A levedura Saccharomyces cerevisiae é o sistema eucariótico com a genética mais conhecida, reconhecido como \"GRAS\", vem sendo proposta como hospedeira para a expressão de genes que codificam produtos de interesse biotecnológico. No Brasil, vários processos industriais empregam linhagens selvagens de S. cerevisiae, incluindo a produção de etanol combustível. A maioria dessas linhagens industriais são mais vigorosas e apresentam crescimento muito mais rápido que as linhagens de laboratório, além de já estarem adaptadas a processos industrias de larga escala. Neste trabalho, foi estabelecido um sistema de transformação genética, que permite a inserção de genes codificadores de proteínas de interesse biotecnológico no genoma de linhagens selvagens haplóides ou de ploidia maior. O sistema de transformação origina de um vetor de clonagem, denominado YlpC, formado por um fragmento do gene CAN1 (permease da L-arginina e do análogo tóxico L-canavanina), contendo um sítio de restrição interno (BstEII), onde se realiza a inserção do cassete de expressão gênica desejado. A digestão do plasmídio resultante, com HindlIlI, causa a liberação do fragmento de DNA linear, composto pelo cassete de expressão flanqueado por seqüências de CAN1. Esse fragmento resultante é destinado à transformação de leveduras. As células recombinantes sofrem interrupção do gene CAN1 selvagem pelo cassete de expressão presente no fragmento de transformação, tornando-as resistentes à Lcanavanina, permitindo assim, a seleção positiva dos clones transformantes. Para análise da eficiência desse sistema a glicoamilase de A. awamori foi utilizada como proteína repórter. O cassete de expressão contendo a sequência sinal e estrutural da glicoamilase de A. awamori sob a regulação do promotor e terminador de transcrição de PGK de S. cerevisiae foi subclonado no vetor YlpC, dando origem ao plasmídio YlpCGC e depois pUCGc. Esses vetores, digeridos com HindlIlI, liberam o fragmento CGC, empregado nas transformações de levedura deste trabalho. Obtivemos sucesso na transformação de linhagens diplóides de laboratório. Análise dos esporos e amplificação de DNA por PCR, demonstrou que o fragmento CGC encontra-se inserido em ambos alelos CAN1 cromossômicos dessas linhagens recombinantes. Das 20 linhagens de levedura industriais, submetidas à transformação com o fragmento CGC, 10 resultaram em clones transformantes, e assim como os clones recombinantes de linhagens de laboratório diplóides, mantêm a informação adicional 100% estáveis. O sistema também se mostrou adequado para a construção de linhagem de levedura diplóide heterozigota CGC+/CGC:, empregada na detecção de substâncias indutoras de recombinação mitótica, que, como é conhecido, são potencialmente carcinogênicas. / The yeast Saccharomyces cerevisiae is the eukaryotic system with the most extensively studied genetics, it is generally recognized as safe, and it has broadly been used as a host system for the expression of heterologous genes of biotechnological interest. In Brazil, the vast majority of industrial processes, which include the production of fuel ethanol, utilize wild-type strains because of their higher resistance to adverse conditions, their adaptation to industrial processes in large scale, and because they exhibit higher growth rates than laboratory strains. In the present work, a genetic transformation system was developed for the chromosomal integration of heterologous genes of commercial interest in both haploid and polyploid industrial strains. This system utilizes an integrative shuttle vector, YIpC, which contains a CAN1 gene fragment (L-arginine permease and L-canavanine toxic analogous), bearing an internar restriction site (BstEII), where the gene expression cassette can be inserted. The resultant plasmid is then digested with HindlIII, releasing a linear DNA fragment containing the expression cassette flanked by CAN1 sequences. Following the introduction of the transforming fragment into yeast cells, the wild-type CAN1 gene is interrupted by the expression cassette, thus allowing positive selection of the recombinant clones by their resistance to the toxic properties of L-canavanive. To analyze the efficiency of this system, glucoamylase of Aspergillus awamori was used as reporter. An expression cassette containing the structural and signal sequences of A. awamori glucoamylase, under the control of the S. cerevisiae PGK1 transcriptional promoter and termination sequences, was subcloned in YIpC to obtain the plasmids YIpCGC and pUCGc. Both vectors, when digested with HindlIII, released a fragment (CGC) which was subsequently used for yeast transformation. Spore analysis and DNA PCR amplification indeed confirmed that the CGC fragment was inserted in both CAN1 chromosomal alleles of transformed diploid laboratory strains. Most importantly, 10 out of 20 industrial yeast strains submitted to transformation with the CGC fragment resulted in recombinant clones and, like observed for the diploid laboratory strains, the additional information was 100% stable. In concluding, this system also seems to be suitable for the construction of diploid heterozygote CGC+/CGC yeast strains, which in turn can be used for the detection of inductor substances of mitotic recombination that, as known, are potentially carcinogenic.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:43:49Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:10:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 06777.pdf: 5273885 bytes, checksum: b88f10c3d25adde0595b62adc866d4ee (MD5) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

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Submitted by Claudinei Pracidelli (cpracide@ipen.br) on 2016-11-11T11:03:59Z No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2016-11-11T11:03:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A deficiência de hormônio de crescimento (DGH) é tratada convencionalmente com repetidas injeções do hormônio recombinante. Este trabalho teve como objetivo estabelecer uma alternativa de tratamento baseada na transferência dos genes do hormônio de crescimento humano (hGH) ou de camundongo (mGH), em camundongos anões lit/lit ou lit/scid, mediante administração de DNA plasmidial associada à eletrotransferência, com a finalidade de atingir a máxima recuperação de crescimento em comparação ao camundongo normal (catch-up growth). Inicialmente foi realizada a administração do plasmídeo contendo o gene do mGH no músculo quadríceps exposto ou tibial anterior (TA) não exposto. Utilizando diferentes condições de eletrotransferência, baseadas em pulsos alternados de baixa (100 V/cm) e alta (1000 V/cm) voltagem (HV/LV, HV/8LV) ou em pulsos seguidos de baixa voltagem (8 pulsos de 150 V/cm), o músculo TA na condição HV/LV apresentou os maiores níveis de expressão de mGH: 6,7 ± 2,5 ng/mL. O tempo de exposição e a quantidade da enzima hialuronidase (HI) necessária para a eletrotransferência foram também analisados. O tempo de 30 minutos e a dose de 20 U de HI proporcionaram os melhores resultados de expressão. Diferentes quantidades de DNA foram também testadas, mas a administração de 50 &mu;g DNA/animal foi confirmada como a melhor. Na padronização do volume de solução do plasmídeo administrado no TA, foi observado que a injeção de 20 &mu;L de DNA apresentou expressão significativamente maior da proteína em comparação a de 10 &mu;L. Buscando uma maior expressão de GH, foi realizado experimento adicionando poli-L-glutamato ao diluente do DNA, comparando também diferentes condições de eletrotransferência (HV/LV e 375 V/cm). A condição de 375 V/cm, sem a adição do polímero, proporcionou as maiores concentrações, tanto de hGH como de mGH, no soro de camundongos lit/scid e lit/lit, respectivamente. Quando utilizados 3 pulsos de 375 V/cm e a administração do plasmídeo com o gene do mGH em dois locais de cada músculo TA, foram obtidos os mais altos níveis de expressão atingindo 14,7 ± 3,7 ng mGH/mL. Estes foram os parâmetros utilizados em um bioensaio, no qual foi também determinada a medida do comprimento inicial e final do fêmur por radiografia. Neste bioensaio de 36 dias, a curva de crescimento dos camundongos lit/lit tratados foi similar a de camundongos heterozigotos não tratados e os níveis de mGH do grupo DNA foram significativamente maiores (P<0,0002) em relação ao grupo controle. Os camundongos tratados também apresentarem concentração de mIGF-I no soro superior a do grupo controle. Considerando os parâmetros de crescimento avaliados, o grupo tratado com DNA apresentou percentuais de incremento altamente significativos em relação ao grupo controle, com P<0,001 para o peso corpóreo e P<0,002 para o comprimento do corpo, da cauda e para ambos os fêmures, com valores de catch-up da ordem de 79% para o comprimento dos fêmures. Podemos concluir que foi estabelecida uma metodologia eficiente de transferência gênica não viral, que poderá levar a uma completa normalização de crescimento de camundongos anões mediante utilização de animais mais jovens, como mencionado na literatura e em trabalho recente do nosso grupo. / Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP / FAPESP: 14/07380-6

A protease FtsH pertence à superfamília das proteínas AAA (ATPases Associadas à diversas Atividades celulares) cujos membros estão amplamente distribuídos entre procariotos e eucariotos. Nas plantas superiores, elas são codificadas por genes nucleares e sintetizadas por ribossomos citosólicos com uma seqüência de direcionamento na extremidade amino-terminal responsável pela translocação da pré-proteína para o interior das organelas, notadamente mitocôndrias e cloroplastos. Com o objetivo de caracterizar o processo de translocação da proteína aos tilacóides e sua regulação gênica em plantas, isolou-se um cDNA de frutos de tomate (Lycopersicon esculentum Mill. cv. MicroTom), cuja seqüência de aminoácidos revela a presença de todos os motivos clássicos pertencentes a uma protease do tipo FtsH-p1. A caracterização inicial da proteína indicou a presença de um típico peptídeo de trânsito cloroplástico em sua extremidade amino-terminal. A fim de definir qual região da proteína madura está envolvida no direcionamento da protease às membranas, foram realizadas construções gênicas contendo diferentes comprimentos da região amino-terminal da FtsH-p1 de tomate fusionados ao gene repórter GFP (green fluorescent protein). Estudos realizados a partir de frações enriquecidas de cloroplastos, estroma e tilacóide, provenientes de plantas transgênicas expressando estavelmente estas construções, revelaram que todas as proteínas de fusão acumularam-se no estroma sendo, portanto incapazes de associarem-se aos tilacóides. Estes dados indicam que a inserção da FtsH-p1 de tomate nas membranas dos tilacóides dependem de informação presente na proteína madura, necessária para a interação com as membranas ou mesmo com um fator adicional desconhecido. Alem disso, foi mostrado que membros da família das proteases do tipo das FtsHs em plantas não apresentam o clássico motivo RRXFLK, previamente descrito como essencial para a translocação dependente de uma dupla arginina (Tat). Devido ao envolvimento de ortólogos desta proteína em processos fisiológicos importantes nas plantas, abriu-se a possibilidade de estudar a regulação da FtsH-p1 de tomate via clonagem e caracterização da sua região promotora. Uma vez clonada, 4 deleções à partir da extremidade 5’ nesta região foram realizadas e fusionadas de forma a dirigirem a expressão do gene repórter uidA (GUS). Estas construções foram expressas estavelmente em plantas de tabaco, a fim de estudar sua regulação em diferentes tecidos, estádios de desenvolvimento e em resposta a estímulos ambientais ou situações de estresse. Os resultados preliminares mostraram que a seqüência regulatória clonada é responsível tanto à fatores ambientais, como luz, quanto aos hormônios auxina, citocinina e giberelina. Além disso, foi observada uma regulação negativa na presença de peróxido de hidrogênio. Entretanto, tratamentos envolvendo estresse salino, bem como variações na temperatura não geram nenhum efeito na atividade da enzima GUS. O mesmo ocorre quando as plantas são colocadas em presença de ácido abscísico (ABA). Os resultados deste estudo contribuem significativamente para um melhor entendimento dos mecanismos de regulação envolvidos no controle da expressão gênica da FtsH-p1 de tomate, bem como sugerem novas perspectivas no direcionamento de proteínas às membranas. / The FtsH protease belongs to the AAA family (ATPases associated with different cellular activities) whose members are widely distributed in prokaryotes and eukaryotes. In higher plants, these proteins are nuclear-encoded and synthesized by cytosolic ribosomes as larger molecular weight precursors. These molecules carry at the N-terminal extension a specific targeting sequence that directs translocation of the preproteins to the envelope membranes of mitochondria and chloroplasts. In the present work, a tomato (Lycopersicon esculentum Mill. cv. MicroTom) fruit cDNA encoding a plastid FtsH-p1 has been isolated, cloned and characterized. In order to define the protein domains involved on thylakoid targeting, several gene constructions were prepared carrying increasing lengths of the N-terminal region of tomato FtsH fused to the gfp (green fluorescent protein) reporter gene. In vivo expression studies based on onion cells or stable expression in transgenic tobacco plants showed that the chimeric proteins were translocated to plastids. In addition, sub-organellar fractionation indicated that GFP accumulated in the stromal fraction, instead of being translocated to the thylakoid membrane. These data suggest that membrane insertion of tomato FtsH-p1 requires information present in the mature protein. One remarkable finding was that members of the FtsH family do not present the classical RRXFLK motif, that has been shown to be essential for the Tat-dependent pathway. The FtsH-family members are involved in important physiological processes in plant cells. Therefore, this study opened up the possibility of studying the FtsH-p1 gene regulation by characterization of its regulatory region. After cloning a 1700 bp fragment corresponding to 5’ upstream region of the tomato FtsH coding sequence, four deletions of the promoter region were performed and the resulting fragments were fused to the uidA (GUS) reporter gene. These gene constructs were stable expressed in tobacco plants and further characterized. The results showed that the promoter region is positively regulated by light and the phytohormones auxin, cytokine and gibberelin. Besides, the promoter was down regulated by hydrogen peroxide. However, GUS activity was not affected by salt stress, variations on the temperature and abcisic acid treatment. The results presented here expand the current understanding of factors involved on FtsH gene regulation as well as bring new insights on the protein targeting to membranes.