Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-08-16T20:24:05Z No. of bitstreams: 1 2016_ClêniadosSantosAzevedo.pdf: 3228575 bytes, checksum: 52c4b5bc7aca2ec9b7980c243056f4d3 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-09-05T22:01:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_ClêniadosSantosAzevedo.pdf: 3228575 bytes, checksum: 52c4b5bc7aca2ec9b7980c243056f4d3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-05T22:01:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_ClêniadosSantosAzevedo.pdf: 3228575 bytes, checksum: 52c4b5bc7aca2ec9b7980c243056f4d3 (MD5) / Enzimas deubiquitinantes (DUBs) desempenham um papel importante na regulação da degradação de proteínas e de outros processos não-degradativos, por desconjugação de ubiquitina (Ub) de proteínas marcadas, como a modulação da resposta imune, a sinalização da quebra da dupla fita do DNA e endocitose. Explorar o papel de deubiquitinação em Leishmania infantum demonstra uma alternativa promissora para procurar novos alvos terapêuticos para a leishmaniose, já que a quimioterapia utilizada é onerosa, tóxica e tende a ser ineficiente. Este estudo teve como objetivo o estabelecimento de duas linhagem de L. infantum expressando uma cópia extra de otubaína (OtuLi), caracterização da atividade enzimática e funcional da OtuLi recombinante produzida em E. coli (rOtuLi). Com relação ao estabelecimento das linhagens, o gene otuli foi amplificado, clonado no vetor pLEXSY-hyg2 e linearizado. Os promastigotas de L. infantum foram transfectados com os cassetes e selecionados. A integração dos cassetes ao locus gênico da 18S rRNA foi confirmada por PCR e a expressão da OtuLi fusionada ao peptídeo FLAG ou a cauda de 6 histidinas foi verificada por western blot. A citolocalização da FLAG-OtuLi indica que a enzima encontra-se em pequenas vesículas no citoplasma da célula com fortes marcações perto da região do cinetoplasto, corroborando o resultado visto utilizando anticorpos específicos para a OtuLi. A OtuLi não co-localiza com a mitocôndria marcada por duas sondas diferentes e com o retículo endoplasmático imunomarcado pela Proteína Dissulfato Isomerase em promastigotas. A rOtuLi apresentou atividade em pH ácido com substrato de tetra-ubiquitina ligado pela lisina 48 e o perfil de inibição indica que os inibidores NEM e Ub-aldeído são capazes de inibi-la. Através de mutações sítio-dirigidas realizadas na OtuLi, foi observado que tanto os resíduos próximos ao sítio catalítico quanto aqueles envolvidos na interação com a ubiquitina ocasionaram mudanças estruturais, conforme dinâmica molecular, resultando na redução ou perda da atividade da enzima. A rOtuLi foi capaz de estimular a formação de corpúsculos lipídicos em macrófagos peritoniais e induzir a secreção de IL-6 e TNF-α, citocinas pró-inflamatórias. O estabelecimento das linhagens com a cópia extra de otuli representa o primeiro passo para futura identificação de proteínas capazes de interagir com a OtuLi e assim, elucidar seu mecanismo de ação no parasito. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Deubiquitylating enzymes (DUBs) play an important role in regulating protein degradation and other non-degradative processes, by deconjugation of ubiquitin (Ub) from marker proteins, such as immune response modulation, signalling of double strand breaks at DNA and endocytosis. Exploring the role of deubiquitination in Leishmania infantum demonstrates a promising alternative to search for new therapeutic targets for leishmaniasis, since its primary chemotherapy is expensive, toxic and tending to be inefficient. This study aimed to establish two L. infantum strains expressing an extra copy of otubain (OtuLi), characterization of enzymatic and functional activity of recombinant OtuLi (rOtuLi). Regarding the establishment of the strains, the otuli gene was amplified, cloned in pLEXSY-hyg2 and the vector was linearized. The promastigotes of L. infantum were transfected with the cassette and selected. The integration of the cassettes into the 18S rRNA gene locus was confirmed by PCR and the expression of OtuLi fused to the FLAG peptide or to a 6 histidine tail was accessed by western blot. The citolocalization of FLAG-OtuLi indicates that the enzyme is in small vesicles in the cytoplasm of the cell with strong markings near the kinetoplast region, confirming the results seen using antibodies specific for OtuLi. The OtuLi is not co-located with the mitochondria marked by two different probes and with the endoplasmic reticulum immunolabeled by protein disulfide-isomerase. The rOtuLi showed activity at acid pH with lysine 48-linked tetra-ubiquitin substrate and the inhibition profile indicates that NEM and Ub-aldehyde inhibitors are able to inhibit it. Through site-directed mutations in OtuLi, it was observed that the residues near the catalytic site or those involved in the interaction with the ubiquitin caused structural changes as shown by molecular dynamics, resulting in a reduction or loss of enzyme activity. The rOtuLi was able to stimulate the formation of lipid body in peritoneal macrophages and to induce the secretion of IL-6 and TNF-α, pro-inflammatory cytokines. The establishment of these strains with the extra copy of otuli is the first step for future identification of proteins that interact with OtuLi and thus elucidate its mechanism of action in the parasite.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Aline Girardi (alinegirardiunb@gmail.com) on 2015-04-01T19:26:55Z No. of bitstreams: 1 2015_LuízaCescaPiva.pdf: 2317519 bytes, checksum: 29251421288ca0cf8f14fde7573ec0cb (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-04-01T19:50:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_LuízaCescaPiva.pdf: 2317519 bytes, checksum: 29251421288ca0cf8f14fde7573ec0cb (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-01T19:50:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_LuízaCescaPiva.pdf: 2317519 bytes, checksum: 29251421288ca0cf8f14fde7573ec0cb (MD5) / A levedura Pichia pastoris tem sido bastante explorada na produção de proteínas heterólogas, graças a algumas vantagens apresentadas por esse sistema, tais como: técnicas de manipulação genética disponíveis, crescimento em altas densidades celulares, realização de modificações pós-traducionais e secreção eficiente de proteínas. Contudo, esse sistema ainda possui algumas limitações no que se refere às ferramentas de genética molecular. Por exemplo, para que diversas modificações sejam introduzidas na mesma linhagem, faz-se necessário o uso de múltiplas marcas de seleção ou de estratégias que permitam a sua reutilização. Em Pichia, o uso de marcas recicláveis ainda é limitado. Nesse contexto, destaca-se o gene amdS (acetamidase) de Aspergillus nidulans, que permite a seleção de fungos em meio de cultura contendo acetamida como única fonte de nitrogênio e a contrasseleção em meio contendo a droga fluoroacetamida. Em conjunto com a contrasseleção do gene amdS, o sistema Cre-loxP de recombinação sítio-específica pode ser utilizado para facilitar a excisão da marca de seleção. Neste trabalho, o uso da marca amdS foi testado em P. pastoris e, como prova de conceito, foi feita a deleção do gene ADE2, uma carboxilase envolvida na síntese “de novo” de purinas. Primeiramente, uma ORF endógena que codifica para uma amidase putativa foi deletada. Em seguida, foi construído um vetor contendo um cassete com o gene amdS flanqueado por sítios loxP além do gene repórter EGFP para testar a eficiência da marca em P. pastoris. A construção amdS-loxP foi também utilizada em cassetes de deleção para os genes ADE2 e URA5. Após a deleção do gene ADE2, um plasmídeo replicativo contendo o gene da recombinase CreA (pYRCre2) foi utilizado para a excisão da marca, para permitir a reutilização do gene amdS em outros eventos de deleção. A integração do vetor contendo o gene amdS mostrou que esta nova marca de seleção é aplicável em P. pastoris com a vantagem de permitir a contrasseleção de transformantes após o uso do sistema de recombinação Cre-loxP. Esta nova ferramenta traz alternativas na manipulação genética da levedura reduzindo problemas como a necessidade de expressão de diversas marcas dominantes. / The yeast Pichia pastoris has been widely explored for the production of heterologous proteins due to certain advantages presented by this system, such as: molecular genetic techniques available, growth at high cell densities, post-translational modifications and efficient protein secretion. However, this system still has some limitations related to the tools used for genetic modifications. For example, in order for many genetic modifications to be done in the same strain, one needs to use multiple selection marks or strategies that allow marker reusing. In Pichia, the use of recyclable markers is still limited. The amdS gene from Aspergillus nidulans stands out in this context because it allows the selection of fungi in medium that contains acetamide as sole nitrogen source, as well as the counterselection in medium that contains the drug fluoroacetamide. Along with the counterselection property of the amdS gene, the Cre-loxP site-specific recombination system can be used to help in selection marker excision. In this work, the amdS selection mark was tested in P. pastoris and, as proof of concept, the ADE2 gene coding for a carboxylase involved in purine synthesis was deleted. Firstly, an endogenous ORF coding for a putative amidase was deleted. Subsequently, a vector containing a cassette with the amdS gene flanked by loxP sites and a EGFP gene was constructed in order to test the selection marker in P. pastoris. The amdS-loxP construction was also used in deletion cassettes for ADE2 and URA5 genes. After the ADE2 gene deletion, a replicative plasmid containing the CreA recombinase gene (pYRCre2) was used for marker excision, allowing the use of the amdS gene in further gene deletion events. Integration of the vector containing the amdS gene showed that this new selection marker is applicable in P. pastoris with the advantage of allowing counterselection after using the Cre-loxP recombination system. This new tool brings an alternative for P. pastoris genetic manipulation, reducing problems such as the expression of many dominant selection markers simultaneously.