Made available in DSpace on 2016-05-19T13:08:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 205.pdf: 1189300 bytes, checksum: c37aa0ffee9705ba62589fa1555f712c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A infecção pelo vírus da dengue é um problema de saúde pública global que põe em risco cerca de 2,5 bilhões de pessoas no mundo, com uma incidência de 50-100 milhões de casos resultando em cerca de 24.000 mortes por ano. Os mecanismos envolvidos na resposta imune inata atuam imediatamente após o contato do hospedeiro com os antígenos virais, levando à secreção de interferon do tipo I (IFN-I), a principal citocina envolvida na resposta antiviral. Entender como o sistema IFN-I é inibido em células infectadas pelo vírus dengue pode fornecer valiosas informações sobre a patogênese da doença. Propomos neste estudo analisar a inibição da via de sinalização do IFN-I por diferentes cepas isoladas no estado de Pernambuco, assim como o desenvolvimento de um vírus recombinante da dengue expressando a proteína Gaussia luciferase, para estudos futuros de replicação e imunopatogênese. A fim de estudar a via de sinalização do IFN-I, foram selecionadas cepas dos quatro sorotipos de dengue para crescimento, concentração e titulação viral. Foi utilizada a linhagem celular BHK-21-ISRE-Luc-Hygro que expressa o gene firefly luciferase fusionado a um promotor induzido pelo IFN-I (ISRE - Interferon Stimulated Response Element). Observamos que todos os sorotipos em estudo foram capazes de inibir, em diferentes proporções, a resposta ou sinalização do IFN-I. Com o intuito de auxiliar as pesquisas em dengue, desenvolvemos um vírus repórter de dengue expressando o gene repórter da Gaussia luciferase. Células transfectadas com o transcrito in vitro de um dos clones resultou em imunofluorescência positiva, porém não houve recuperação de partículas infectivas. Outros clones deverão ser testados para recuperação de vírus recombinante repórter. Juntos, os dados da caracterização das cepas em estudo e a recuperação de partículas infectivas da construção realizada neste trabalho deverão contribuir para as pesquisas em imunopatogênese, replicação viral e desenvolvimento de antivirais contra o dengue

Heterozygous germline defects in a gene encoding a type II receptor for bone morphogenetic proteins (BMPR-II) underlie the majority of inherited cases of the vascular disorder known as pulmonary arterial hypertension (PAH). However, the precise molecular consequences of PAH causing mutations on the function of the receptor complex remain unclear. We employed novel enzymatic and fluorescence activity based techniques to assess the impact of PAH mutations on pre-mRNA splicing, nonsense-mediated decay (NMD) and receptor complex interactions. We demonstrate that nonsense and frameshift mutations trigger NMD, providing further evidence that haplo-insufficiency is a major molecular consequence of disease-related BMPR2 mutations. We identified heterogeneous functional defects in BMPR-II activity, including impaired type I receptor phosphorylation, receptor interactions and altered receptor complex stoichiometry leading to perturbation of downstream signalling pathways. Importantly, these studies demonstrate that the intracellular domain of BMPR-II is both necessary and sufficient for receptor complex interaction. Finally and to address the potential for resolution of stoichiometric balance, we investigated an agent that promotes translational readthrough of a BMPR2 nonsense reporter construct without interfering with the NMD pathway. We propose that stoichiometric imbalance, due to either haplo-insufficiency or loss of optimal receptor-receptor interactions impairs BMPR-II mediated signalling in PAH. Taken together, these studies have identified an important target for early therapeutic intervention in familial PAH.