O efeito dos hormônios glicocorticóides (GC) de suprimir o crescimento celular é exercido através de cascatas celulares nas quais a transcrição de genes de resposta primária, mediada direta ou indiretamente pelo receptor de GC, regulam a transcrição e a atividade de um conjunto de genes, incluindo fatores importantes para a progressão no ciclo celular. Entretanto, a conexão funcional entre diversos dos genes ativados ou inibidos por GC e a inibição da proliferação de determinados tipos celulares ainda não é completamente conhecida. Nosso laboratório isolou a variante ST1, a partir da linhagem C6 de glioma de rato, utilizando-a como modelo de estudo do mecanismo de ação de GC como agentes anti-tumorais. O tratamento com GC confere, às células ST1, um crescimento totalmente dependente de soro e ancoragem, morfologia em cultura semelhante à de fibroblastos normais e incapacidade de gerar tumor em camundongos da linhagem \"nude\", caracterizando uma completa reversão fenotípica tanto in vitro como in vivo. Como abordagens para o entendimento do mecanismo molecular da ação de GCs, o laboratório vem buscando a clonagem de produtos gênicos diferencialmente expressos através do uso de técnicas que permitam a análise da abundância relativa dos mRNAs, e mais recentemente, empregando-se a análise da abundância relativa das proteínas através da eletroforese bidimensional (2D-PAGE). As seqüências isoladas por estas metodologias são alvos potenciais para uma posterior análise funcional. Os objetivos gerais deste trabalho foram: a) identificar genes que estão diferencialmente expressos durante a reversão fenotípica das células ST1 induzida por GC, através da análise proteômica (2D-PAGE e espectrometria de massas) e b) determinar a função de um dos genes (Ciclina G) identificado anteriormente no laboratório como sendo induzido durante o tratamento das células ST1 com GC. A metodologia empregada se baseou na comparação dos perfis 2D de proteínas nucleares das células ST1 tratadas ou não (controle) com GC por 5 e 24h. Após análise de imagem, 33 polipeptídios foram considerados como diferencialmente representados após 5h de tratamento, 16 dos quais foram também identificados após 24h de tratamento. Seis destes polipeptídios foram identificados através da análise dos seus perfis de digestão tríptica (PMF). Evidências obtidas por ensaios de Western blot sugerem que um destes polipeptídeos, a Anexina 2 (ANX2), possui a sua localização sub-celular modulada pela ação de GC nas células ST1. A análise do papel da Ciclina G na reversão fenotípica tumoral-normal das células ST1 induzida por GC, foi feita através da sua super-expressão nestas células, utilizando um sistema retroviral, e avaliando-se os efeitos desta super-expressão sobre a resposta das células ST1 a GC, através de ensaios de curva de crescimento e citometria de fluxo. Os dados sugerem que a super-expressão da Ciclina G nas células ST1 intensifica e prolonga o efeito de GC nestas células. / The glucocorticoid (GC) growth suppression response is controlled through cellular cascades in which the transcription of primary response genes regulates the expression and activity of a diverse set of genes including important factors for cell cycle progression. However, the functional connection between the GC-regulated transcriptional events and cell cycle arrest of determined cells is poorly understood at the molecular level. In this context, our lab has isolated the ST1 variant of the C6 rat glioma cell line to study the mechanism of action of GC as anti-tumor agents. GC treatment leads ST1 cells to a dramatic tumoral to normal phenotypic reversion, characterized by inhibition of their growth rate in monolayer, loss of their ability to form colonies in semi-solid medium and to induce tumor formation in nude mice, and morphological changes (flattening). As part of the strategy to understand the anti-tumor action of GC, differentially represented proteins, associated with the phenotypic reversion displayed by ST1 cells have been isolated through mRNA-based blind cDNA cloning and, more recently, by two dimensional electrophoresis (2D-PAGE). The sequences isolated by these two methodologies are potential targets for functional analysis. In the present study, we aimed at a) identifying genes which are differentially expressed during the GC-induced phenotypic reversion of ST1 cells, using the proteomic approach (2D-PAGE and mass spectrometry) and b) determining the functional role of a gene (Cyclin G) which had previously being identified as being induced during GC-treatment of the ST1 cells. The analytical methodology used relied on the comparison of sets of 2D nuclear protein profiles of ST1 cells, maintained in the absence (control) and in the presence of GC for 5 and 24h. After image analysis and visual validation, 33 polypeptides were considered as differentially represented 5 h after treatment, 16 of which were also differentially represented after 24 h. Six of those polypeptides were identified by peptide mass fingerprinting (PMF). Evidence obtained by Western blot analysis indicates that one of those polypeptides, Annexin 2 (ANX2), has its sub-cellular location modulated by GC-treatment of ST1 cells. The role of Cyclin G in the tumoral to normal phenotypic reversion induced by GC in ST1 cells was analyzed by over-expression of Cyclin G using a retroviral system and evaluation of the effects of this over-expression over ST1 cells response to GC, by growth curve and flow cytometry assays. The data suggest that Cyclin G over-expression leads to a more intense and prolonged effect of GC on ST1 cells.

O efeito dos hormônios glicocorticóides (GC) de suprimir o crescimento celular é exercido através de cascatas celulares nas quais a transcrição de genes de resposta primária, mediada direta ou indiretamente pelo receptor de GC, regulam a transcrição e a atividade de um conjunto de genes, incluindo fatores importantes para a progressão no ciclo celular. Entretanto, a conexão funcional entre diversos dos genes ativados ou inibidos por GC e a inibição da proliferação de determinados tipos celulares ainda não é completamente conhecida. Nosso laboratório isolou a variante ST1, a partir da linhagem C6 de glioma de rato, utilizando-a como modelo de estudo do mecanismo de ação de GC como agentes anti-tumorais. O tratamento com GC confere, às células ST1, um crescimento totalmente dependente de soro e ancoragem, morfologia em cultura semelhante à de fibroblastos normais e incapacidade de gerar tumor em camundongos da linhagem \"nude\", caracterizando uma completa reversão fenotípica tanto in vitro como in vivo. Como abordagens para o entendimento do mecanismo molecular da ação de GCs, o laboratório vem buscando a clonagem de produtos gênicos diferencialmente expressos através do uso de técnicas que permitam a análise da abundância relativa dos mRNAs, e mais recentemente, empregando-se a análise da abundância relativa das proteínas através da eletroforese bidimensional (2D-PAGE). As seqüências isoladas por estas metodologias são alvos potenciais para uma posterior análise funcional. Os objetivos gerais deste trabalho foram: a) identificar genes que estão diferencialmente expressos durante a reversão fenotípica das células ST1 induzida por GC, através da análise proteômica (2D-PAGE e espectrometria de massas) e b) determinar a função de um dos genes (Ciclina G) identificado anteriormente no laboratório como sendo induzido durante o tratamento das células ST1 com GC. A metodologia empregada se baseou na comparação dos perfis 2D de proteínas nucleares das células ST1 tratadas ou não (controle) com GC por 5 e 24h. Após análise de imagem, 33 polipeptídios foram considerados como diferencialmente representados após 5h de tratamento, 16 dos quais foram também identificados após 24h de tratamento. Seis destes polipeptídios foram identificados através da análise dos seus perfis de digestão tríptica (PMF). Evidências obtidas por ensaios de Western blot sugerem que um destes polipeptídeos, a Anexina 2 (ANX2), possui a sua localização sub-celular modulada pela ação de GC nas células ST1. A análise do papel da Ciclina G na reversão fenotípica tumoral-normal das células ST1 induzida por GC, foi feita através da sua super-expressão nestas células, utilizando um sistema retroviral, e avaliando-se os efeitos desta super-expressão sobre a resposta das células ST1 a GC, através de ensaios de curva de crescimento e citometria de fluxo. Os dados sugerem que a super-expressão da Ciclina G nas células ST1 intensifica e prolonga o efeito de GC nestas células. / The glucocorticoid (GC) growth suppression response is controlled through cellular cascades in which the transcription of primary response genes regulates the expression and activity of a diverse set of genes including important factors for cell cycle progression. However, the functional connection between the GC-regulated transcriptional events and cell cycle arrest of determined cells is poorly understood at the molecular level. In this context, our lab has isolated the ST1 variant of the C6 rat glioma cell line to study the mechanism of action of GC as anti-tumor agents. GC treatment leads ST1 cells to a dramatic tumoral to normal phenotypic reversion, characterized by inhibition of their growth rate in monolayer, loss of their ability to form colonies in semi-solid medium and to induce tumor formation in nude mice, and morphological changes (flattening). As part of the strategy to understand the anti-tumor action of GC, differentially represented proteins, associated with the phenotypic reversion displayed by ST1 cells have been isolated through mRNA-based blind cDNA cloning and, more recently, by two dimensional electrophoresis (2D-PAGE). The sequences isolated by these two methodologies are potential targets for functional analysis. In the present study, we aimed at a) identifying genes which are differentially expressed during the GC-induced phenotypic reversion of ST1 cells, using the proteomic approach (2D-PAGE and mass spectrometry) and b) determining the functional role of a gene (Cyclin G) which had previously being identified as being induced during GC-treatment of the ST1 cells. The analytical methodology used relied on the comparison of sets of 2D nuclear protein profiles of ST1 cells, maintained in the absence (control) and in the presence of GC for 5 and 24h. After image analysis and visual validation, 33 polypeptides were considered as differentially represented 5 h after treatment, 16 of which were also differentially represented after 24 h. Six of those polypeptides were identified by peptide mass fingerprinting (PMF). Evidence obtained by Western blot analysis indicates that one of those polypeptides, Annexin 2 (ANX2), has its sub-cellular location modulated by GC-treatment of ST1 cells. The role of Cyclin G in the tumoral to normal phenotypic reversion induced by GC in ST1 cells was analyzed by over-expression of Cyclin G using a retroviral system and evaluation of the effects of this over-expression over ST1 cells response to GC, by growth curve and flow cytometry assays. The data suggest that Cyclin G over-expression leads to a more intense and prolonged effect of GC on ST1 cells.