Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-02-09T15:48:50Z No. of bitstreams: 1 Milena da Silva Albuquerque.pdf: 915379 bytes, checksum: dd414d9f832cb823db0efc59b06ce1fb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-09T15:48:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Milena da Silva Albuquerque.pdf: 915379 bytes, checksum: dd414d9f832cb823db0efc59b06ce1fb (MD5) Previous issue date: 2014-12-17 / The objective of this work was to investigate the occurrence of encoding staphylococcal enterotoxin (sea, seb, sec and seg) genes and the toxin gene 1 of Toxic Shock Syndrome (tst) from Staphylococcus aureus, coming from mastitis cases bovine in the micro region of Garanhuns, State of Pernambuco. 93 isolates from Staphylococcus aureus were analyzed, which were obtained from milk samples from cows with clinical mastitis and subclinical from 17 properties in 11 municipalities of the Micro Region of Garanhuns, State of Pernambuco. For the molecular characterization of the species Staphylococcus aureus, one of the Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed in order to identify the presence of the nuc gene, and to the molecular characterization of enterotoxins, and Staphylococcal toxin Toxic Shock Syndrome. Specific genes were identified: sea, seb, sec, seg and tst. 93 genes were analyzed and we observed the presence of enterotoxigenic gene in 20 (21.6%) samples, of which 11 (55.0%) were positive for tst gene, seven (35.0%) for the sec gene two (10.0%) for the seg gene. 20 isolates amplified segments to the presence of the sec, seg and tst genes. 16 of these (80.0%) were positive for only one gene, and four (20.0%) were positive for both genes (tst and sec). 17 properties were studied, of which seven (41.2%) had positive cultures for at least one of the genes sec, seg and tst. This was the first hit record of encoding gene of the toxin of toxic shock syndrome in mastitis cows milk samples in the state of Pernambuco. Since there was a variation in the distribution of sec, seg and tst genes in strains from different property, it can be inferred that there is genotypic variation in S. aureus strains that cause bovine mastitis. / Objetivou-se com este trabalho pesquisar a ocorrência de genes codificadores de enterotoxinas estafilocócicas (sea, seb, sec e seg) e do gene da toxina 1 da síndrome do choque tóxico (tst) a partir de isolados de Staphylococcus aureus procedentes de casos de mastite bovina na microrregião Garanhuns, estado de Pernambuco. Foram analisados 93 isolados de Staphylococcus aureus obtidos a partir de amostras de leite de vacas com mastite clínica e subclínica, provenientes de 17 propriedades localizadas em 11 municípios da microrregião Garanhuns, no estado de Pernambuco. Para a caracterização molecular da espécie Staphylococcus aureus, foi realizada uma Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) visando a identificação pela presença do gene nuc, assim como para a caracterização molecular das Enterotoxinas Estafilocócicas e da toxina da Síndrome do Choque Tóxico. Foram identificados os genes específicos sea, seb, sec, seg e tst. Dos 93 isolados analisados, observou-se a presença de genes enterotoxigênicos em 20 (21,6%) amostras, das quais 11 (55,0%) foram positivas para o gene tst, sete (35,0%) para o gene sec, duas (10,0%) para o gene seg. Dentre os 20 isolados que amplificaram segmentos para a presença dos genes sec, seg e tst, 16 (80,0%) foram positivos apenas para um gene e quatro (20,0%) foram positivos para dois genes (sec e tst). Das 17 propriedades estudadas, sete (41,2%) apresentaram amostras positivas para pelo menos um dos genes sec, seg e tst. Este foi o primeiro registro de ocorrência do gene codificador da toxina da síndrome do choque tóxico em amostras de leite de vacas com mastite no estado de Pernambuco. Como houve uma variação na distribuição dos genes sec, seg e tst nas cepas procedentes de diferentes propriedades, pode-se inferir que há uma variação genotípica nas cepas de S. aureus que causam mastite bovina.

Introdução: O timo é um órgão linfóide especializado responsável por criar um microambiente propício para a diferenciação e maturação de células T. A quantificação dos níveis de TRECs (círculos excisados durante o rearranjo do TCR) vem sendo utilizada para avaliação e quantificação da função tímica em células do sangue periférico. Estudos que tenham realizado a quantificação dos níveis de TREC em crianças e adolescentes saudáveis brasileiros são escassos na literatura. Objetivo: No presente estudo, avaliamos os níveis de TREC em células mononucleares do sangue periférico associado à análise da expressão de linfócitos T CD3, CD4, CD8, de linfócitos T ativados co-expressando CD38 e HLA-DR e linfócitos T reguladores co-expressando CD25 e Foxp3 em crianças e adolescentes saudáveis em diferentes faixas etárias. Material e métodos: A quantificação dos níveis de sjTREC de DNA genômico em células mononucleares de sangue periférico foi realizada pelo método de PCR quantitativo em tempo real. A concentração de TREC foi expressa em número de cópias de TREC/?g de DNA. A análise da expressão dos marcadores CD3, CD4, CD8, CD38, HLA-DR, CD25 e Foxp3 foi realizada por citometria de fluxo. Resultados: Foram avaliadas 95 crianças e adolescentes, 46 do sexo feminino e 49 do sexo masculino com idades entre 1 e 18 anos. A média do número de cópias de TREC foi de 8,9 ± 3,6 x 104 TRECs/?g DNA. Não encontramos diferença significativa nos valores de TREC entre o sexo feminino e masculino (8,2 ± 3,3 x 104 TRECs/?g DNA vs 9,5 ± 3,9 x 104 TRECs/?g DNA, respectivamente, p = 0,085). Houve uma correlação inversa e significativa entre idade e os níveis de TREC (r = -0,846; p < 0,001), refletindo a já conhecida queda da função tímica com a idade. A expressão de CD3, CD4 e CD8 variou de 45 a 62%, 60 a 65% e 14 a 26%, respectivamente. Não houve correlação significativa entre a proporção de CD3, CD4 e CD8 e a idade dos indivíduos avaliados. Houve uma correlação inversa fraca entre os níveis de linfócitos T ativados expressando CD4+CD38+HLA-DR+ e idade (r = -0,286; p = 0,023), porém não encontramos correlação entre linfócitos T CD8+CD38+HLA-DR+ e idade (r = -0,229; p = 0,072). Houve uma correlação inversa entre os valores de linfócitos T expressando CD4+CD25+Foxp3+ e idade (r = -0,467; p = 0,04). Adicionalmente, encontramos correlação positiva entre a expressão de linfócitos T reguladores e o número de cópias de TREC/?g DNA (r = 0,529; p = 0,02). Conclusão: No presente estudo encontramos uma queda da função tímica com a idade, avaliada pela quantificação dos níveis de TREC em sangue periférico, que se correlacionaram positivamente com a proporção de células T reguladoras em crianças e adolescentes saudáveis. / Introduction: The thymus is a specialized lymphoid organ that is responsible for providing an exclusive microenvironment for T cell maturation and differentiation. The quantification of TREC (T cell receptor excision circle) has been widely used to evaluate and quantify thymic function in peripheral blood cells. Studies that evaluated TREC levels in Brazilian healthy children and adolescents are scarce in the literature. Objective: In the present study, we evaluated the TREC levels in peripheral mononuclear cells associated with the analysis of CD3, CD4, CD8 T cell markers, and activated T cells coexpressing CD38 and HLA-DR, and regulatory T cells co-expressing CD25 and Foxp3 in healthy children and adolescents in different age groups. Material and Methods: The quantification of sjTREC levels in genomic DNA of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) was performed by real time quantitative PCR. TREC concentration was expressed as the number of copies of TREC/?g DNA. The analysis of CD3, CD4, CD8, CD38, HLA-DR, CD25 and Foxp3 expression was performed using flow cytometry methodology. Results: Ninety-five healthy children and adolescents were analyzed, 46 girls and 49 boys. The mean TREC count in PBMC in all individuals was 8.9 ± 3.6 x 104 TRECs/?g DNA. There was no significant difference in the number of TRECs/?g DNA between female and male gender (8.2 ± 3.3 x 104 TRECs/?g DNA vs 9.5 ± 3.9 x 104 TRECs/?g DNA, p = 0.085). There was an inverse correlation between age and TREC counts in PBMC in the 95 individuals (r = -0.846, p < 0.001), reflecting the well-known decrease of thymic function that occurs with age. The expression of CD3, CD4 and CD8 surface markers ranged between 45-62%, 60-65% and 14- 26%, respectively. There was no significant correlation between CD3, CD4 and CD8 proportion and age. There was a weak correlation between activated T cells expressing CD4+CD38+HLA-DR+ and age (r = -0.286; p = 0.023), however there was no significant correlation between T cells expressing CD8+CD38+HLA-DR+ and age (r = -0.229; p = 0.072). There was an inverse correlation between T cells expressing CD4+CD25+Foxp3+ and age (r = -0.467; p = 0.04). Additionally, we also found a positive correlation between CD4+CD25+Foxp3+ values and numbers of TREC/?g DNA in all studied individuals (r = 0.529, p = 0.02). Conclusion: In the present study we found a decrease in the thymic function with age, accessed by the quantification of the TREC level in peripheral blood, which was positively associated with the proportion of regulatory T cells.

Introdução: O timo é um órgão linfóide especializado responsável por criar um microambiente propício para a diferenciação e maturação de células T. A quantificação dos níveis de TRECs (círculos excisados durante o rearranjo do TCR) vem sendo utilizada para avaliação e quantificação da função tímica em células do sangue periférico. Estudos que tenham realizado a quantificação dos níveis de TREC em crianças e adolescentes saudáveis brasileiros são escassos na literatura. Objetivo: No presente estudo, avaliamos os níveis de TREC em células mononucleares do sangue periférico associado à análise da expressão de linfócitos T CD3, CD4, CD8, de linfócitos T ativados co-expressando CD38 e HLA-DR e linfócitos T reguladores co-expressando CD25 e Foxp3 em crianças e adolescentes saudáveis em diferentes faixas etárias. Material e métodos: A quantificação dos níveis de sjTREC de DNA genômico em células mononucleares de sangue periférico foi realizada pelo método de PCR quantitativo em tempo real. A concentração de TREC foi expressa em número de cópias de TREC/?g de DNA. A análise da expressão dos marcadores CD3, CD4, CD8, CD38, HLA-DR, CD25 e Foxp3 foi realizada por citometria de fluxo. Resultados: Foram avaliadas 95 crianças e adolescentes, 46 do sexo feminino e 49 do sexo masculino com idades entre 1 e 18 anos. A média do número de cópias de TREC foi de 8,9 ± 3,6 x 104 TRECs/?g DNA. Não encontramos diferença significativa nos valores de TREC entre o sexo feminino e masculino (8,2 ± 3,3 x 104 TRECs/?g DNA vs 9,5 ± 3,9 x 104 TRECs/?g DNA, respectivamente, p = 0,085). Houve uma correlação inversa e significativa entre idade e os níveis de TREC (r = -0,846; p < 0,001), refletindo a já conhecida queda da função tímica com a idade. A expressão de CD3, CD4 e CD8 variou de 45 a 62%, 60 a 65% e 14 a 26%, respectivamente. Não houve correlação significativa entre a proporção de CD3, CD4 e CD8 e a idade dos indivíduos avaliados. Houve uma correlação inversa fraca entre os níveis de linfócitos T ativados expressando CD4+CD38+HLA-DR+ e idade (r = -0,286; p = 0,023), porém não encontramos correlação entre linfócitos T CD8+CD38+HLA-DR+ e idade (r = -0,229; p = 0,072). Houve uma correlação inversa entre os valores de linfócitos T expressando CD4+CD25+Foxp3+ e idade (r = -0,467; p = 0,04). Adicionalmente, encontramos correlação positiva entre a expressão de linfócitos T reguladores e o número de cópias de TREC/?g DNA (r = 0,529; p = 0,02). Conclusão: No presente estudo encontramos uma queda da função tímica com a idade, avaliada pela quantificação dos níveis de TREC em sangue periférico, que se correlacionaram positivamente com a proporção de células T reguladoras em crianças e adolescentes saudáveis. / Introduction: The thymus is a specialized lymphoid organ that is responsible for providing an exclusive microenvironment for T cell maturation and differentiation. The quantification of TREC (T cell receptor excision circle) has been widely used to evaluate and quantify thymic function in peripheral blood cells. Studies that evaluated TREC levels in Brazilian healthy children and adolescents are scarce in the literature. Objective: In the present study, we evaluated the TREC levels in peripheral mononuclear cells associated with the analysis of CD3, CD4, CD8 T cell markers, and activated T cells coexpressing CD38 and HLA-DR, and regulatory T cells co-expressing CD25 and Foxp3 in healthy children and adolescents in different age groups. Material and Methods: The quantification of sjTREC levels in genomic DNA of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) was performed by real time quantitative PCR. TREC concentration was expressed as the number of copies of TREC/?g DNA. The analysis of CD3, CD4, CD8, CD38, HLA-DR, CD25 and Foxp3 expression was performed using flow cytometry methodology. Results: Ninety-five healthy children and adolescents were analyzed, 46 girls and 49 boys. The mean TREC count in PBMC in all individuals was 8.9 ± 3.6 x 104 TRECs/?g DNA. There was no significant difference in the number of TRECs/?g DNA between female and male gender (8.2 ± 3.3 x 104 TRECs/?g DNA vs 9.5 ± 3.9 x 104 TRECs/?g DNA, p = 0.085). There was an inverse correlation between age and TREC counts in PBMC in the 95 individuals (r = -0.846, p < 0.001), reflecting the well-known decrease of thymic function that occurs with age. The expression of CD3, CD4 and CD8 surface markers ranged between 45-62%, 60-65% and 14- 26%, respectively. There was no significant correlation between CD3, CD4 and CD8 proportion and age. There was a weak correlation between activated T cells expressing CD4+CD38+HLA-DR+ and age (r = -0.286; p = 0.023), however there was no significant correlation between T cells expressing CD8+CD38+HLA-DR+ and age (r = -0.229; p = 0.072). There was an inverse correlation between T cells expressing CD4+CD25+Foxp3+ and age (r = -0.467; p = 0.04). Additionally, we also found a positive correlation between CD4+CD25+Foxp3+ values and numbers of TREC/?g DNA in all studied individuals (r = 0.529, p = 0.02). Conclusion: In the present study we found a decrease in the thymic function with age, accessed by the quantification of the TREC level in peripheral blood, which was positively associated with the proportion of regulatory T cells.

Há um amplo espectro de doenças causadas por estreptococos do grupo A (GAS), e são consideradas um problema de saúde pública em vários países, principalmente os em desenvolvimento, com aproximadamente 600 milhões de casos/ano. As infecções causadas por GAS podem ocasionar doenças invasivas como faringite e pioderma com seqüelas auto-imunes graves como a febre reumática (FR) e glomerulonefrite. A FR acomete principalmente crianças e jovens adultos. A FR apresenta diversas manifestações, sendo a doença reumática cardíaca (DRC) a seqüela mais grave, caracterizada por lesões cardíacas valvares progressivas e permanentes. O tratamento, frequentemente envolve cirurgia cardíaca para a correção de lesões valvulares, o que acarreta alto custo para o Sistema Único de Saúde no Brasil e em vários países. Em trabalhos anteriores sobre os mecanismos desencadeadores das lesões reumáticas no coração, foi possível identificar o papel do linfócito T como mediador principal da autoimunidade, através da análise do receptor de células T infiltrantes de lesão cardíaca de indivíduos com DRC. Várias expansões oligoclonais com diferentes tamanhos da região que reconhece o antígeno, CDR3 foram encontradas. No presente trabalho, analisou-se a atividade tímica através da quantificação de fragmentos circulares excisados pelo rearranjo do gene do receptor do linfócito T (TREC) em linfócitos T de sangue periférico de indivíduos com FR e DRC. Também foi avaliada a presença de células T naïve e de memória através de citometria de fluxo. Os resultados do presente trabalho mostraram que a quantidade de TREC em amostras de sangue periférico do grupo de pacientes com FR/DRC foi significantemente menor quando comparada a observada em indivíduos saudáveis. Interessantemente, em ambos os grupos a quantidade de TREC apresentou correlação negativa com a idade dos indivíduos estudados. Os resultados indicaram diferenças na atividade tímica em pacientes com FR/DRC, provavelmente decorrente do processo autoimune que envolve linfócitos T / There is a wide spectrum of diseases caused by group A streptococci (GAS), that still being considered a public health problem in developing countries, with about 600 million cases per year. Infections by GAS can cause invasive diseases such as pharyngitis and pyoderma leading to serious autoimmune complications such as rheumatic fever (RF) and glomerulonephritis. RF mainly affects children and young adults, and presents different manifestations. Rheumatic heart disease (RHD) is considered the most serious complication leading to valvular lesions that are characterized by progressive and permanent heart damage, which entails high cost to the Public Health System in Brazil and worldwide. In previous works that focused on the mechanisms leading to rheumatic heart lesions, we identified the role of T lymphocytes as principal mediator of autoimmune reactions. Through the in deep analysis of infiltrating T-cell receptor repertoire of patients with RHD, we identified oligoclonal expansions with different sizes of CDR3 that is the region of antigen recognition. In the present study we analyzed the thymic activity through T cell receptor excision circles (TREC) quantification in T cells from peripheral blood of RF/RHD patients. We also evaluated naïve and memory T cells from peripheral blood by flow cytometry. Our results showed that the amount of TREC in the peripheral blood of patients was significantly lower when compared to the healthy individuals. In addition, both groups showed that the amount of TREC is negatively correlated with age. These results indicated that the thymic activity in RF/RHD patients is altered probably due to the autoimmune process that involves T lymphocytes

Há um amplo espectro de doenças causadas por estreptococos do grupo A (GAS), e são consideradas um problema de saúde pública em vários países, principalmente os em desenvolvimento, com aproximadamente 600 milhões de casos/ano. As infecções causadas por GAS podem ocasionar doenças invasivas como faringite e pioderma com seqüelas auto-imunes graves como a febre reumática (FR) e glomerulonefrite. A FR acomete principalmente crianças e jovens adultos. A FR apresenta diversas manifestações, sendo a doença reumática cardíaca (DRC) a seqüela mais grave, caracterizada por lesões cardíacas valvares progressivas e permanentes. O tratamento, frequentemente envolve cirurgia cardíaca para a correção de lesões valvulares, o que acarreta alto custo para o Sistema Único de Saúde no Brasil e em vários países. Em trabalhos anteriores sobre os mecanismos desencadeadores das lesões reumáticas no coração, foi possível identificar o papel do linfócito T como mediador principal da autoimunidade, através da análise do receptor de células T infiltrantes de lesão cardíaca de indivíduos com DRC. Várias expansões oligoclonais com diferentes tamanhos da região que reconhece o antígeno, CDR3 foram encontradas. No presente trabalho, analisou-se a atividade tímica através da quantificação de fragmentos circulares excisados pelo rearranjo do gene do receptor do linfócito T (TREC) em linfócitos T de sangue periférico de indivíduos com FR e DRC. Também foi avaliada a presença de células T naïve e de memória através de citometria de fluxo. Os resultados do presente trabalho mostraram que a quantidade de TREC em amostras de sangue periférico do grupo de pacientes com FR/DRC foi significantemente menor quando comparada a observada em indivíduos saudáveis. Interessantemente, em ambos os grupos a quantidade de TREC apresentou correlação negativa com a idade dos indivíduos estudados. Os resultados indicaram diferenças na atividade tímica em pacientes com FR/DRC, provavelmente decorrente do processo autoimune que envolve linfócitos T / There is a wide spectrum of diseases caused by group A streptococci (GAS), that still being considered a public health problem in developing countries, with about 600 million cases per year. Infections by GAS can cause invasive diseases such as pharyngitis and pyoderma leading to serious autoimmune complications such as rheumatic fever (RF) and glomerulonephritis. RF mainly affects children and young adults, and presents different manifestations. Rheumatic heart disease (RHD) is considered the most serious complication leading to valvular lesions that are characterized by progressive and permanent heart damage, which entails high cost to the Public Health System in Brazil and worldwide. In previous works that focused on the mechanisms leading to rheumatic heart lesions, we identified the role of T lymphocytes as principal mediator of autoimmune reactions. Through the in deep analysis of infiltrating T-cell receptor repertoire of patients with RHD, we identified oligoclonal expansions with different sizes of CDR3 that is the region of antigen recognition. In the present study we analyzed the thymic activity through T cell receptor excision circles (TREC) quantification in T cells from peripheral blood of RF/RHD patients. We also evaluated naïve and memory T cells from peripheral blood by flow cytometry. Our results showed that the amount of TREC in the peripheral blood of patients was significantly lower when compared to the healthy individuals. In addition, both groups showed that the amount of TREC is negatively correlated with age. These results indicated that the thymic activity in RF/RHD patients is altered probably due to the autoimmune process that involves T lymphocytes