivo se reduce el consumo de oxígeno, el potencial de membrana mitocondrial y la oxidación de glucosa, indicando un papel relevante de Mfn2 en la biología mitocondrial así como en la fisiopatología de la obesidad y/o la diabetes de tipo 2. Además, se han relacionado mutaciones en el gen de Mfn2 con la neuropatía de Charcot-Marie-Tooth de tipo 2 y se le ha descrito un papel antiproliferativo en desordenes vasculares. Consecuentemente, el estudio de la regulación de la expresión génica de Mfn2 es de notable interés.En esta tesis, se ha clonado el promotor humano de Mfn2 y se ha determinado que carece de caja TATA y se localiza en una isla CpG, lo que lo hace susceptible de ser regulado por metilación. En músculo esquelético posee al menos 6 inicios de transcripción en una ventana de 171 pares de bases. Estudios con genes reporteros han determinado que Sp1 podría tener un papel relevante dirigiendo a la maquinaria basal de transcripción para formar el complejo de preiniciación. La expresión de Mfn2 es mayor en tejidos con requerimientos energéticos elevados. Ensayos con genes reporteros han permitido identificar factores de transcripción que podrían ser responsables de la expresión dependiente de tejido.Se ha estudiado con detalle la inducción de Mfn2 en músculo esquelético y tejido adiposo marrón con la exposición al frío y tratamiento con agonistas de los receptores beta-3-adrenérgicos, condiciones ambas caracterizadas por un elevado gasto energético. El aumento de expresión de Mfn2 en estas condiciones es mediado por PGC-1-alfael cual coactiva a ERR-alfa que se une al promotor de Mfn2 en forma de monómero entre las bases -413 y -408. El incremento del potencial de membrana mitocondrial asociado a la expresión de PGC-1-alfa es inhibido por la represión de la expresión de Mfn2. Mfn2 podría ser un efector crucial en la activación mitocondrial inducida por PGC-1-alfa. Se han aportado nuevas evidencias de la relevancia de Mfn2 en el control de la oxidación mitocondrial de substratos al mostrar una mayor expresión de Mfn2 en fibras musculares oxidativas que en fibras glucolíticas. La transcripción de Mfn2 aumenta en respuesta a incrementos en la concentración de calcio intracelular. Nuestros resultados sugieren que MEF2, el cual se une y activa al promotor de Mfn2, podría ser un efector de la cascada de señalización iniciada por el calcio citosólico. Los datos obtenidos indican que la expresión de Mfn2 en músculo esquelético se incrementan en condiciones de elevado gasto energético lo cual estimula la oxidación de substratos y provoca incrementos en el potencial de membrana mitocondrial. Dependiendo de la demanda celular de ATP, el potencial de membrana mitocondrial se disipa para producir ATP o generar calor.ENGLISH / Mitofusin 2 (Mfn2) is a mitochondrial fusion protein. Mfn2 have been related in several diseases such as neuropathy of Charcot-Marie-Tooth type 2A, vascular proliferative disorders and type 2 diabetes and obesity. Consequently, the mechanisms that regulate Mfn2 gene expression are of relevance. The human Mfn2 promoter was cloned, showing it is located in a CpG island and lacks TATA box. That makes Mfn2 promoter susceptible to be regulated by methylation. In skeletal muscle transcription is initiated in at least 6 points in a 171 bp window. Sp1 may direct the basal machinery to form a preinitiation complex in human Mfn2 promoter.Mfn2 is highly expressed in tissues with elevated energy demand. Gene reporter assays allowed to identify some transcription factors that may mediate tissue specific expression. Mfn2 was induced with cold and -3-adrenergic receptor agonist exposure, conditions associated with enhanced energy expenditure. The cold induced coactivator PGC-1regulated Mfn2 expression requiring the integrity of an estrogen-related receptor alpha (ERR-alpha-binding element located at -413/-408. ERR-alpha also activated the transcriptional activity of the Mfn2 promoter and the effects were synergic with those of PGC-1-alphaRepression of Mfn2 reduces oxygen consumption, glucose oxidation and mitochondrial membrane potential. Using knock down strategy was showed that Mfn2 cold play a crucial role in mitochondrial energization by PGC-1-alpha Mfn2 showed higher expression in slow twitch oxidative muscle fibres than in fast twitch glucolitic fibres. This is a new evidence of Mfn2 as regulator of substrate oxidation. We proved that Mfn2 gene expression was regulated by calcium. High intracellular calcium levels in oxidative muscle fibres could be the initiator of the cascade that results in higher Mfn2 expression. One of the downstream effectors of calcium is MEF2 that binds and activates Mfn2 promoter. Data provided indicated that Mfn2 expression was increased in skeletal muscle when energy demand is high. The increases in Mfn2 expression supposed a higher mitochondrial membrane potential, this mitochondrial membrane potential could be dissipated coupled to ATP synthesis (oxidative muscle) or uncoupled to produce heat (cold exposure) depending the energetic requirements of the cell in each case.

La psoriasis es una enfermedad inflamatoria crónica de la piel que afecta a millones de personas. Aunque en ratón no existen modelos de psoriasis, la facilidad para obtener muestras de piel de pacientes ha facilitado el estudio de las vías de señalización implicadas en la enfermedad, mostrando la importancia del sistema inmune en su desarrollo. Algunas terapias que utilizan anticuerpos específicos contra varias citoquinas, incluyendo TNFα, IL-23 y IL-17, son prometedoras, pero son caras y presentan efectos secundarios. Numerosos estudios han mostrado la aparición de nuevos casos de psoriasis después del tratamiento con antagonistas del TNFα en pacientes con Inflammatory Bowel Disease. Aunque esos datos indican un papel ambiguo del TNFα en psoriasis, su papel, y especialmente la contribución de sus receptores, en la regulación de la inflamación en piel han sido escasamente estudiados. OBJECTIVES: (1) Caracterización del papel de Tnfa y sus receptores (Tnfr1 y Tnfr2) en la función y distribución de los neutrófilos en larvas de pez cebra; (2) Caracterización de las vías de señalización de Tnfr1 y Tnfr2 involucradas en la homeostasis de la piel en larvas de pez cebra; (3) Caracterización del papel de Tnfa y sus receptores en inflamación crónica en piel en larvas de pez cebra; (4) Evaluación de las larvas de pez cebra como posible modelo para estudiar enfermedades inflamatorias crónicas humanas. METHODOLOGY: Líneas transgénicas de pez cebra y las ventajas de trabajar con sus embriones en in vivo imaging y cell tracking han sido utilizadas para estudiar los patrones de distribución de los neutrófilos. Además, la inflamación en la piel causada por la depleción de Tnfa o Tnfr2, pero no Tnfr1, ha sido estudiada mediante la inhibición genética (morpholinos y formas dominantes negativas) y farmacológica (DPI) de Duox1. La expresión de moléculas pro-inflamatorias ha sido medida mediante RT-qPCR, Neutrófilos y queratinocitos han sido aislados de larvas control y deficientes en Tnfr2 usando FACS-sorting. Sondas específicas para H2O2 han sido usadas para detectar su producción. RESULTS AND CONCLUSIONS: La depleción de Tnfa o Tnfr2, pero no de Tnfr1, causa inflamación en la piel a través de la activación de un bucle inflamatorio de retroalimentación positiva que implica a H2O2/NF-κB/Duox1. Tanto la inhibición genética como farmacológica de Duox1 revierten completamente la inflamación en piel, situando al H2O2 derivado de Duox1 aguas arriba de la activación de NF-κB. Extraemos las siguientes conclusiones: (1) La inhibición genética de Tnfa o Tnfr2, pero no de Tnfr1, resulta en la movilización de los neutrófilos desde la CHT hasta la piel; (2) El silenciamiento de Tnfa o Tnfr2 provoca la inducción en la piel de la expresión de genes que codifican para moléculas pro-inflamatorias; (3) La ausencia de señalización de Tnfa a través del receptor Tnfr2 desencadena la producción local de H2O2 por la enzima Duox1 en la piel; (4) La inhibición genética de Tnfa o Tnfr2 resultada en la activación del regulador maestro de la inflamación NF-кB en la piel, aguas abajo de la producción de H2O2; (5) La señalización de Tnfa a través del receptor Tnfr2 es indispensable para el mantenimiento de la homeostasis de la piel; (6) La inducción de DUOX1 y/o la consiguiente producción de H2O2 en la piel de pacientes con psoriasis, podrían ser nuevas dianas para terapias farmacológicas y genéticas para el tratamiento de la psoriasis. Estas nuevas estrategias podrían ser también aplicables para otras enfermedades inflamatorias crónicas; (7) El pez cebra puede utilizarse como organismo modelo para estudiar la psoriasis y otras enfermedades inflamatorias crónicas. / Psoriasis is a chronic, debilitating skin disease that affects millions of people worldwide. Although there is no mouse model that accurately reproduces all facets of the psoriasis, the accessibility of skin tissue from patients has facilitated the elucidation of some pathways involved in the pathogenesis of psoriasis and highlighted the importance of the immune system in the disease. Recently developed antibodies that selectively target several cytokines, including TNFα, IL-23 and IL-17, have shown promising results in early-phase clinical trials. However, these treatments are extremely expensive and show important side effects. Importantly, numerous studies have reported new-onset psoriasis following TNFα antagonist therapy in adult inflammatory bowel disease patients. Despite these clinical data pointing to an ambiguous function of TNFα in psoriasis, the role of TNFα, and in particular the contribution of each TNFR, in the regulation of skin inflammation has scarcely been studied. OBJECTIVES: Taking that into consideration, the objectives of the present work are: (1) Characterization of the role played by Tnfa and its receptors (Tnfr1 and Tnfr2) in the neutrophil function and distribution patterns in zebrafish larvae; (2) Characterization of the Tnfr1 and Tnfr2 signaling pathways involved in skin homeostasis in zebrafish larvae; (3) Characterization of the role played by Tnfa and its receptors in chronic inflammation in the skin in zebrafish larvae; (4) Evaluation of the zebrafish larvae as a potential model for the study of human chronic inflammatory diseases. METHODOLOGY: Some zebrafish transgenic lines and the unique advantage of the zebrafish embryo for in vivo imaging and cell tracking have been used for the study of the neutrophil distribution patterns. Furthermore, the skin inflammation caused by the depletion of Tnfa or Tnfr2, but not of Tnfr1, has been studied using both genetic (morpholinos and dominant negative forms) and pharmacological (DPI) inhibition of Duox1. The expression of pro-inflammatory molecules has been measured by RT-qPCR, while neutrophils and keratinocytes have been FACS-sorted from controls and Tnfr2-deficient larvae. H2O2-specific probes have been used in order to detect the production of that compound. RESULTS AND CONCLUSIONS: We found that depletion of Tnfa or Tnfr2, but not of Tnfr1, caused skin inflammation through the activation of an H2O2/NF-κB/Duox1 positive feedback inflammatory loop. Moreover, both genetic and pharmacological inhibition of Duox1 completely abrogated skin inflammation, placing Duox1-derived H2O2 upstream of the positive feedback inflammatory loop. Thus, these results lead us to the next conclusions: (1) Genetic inhibition of Tnfa or Tnfr2, but not of Tnfr1, results in neutrophil mobilization from the CHT to the skin, where they get infiltrated; (2) Target gene silencing of Tnfa or Tnfr2 results in the induction of the expression of genes encoding pro-inflammatory mediators in the skin; (3) The absence of Tnfa signaling through Tnfr2 triggers the local production of H2O2 by Duox1; (4) Genetic inhibition of Tnfa or Tnfr2 results in the activation of the master regulator of inflammation NF-кB in the skin, downstream the production of H2O2; (5) Tnfa signaling through Tnfr2 is critically required for skin homeostasis; (6) DUOX1 induction and/or the subsequent production of H2O2 in the skin of psoriasis patients, may be new targets for pharmacologic and genetic therapies for the treatment of psoriasis. These new strategies could be applicable to other chronic inflammatory diseases as well; (7) Zebrafish can be used as a model organism for the study of psoriasis and other inflammatory chronic diseases.