Made available in DSpace on 2015-05-19T13:30:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 2013mayara-mmc.pdf: 1411074 bytes, checksum: 2521ca963e0a676d61e1a93252efa84f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A febre da dengue (FD) e a febre hemorrágica da dengue (FHD) têm emergido como as mais importantes doenças causadas por arbovírus em áreas tropicais. A forma mais grave da doença, a FHD, apresenta taxa de mortalidade geralmente entre 1 por cento e 10 por cento e requer hospitalização e um cuidadoso controle hemodinâmico dos pacientes. O interferon do tipo I (IFN-I), IFN-alfa/beta, juntamente com o IFN tipo do II (IFN-II), IFN-gama, são fundamentais na mediação da resposta antiviral, através da modulação da resposta imune para inibir a propagação viral. No presente trabalho, propomos o estudo da resposta imune inata ao vírus da dengue (DENV), com ênfase no IFN-I. Para isso, investigamos os níveis de expressão dos genes que codificam os IFN-I e IFN-II, utilizando cDNA, obtido de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de pacientes infectados com o DENV, através do sistema de PCR em tempo real (qPCR), e analisamos os níveis de IFN-I no soro dos mesmos pacientes pelo ELISA. Avaliamos, também, a via de sinalização do IFN-I em células infectadas por diferentes cepas do DENV, utilizando a linhagem celular BHK21pISRELucHygro, que possui em seu genoma um plasmídeo que contém como promotor o ISRE (região responsiva ao IFN-I) fusionado ao gene repórter luciferase. A quantificação do IFN-I das PBMCs, por qPCR, mostrou que os pacientes acometidos com a FHD, com até 5 dias de febre, expressaram níveis mais elevados do IFN-I quando comparados aos pacientes acometidos pela FD. Enquanto, os níveis séricos de IFN-alfa dos pacientes FD e FHD, quantificados através do ELISA, mostraram níveis similares, representando um padrão diferente do observado nos transcritos de IFN-I em PBMCs. No entanto, os níveis séricos de IFN-gama foram significativamente maiores em pacientes FHD, confirmando o padrão observado na quantificação por qPCR / Por fim, na análise da via de sinalização do IFN-I via expressão da luciferase em células BHK21pISRELucHygro após infecção por diferentes cepas do DENV foi observado que esses isolados clínicos possuíram a capacidade de inibir a via em diferentes proporções

Made available in DSpace on 2015-10-23T12:45:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 thiago_pinto_ioc_mest_2013.pdf: 2486105 bytes, checksum: 868a236b9a638adc77cfb2312e1f391d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A indução da via de interferon (IFN) do tipo I (IFN-\03B1 e -\03B2) é crucial para uma resposta protetora contra infecções virais. Entretanto, estudos recentes demonstraram que esta classe de IFNs tem a ativação mediada por receptores citoplasmáticos de DNA e regula negativamente a resposta protetora contra a infecção por bactérias intracelulares, com destaque para o Mycobacterium tuberculosis, criando um nicho favorável para a replicação micobacteriana. Um estudo anterior do nosso grupo, utilizando uma abordagem de expressão gênica global por microarranjos, demonstrou que a infecção de células de Schwann com Mycobacterium leprae induz genes ativados por IFN do tipo I, com destaque para o gene OASL, o qual codifica a proteína 2\2019 5\2019 oligoadenilato sintetase like. No presente estudo, esses resultados foram estendidos e validados utilizando o modelo de macrófagos derivados de célulasTHP-1. Nossos dados demonstram que a OASL foi induzida por M. leprae vivo, mas não M. bovis BCG ou M. leprae morto. Adicionalmente, a transfecção de DNA de M. leprae, mas não de RNA, induziu a produção de OASL. Em nosso modelo, a infecção por M. leprae não foi capaz de induzir a produção de IFN-\03B1, assim como o tratamento CpG não induziu OASL, excluindo assim a sinalização de DNA mediada por TLR9 Além disso, mostramos evidências da permeabilização fagossomal mediada pelo fator de virulência micobacteriano ESAT-6, a qual permite acesso do conteúdo do fagossomo ao citoplasma e, consequente, produção de IFN-\03B2. O bloqueio farmacológico de TBK1 foi capaz de inibir a produção de OASL mediada pela infecção com M. leprae, indicando, dessa forma, que a indução de IFN-\03B2 e seus genes a jusante, como o OASL, ocorre através do eixo de sinalização STING/TBK1/IRF3. Interessantemente, o silenciamento gênico de OASL resultou na redução da viabilidade intracelular do M. leprae juntamente com redução da liberação da quimiocina CCL2/MCP-1 induzida por M. leprae. Entretanto, a transfecção de DNA seguida por infecção com M. bovis BCG foi capaz de reverter o fenótipo avirulento dessa bactéria, aumentado sua viabilidade intracelular e induzindo altos níveis de CCL2/MCP-1. Dessa maneira, nossos dados sugerem que a ativação da via de IFN tipo I é, de fato, capaz de inibir a reposta protetora do hospedeiro contra micobactérias, criando um ambiente favorável para a sobrevivência da micobactéria no ambiente intracelular, representando assim um potencial alvo para intervenções farmacológicas e/ou prevenção / The induction of interferon pathway (IFN) type I (IFN - α and - β ) is crucial for a protective response against viral infections. However, emergent research has shown that type I IFNs and cytoplasmic DNA signaling ar e negative regulators of the protective response against infection by in tracellular bacteria, such as Mycobacterium tuberculosis , and provide a favorable niche for mycobacterial replication. Recently, using an approach of global gene expression by microar r ay, our group showed that Schwann cells infection with Mycobacterium leprae induced genes activated by IFN type I, highlighting the OASL gene, which encodes the 2 '5' oligoadenylate synthetase like protein. In the present work , these results were extended and validated using the THP - 1 - derived macrophages m odel . Our data demonstrate that OASL and type I IFN pathway was upregulated by M. leprae , but not M. bovis BCG or dead M. leprae , in macrophage - like THP - 1 infected cells. In addition, M. leprae DNA transfection but not RNA, was able to induce OASL production . In our model, M. leprae infection was not able to induce IFN - α and OASL was not induced by CpG, therefore excluding a TLR9 dependent pathway. Furthermore, we show evid ence of fagossomal permeabilization mediated by mycobacterial virulence factor ESAT - 6, which enables access of contents of the phagosome to host cytoplasm and subsequent induction of IFN - β. Pharmacological blockag e of TBK1 was able to inhibit M. leprae - ind uced OASL mRNA expression, indicating thereby that the IFN - β induction and its downstream genes, such as OASL occur through the STING/TBK1/IRF3 pathway . Interestingly, OASL targeted silencing directly decreased intracellular M. leprae survival and impaired the CCL2/MCP - 1 secretion. Furthermore, M. leprae DNA transfection followed by infection with M. bovis BCG has reverted the avirulent infection phenotype of this mycobacteria, increasing its intracellular viability and inducing high levels of CCL2/ MCP - 1. Together , these results suggest that OASL plays an important role in the response to mycobacteria and provide a potential pharmacological target for prevention or intervention

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:08:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 205.pdf: 1189300 bytes, checksum: c37aa0ffee9705ba62589fa1555f712c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A infecção pelo vírus da dengue é um problema de saúde pública global que põe em risco cerca de 2,5 bilhões de pessoas no mundo, com uma incidência de 50-100 milhões de casos resultando em cerca de 24.000 mortes por ano. Os mecanismos envolvidos na resposta imune inata atuam imediatamente após o contato do hospedeiro com os antígenos virais, levando à secreção de interferon do tipo I (IFN-I), a principal citocina envolvida na resposta antiviral. Entender como o sistema IFN-I é inibido em células infectadas pelo vírus dengue pode fornecer valiosas informações sobre a patogênese da doença. Propomos neste estudo analisar a inibição da via de sinalização do IFN-I por diferentes cepas isoladas no estado de Pernambuco, assim como o desenvolvimento de um vírus recombinante da dengue expressando a proteína Gaussia luciferase, para estudos futuros de replicação e imunopatogênese. A fim de estudar a via de sinalização do IFN-I, foram selecionadas cepas dos quatro sorotipos de dengue para crescimento, concentração e titulação viral. Foi utilizada a linhagem celular BHK-21-ISRE-Luc-Hygro que expressa o gene firefly luciferase fusionado a um promotor induzido pelo IFN-I (ISRE - Interferon Stimulated Response Element). Observamos que todos os sorotipos em estudo foram capazes de inibir, em diferentes proporções, a resposta ou sinalização do IFN-I. Com o intuito de auxiliar as pesquisas em dengue, desenvolvemos um vírus repórter de dengue expressando o gene repórter da Gaussia luciferase. Células transfectadas com o transcrito in vitro de um dos clones resultou em imunofluorescência positiva, porém não houve recuperação de partículas infectivas. Outros clones deverão ser testados para recuperação de vírus recombinante repórter. Juntos, os dados da caracterização das cepas em estudo e a recuperação de partículas infectivas da construção realizada neste trabalho deverão contribuir para as pesquisas em imunopatogênese, replicação viral e desenvolvimento de antivirais contra o dengue

A imunoterapia baseada em MoDC constitui uma estratégia para tratamento de indivíduos HIV+. Protocolos para obtenção de MoDC em geral utilizam IL-4 e GM-CSF (IL4-DC). Alguns estudos utilizam as IFN-DC (IFN-α + GM-CSF), que exibem um fenótipo combinado de DC mielóide, DC plasmocitóide (pDC) e célula NK. Esse perfil misto pode aperfeiçoar a imunoterapia para pacientes HIV+. Para tanto, monócitos de pacientes HIV+ foram cultivados com GM-CSF e IL-4 ou IFN-α por 5 dias e estimuladas por 48 horas com pulso de HIV inativado por AT-2 e/ou coquetel de citocinas pró-inflamatórias. Avaliamos a expressão de moléculas de superfície de IFN-DC e ativação de linfócitos T por citometria de fluxo; produção de citocinas IL-12 e IL-10 por ELISA. IFN-DC apresentaram morfologia e fenótipo basais ativados e características de pDC e célula NK, diferente das IL4-DC. As IFN-DC foram capazes de produzir IL-12, estimular a proliferação e produção de IFN-γ de linfócitos TCD4 e CD8, porém similares às IL4-DCs. IFN-DC são capazes de estimular resposta de linfócitos T tanto quanto IL4-DC. / Immunotherapy based on MDDCs is a strategy for treating HIV-infected patients. Alternatively to the conventional protocol for DC differentiation based on IL-4 and GM-CSF (IL4-DC) some studies suggest the use of IFN-DC (IFN-α + GM-CSF). These cells exhibit a combined phenotype of myeloid DC, plasmacytoid DC (pDC) and NK. Considering the mixed profile of IFN-DCs alternative protocols can bring novel elements for immunotherapy. Monocytes isolated from HIV-infected patients were cultured in the presence of GM-CSF and IL-4 or IFN-α. On day 5 DCs were pulsed with AT-2-inactivated HIV and stimulated for 48 hours with a cocktail of proinflammatory cytokines. We assessed IFN-DC surface markers expression and T cell activation by flow cytometry; IL-10 and IL-12 production by ELISA. IFN-DC showed activated morphological and phenotypic features during basal state of maturity and exhibited features of pDC and NK different from IL4-DC. The IFN-DC like IL4-DC were able to produce IL-12 and stimulated T cells. So, the IFN-DC were able to stimulate the T cells as well as IL4-DCs.

A imunoterapia baseada em MoDC constitui uma estratégia para tratamento de indivíduos HIV+. Protocolos para obtenção de MoDC em geral utilizam IL-4 e GM-CSF (IL4-DC). Alguns estudos utilizam as IFN-DC (IFN-α + GM-CSF), que exibem um fenótipo combinado de DC mielóide, DC plasmocitóide (pDC) e célula NK. Esse perfil misto pode aperfeiçoar a imunoterapia para pacientes HIV+. Para tanto, monócitos de pacientes HIV+ foram cultivados com GM-CSF e IL-4 ou IFN-α por 5 dias e estimuladas por 48 horas com pulso de HIV inativado por AT-2 e/ou coquetel de citocinas pró-inflamatórias. Avaliamos a expressão de moléculas de superfície de IFN-DC e ativação de linfócitos T por citometria de fluxo; produção de citocinas IL-12 e IL-10 por ELISA. IFN-DC apresentaram morfologia e fenótipo basais ativados e características de pDC e célula NK, diferente das IL4-DC. As IFN-DC foram capazes de produzir IL-12, estimular a proliferação e produção de IFN-γ de linfócitos TCD4 e CD8, porém similares às IL4-DCs. IFN-DC são capazes de estimular resposta de linfócitos T tanto quanto IL4-DC. / Immunotherapy based on MDDCs is a strategy for treating HIV-infected patients. Alternatively to the conventional protocol for DC differentiation based on IL-4 and GM-CSF (IL4-DC) some studies suggest the use of IFN-DC (IFN-α + GM-CSF). These cells exhibit a combined phenotype of myeloid DC, plasmacytoid DC (pDC) and NK. Considering the mixed profile of IFN-DCs alternative protocols can bring novel elements for immunotherapy. Monocytes isolated from HIV-infected patients were cultured in the presence of GM-CSF and IL-4 or IFN-α. On day 5 DCs were pulsed with AT-2-inactivated HIV and stimulated for 48 hours with a cocktail of proinflammatory cytokines. We assessed IFN-DC surface markers expression and T cell activation by flow cytometry; IL-10 and IL-12 production by ELISA. IFN-DC showed activated morphological and phenotypic features during basal state of maturity and exhibited features of pDC and NK different from IL4-DC. The IFN-DC like IL4-DC were able to produce IL-12 and stimulated T cells. So, the IFN-DC were able to stimulate the T cells as well as IL4-DCs.

O melanoma maligno é uma forma de câncer com alto índice de morte devido, em parte, à falta de tratamentos eficazes e à sua tendência de formar metástases. Nosso grupo tem desenvolvido vetores virais para a transferência gênica de fatores anti-tumorais e, inicialmente, foi construído um vetor adenoviral, AdPG, no qual a expressão do transgene é controlada por p53, um supressor de tumor e fator de transcrição. Sendo que aproximadamente 90% dos casos de melanoma retêm p53 selvagem, foi proposto que isto pudesse ser utilizado como uma ferramenta para dirigir a expressão do transgene codificado pelo vetor AdPG, um mecanismo apoiado por resultados anteriores de nosso grupo. Por exemplo, a transdução de células B16 (melanoma de camundongo, p53-selvagem, deleção de p19Arf) com vetores AdPG portadores de p19Arf ou interferon-<font face=\"Symbol\">b (IFN<font face=\"Symbol\">b) resultou em morte celular maciça enquanto a transferência de apenas um destes fatores isolados não causou o mesmo efeito. O trabalho descrito aqui inclui dois avanços tecnológicos críticos em comparação com trabalhos anteriores do grupo. Primeiramente, os transgenes de interesse (eGFP, p19Arf e IFN<font face=\"Symbol\">b) foram inseridos num vetor adenoviral que apresenta o tripetídeo RGD na sua proteína fibra. Essa modificação no vetor permite a eficiente transdução de um amplo espectro de células alvos sem a dependência do receptor viral do adenovírus selvagem, CAR. Além disso, foi construído um vetor bicistrônico, que contém a combinação de ambos os genes terapêuticos, como forma de garantir a transferência dos dois fatores ao mesmo tempo para as células-alvo. A inclusão de p19Arf, um supressor de tumor e inibidor de MDM2, como um gene terapêutico deve complementar as atividades do p53 celular endógeno e, como consequência, atuar na promoção da expressão a partir do vetor e também na inibição da proliferação das células tumorais. Porém, a transferência de p19Arf sozinho acarretaria efeito somente nas células que foram transduzidas e, então, seu efeito seria limitado. Por este motivo, descreve-se, além do p19Arf, a utilização de IFN<font face=\"Symbol\">b, uma proteína secretada com funções anti-tumorais, incluindo inibição de angiogênese, indução de apoptose e ativação da resposta imunológica. A estratégia do projeto contemplou vários níveis relacionados ao mecanismo do processo de transferência, incluindo a eficiência da transdução, o mecanismo de controle da expressão dos transgenes e as atividades dos transgenes. Assim, foi proposto que a combinação de p19Arf e IFN<font face=\"Symbol\">b pudesse ser uma estratégia interessante para induzir morte no tumor primário e uma resposta imunológica contra as células metastáticas. Com este projeto, foi iniciada a construção destes novos vetores aprimorados para transferência gênica nas células de melanoma. / Malignant melanoma is a type of cancer with high death rates, in part, because of a lack of efficient treatments and its tendency to generate metastases. Our group has developed viral vectors for the gene transfer of anticancer factors and, initially, we constructed an adenoviral vector, AdPG, in which transgene expression is controlled by p53, a tumor suppressor and transcription factor. As 90% of melanoma cases maintain wild-type p53, it was proposed that this could be used as a tool to drive transgene expression encoded by the AdPG vector, as evidenced by previous studies from our group. For example, transduction of B16 cells (mouse melanoma, wild-type p53, p19Arf-null) with vectors encoding p19Arf or interferon-<font face=\"Symbol\">b (IFN<font face=\"Symbol\">b) resulted in massive death cell, while transfer of just one of these factors alone did not cause the same effect. The work described here includes two critical technologic advances in comparison with our previous work. First, transgenes of interest (eGFP, p19Arf and IFN<font face=\"Symbol\">b) were inserted into an adenoviral vector which presents the RGD tripeptide in its fiber. This vector modification allows efficient transduction in a wide range of target cells without dependence on the wild type adenovirus receptor, CAR. In addition, a bicistronic vector was constructed which contains the combination of both therapeutic genes, ensuring the transfer of both factors to the target cells at the same time. Use of p19Arf, a tumor suppressor and MDM2 inhibitor, as a therapeutic gene should complement endogenous p53 activities and, as a consequence, promote expression from the AdPG vector and inhibit tumor cell proliferation. However, p19Arf gene transfer alone should have an effect only in transduced cells and, therefore, its effect would be limited. For this reason, we describe, in addition to p19Arf, the application IFN<font face=\"Symbol\">b, a secreted protein with antitumor functions, including inhibition of angiogenesis, induction of apoptosis and activation of immunologic response. This strategy involves several mechanistic levels related with the gene transfer process, including transduction efficiency, control over transgene expression and transgene activity. Therefore, it was proposed that the combination of p19Arf and IFN<font face=\"Symbol\">b could be an interesting strategy to induce primary tumor death and an immunologic response against metastatic cells. In this project, the construction of new vectors optimized for gene transfer in melanoma cells was initiated.

Introdução: a síndrome antifosfolípide (SAF) primária é uma vasculopatia autoimune mediada por autoanticorpos com trombose como sua principal manifestação clínica. A presença de anticorpos antifosfolípides (aPL), embora relevante para confirmar o diagnóstico, não parece ser suficiente para explicar completamente a fisiopatologia da doença e um segundo gatilho é usualmente necessário. Além das hipóteses de infecções virais e insulto inflamatório como possíveis desencadeantes, parece que os receptores toll like (TLR) e o Interferon (IFN) tipo I são possíveis protagonistas nesse processo, contribuindo para o início da trombose. Recentemente, dois pequenos estudos demonstraram que uma porcentagem relevante de pacientes com SAF primária tem uma regulação positiva de genes IFN em células mononucleares do sangue periférico (CMSP). Entretanto, 20% e 28% dos pacientes nessas duas coortes tiveram anticorpos anti-dsDNA positivos, um autoanticorpo altamente específico do lúpus eritematoso sistêmico (LES). Objetivo: avaliar se os pacientes com SAF bem caracterizados apresentam assinatura para interferon nas células mononucleares periféricas. Secundariamente foram avaliadas possíveis associações clínico laboratoriais com a assinatura de IFN. Métodos: foram selecionados 53 pacientes do sexo feminino com diagnóstico de SAF primária de acordo com os critérios de Sidney, com idade igual ou maior a 18 anos, selecionados no Ambulatório de SAF da Disciplina de Reumatologia do HCFMUSP, pareados por sexo e idade com 50 controles saudáveis. Um terceiro grupo com 29 paciente com antecedente de trombofilias não imunomediadas também foi incluido. Após a coleta de sangue as CMSPs foram purificadas por metodologia de Ficoll. A expressão gênica das CMSPs foi realizada através do TaqMan® RNA Assay em placas TLDA. Foram pesquisados 41 genes induzidos por IFN (GIIs). Uma análise de componente principal (ACP) foi realizada para determinar quais genes deveriam compor a assinatura de IFN. O teste de z-score foi utilizado para normalizar e calcular a assinatura de IFN para cada paciente. O cutoff da assinatura de IFN foi definido por uma curva ROC, e foi escolhido o ponto que maximizava a sensibilidade e especificidade. Características demográficas, clínicas e laboratoriais foram analisadas buscando por associações com a assinatura de IFN. Resultados: 11 genes estavam superexpressos nos pacientes com SAF em comparação aos controles. Após a análise de ACP foram escolhidos 6 genes que representavam mais de 95% do comportamento da amostra para compor a assinatura de IFN: DNAJA1, IFI27, IFI6, IFIT5, MX1 e TYK2. O cutoff encontrado pela curva ROC foi de 3,9 folds (AUC = 0,706, S = 0,49, E = 0,86, VPP = 0,79, VPN = 0,61). A assinatura de IFN estava presente em 49% dos pacientes com SAF primário vs. 14% dos controles saudáveis e 17% dos controles positivos (p < 0,001). Foi encontrada associação entre a assinatura de IFN e uma ocorrência mais precoce do primeiro evento clínico (p = 0,023), e com ocorrência de eventos obstétricos (em especial pré-eclâmpsia, p = 0,032). Não foi econtrada nenhuma associação entre a assinatura de IFN e número de eventos trombóticos, exames laboratoriais, comorbidades, antecedentes familiares de doenças autoimunes, e escores de risco de retrombose. De todos os tratamentos em uso a única associação encontrada foi entre uma menor assinatura de IFN e o uso de estatinas (p = 0,026). Conclusão: esse estudo indica que pacientes com SAF primária bem caracterizados apresentam uma assinatura de IFN tipo I, não observada em outras trombofilias não imunidade-mediadas ou em controles saudáveis. Também demonstrou-se que essa superexpressão de genes regulados por IFN tipo I está associada a um início mais precoce dos eventos e pré-eclâmpsia. Mais estudos são necessários para determinar se este subgrupo de pacientes se beneficiará de intervenções terapêuticas direcionadas à via de sinalização IFN tipo I / Introduction: primary antiphospholipid syndrome (PAPS) is an autoimmune vasculopathy mediated by autoantibodies with thrombosis as its main clinical manifestation. The presence of antiphospholipid antibodies, while relevant to confirm the diagnosis, does not seem to be sufficient to fully explain the pathophysiology and a second trigger is usually needed. Besides the hypotheses of viral infections and inflammatory insult as possible triggers, type I Interferon (IFN) has been pointed as a possible protagonist. Recently, two studies have demonstrated that a relevant percentage of PAPS patients have an up-regulation of IFN genes in peripheral blood mononuclear cells (PBMC). However, 20% and 28% of patients in these 2 cohorts, had antidsDNA positive antibodies, a highly specific Systemic Lupus Erythematosus (SLE) autoantibody. Objective: The aim of this study is to determine the prevalence of type I IFN signature in PBMC of patients with PAPS without specific SLE autoantibodies and search for it with clinical and laboratorial associations. Methods: 53 PAPS patients (according to Sydney´s criteria) were consecutively selected and age-matched with 50 healthy controls. A third group, with non-immune-mediated thrombophilia patients, was also included. The expression of 41 IFN induced genes was analysed using real time quantitative PCR (TaqMan Low Density Array). A principal component analysis (PCA) was used to determine which genes should compose the IFN signature and z-score was calculated. The IFN signature score cut-off was defined with a ROC curve, as the point that maximized both the specificity and sensitivity. Clinical and laboratorial features were analysed searching for associations with IFN signature. Results: 11 IFN genes were highly expressed in primary APS patients. After PCA, 6 genes remained in the IFN signature: DNAJA1, IFIT5, IFI27, MX1, IFI6, TYK2. The ROC cutoff was 3,9 folds (AUC = 0.706, S = 0.49, E = 0.86, VPP = 0.79, VPN = 0.61). The type I IFN signature was present in 49% of patients with primary APS compared to 14.0% of healthy controls and 17% of non-immune-mediated thrombophilia patients (p < 0.0001). The mean IFN score was significantly higher in PAPS patients (4.0 fold higher, p < 0.0001) than in controls. A higher IFN signature was associated with a younger age at the first APS event (p = 0.023) and with the presence of obstetric events, especially with preeclampsia (p = 0.032). There was no association between IFN signature and number of thrombotic events, laboratory exams, comorbidities, family history of autoimmune diseases, and thrombosis risk scores. Treatment with statins was associated with lower levels of IFN scores (p = 0.026). Conclusion: our result indicates that PAPS patients, without lupus specific antibodies, have an enhanced type I IFN gene signature, not observed in non-immune mediated thrombophilia. We also provide novel data demonstrating that this overexpression of type I IFN-regulated genes is associated with an earlier onset of APS events and preeclampsia. Further studies are necessary to determine if this subgroup of patients will benefit of interventions targeting the type I IFN signalling pathway

Introdução: a síndrome antifosfolípide (SAF) primária é uma vasculopatia autoimune mediada por autoanticorpos com trombose como sua principal manifestação clínica. A presença de anticorpos antifosfolípides (aPL), embora relevante para confirmar o diagnóstico, não parece ser suficiente para explicar completamente a fisiopatologia da doença e um segundo gatilho é usualmente necessário. Além das hipóteses de infecções virais e insulto inflamatório como possíveis desencadeantes, parece que os receptores toll like (TLR) e o Interferon (IFN) tipo I são possíveis protagonistas nesse processo, contribuindo para o início da trombose. Recentemente, dois pequenos estudos demonstraram que uma porcentagem relevante de pacientes com SAF primária tem uma regulação positiva de genes IFN em células mononucleares do sangue periférico (CMSP). Entretanto, 20% e 28% dos pacientes nessas duas coortes tiveram anticorpos anti-dsDNA positivos, um autoanticorpo altamente específico do lúpus eritematoso sistêmico (LES). Objetivo: avaliar se os pacientes com SAF bem caracterizados apresentam assinatura para interferon nas células mononucleares periféricas. Secundariamente foram avaliadas possíveis associações clínico laboratoriais com a assinatura de IFN. Métodos: foram selecionados 53 pacientes do sexo feminino com diagnóstico de SAF primária de acordo com os critérios de Sidney, com idade igual ou maior a 18 anos, selecionados no Ambulatório de SAF da Disciplina de Reumatologia do HCFMUSP, pareados por sexo e idade com 50 controles saudáveis. Um terceiro grupo com 29 paciente com antecedente de trombofilias não imunomediadas também foi incluido. Após a coleta de sangue as CMSPs foram purificadas por metodologia de Ficoll. A expressão gênica das CMSPs foi realizada através do TaqMan® RNA Assay em placas TLDA. Foram pesquisados 41 genes induzidos por IFN (GIIs). Uma análise de componente principal (ACP) foi realizada para determinar quais genes deveriam compor a assinatura de IFN. O teste de z-score foi utilizado para normalizar e calcular a assinatura de IFN para cada paciente. O cutoff da assinatura de IFN foi definido por uma curva ROC, e foi escolhido o ponto que maximizava a sensibilidade e especificidade. Características demográficas, clínicas e laboratoriais foram analisadas buscando por associações com a assinatura de IFN. Resultados: 11 genes estavam superexpressos nos pacientes com SAF em comparação aos controles. Após a análise de ACP foram escolhidos 6 genes que representavam mais de 95% do comportamento da amostra para compor a assinatura de IFN: DNAJA1, IFI27, IFI6, IFIT5, MX1 e TYK2. O cutoff encontrado pela curva ROC foi de 3,9 folds (AUC = 0,706, S = 0,49, E = 0,86, VPP = 0,79, VPN = 0,61). A assinatura de IFN estava presente em 49% dos pacientes com SAF primário vs. 14% dos controles saudáveis e 17% dos controles positivos (p < 0,001). Foi encontrada associação entre a assinatura de IFN e uma ocorrência mais precoce do primeiro evento clínico (p = 0,023), e com ocorrência de eventos obstétricos (em especial pré-eclâmpsia, p = 0,032). Não foi econtrada nenhuma associação entre a assinatura de IFN e número de eventos trombóticos, exames laboratoriais, comorbidades, antecedentes familiares de doenças autoimunes, e escores de risco de retrombose. De todos os tratamentos em uso a única associação encontrada foi entre uma menor assinatura de IFN e o uso de estatinas (p = 0,026). Conclusão: esse estudo indica que pacientes com SAF primária bem caracterizados apresentam uma assinatura de IFN tipo I, não observada em outras trombofilias não imunidade-mediadas ou em controles saudáveis. Também demonstrou-se que essa superexpressão de genes regulados por IFN tipo I está associada a um início mais precoce dos eventos e pré-eclâmpsia. Mais estudos são necessários para determinar se este subgrupo de pacientes se beneficiará de intervenções terapêuticas direcionadas à via de sinalização IFN tipo I / Introduction: primary antiphospholipid syndrome (PAPS) is an autoimmune vasculopathy mediated by autoantibodies with thrombosis as its main clinical manifestation. The presence of antiphospholipid antibodies, while relevant to confirm the diagnosis, does not seem to be sufficient to fully explain the pathophysiology and a second trigger is usually needed. Besides the hypotheses of viral infections and inflammatory insult as possible triggers, type I Interferon (IFN) has been pointed as a possible protagonist. Recently, two studies have demonstrated that a relevant percentage of PAPS patients have an up-regulation of IFN genes in peripheral blood mononuclear cells (PBMC). However, 20% and 28% of patients in these 2 cohorts, had antidsDNA positive antibodies, a highly specific Systemic Lupus Erythematosus (SLE) autoantibody. Objective: The aim of this study is to determine the prevalence of type I IFN signature in PBMC of patients with PAPS without specific SLE autoantibodies and search for it with clinical and laboratorial associations. Methods: 53 PAPS patients (according to Sydney´s criteria) were consecutively selected and age-matched with 50 healthy controls. A third group, with non-immune-mediated thrombophilia patients, was also included. The expression of 41 IFN induced genes was analysed using real time quantitative PCR (TaqMan Low Density Array). A principal component analysis (PCA) was used to determine which genes should compose the IFN signature and z-score was calculated. The IFN signature score cut-off was defined with a ROC curve, as the point that maximized both the specificity and sensitivity. Clinical and laboratorial features were analysed searching for associations with IFN signature. Results: 11 IFN genes were highly expressed in primary APS patients. After PCA, 6 genes remained in the IFN signature: DNAJA1, IFIT5, IFI27, MX1, IFI6, TYK2. The ROC cutoff was 3,9 folds (AUC = 0.706, S = 0.49, E = 0.86, VPP = 0.79, VPN = 0.61). The type I IFN signature was present in 49% of patients with primary APS compared to 14.0% of healthy controls and 17% of non-immune-mediated thrombophilia patients (p < 0.0001). The mean IFN score was significantly higher in PAPS patients (4.0 fold higher, p < 0.0001) than in controls. A higher IFN signature was associated with a younger age at the first APS event (p = 0.023) and with the presence of obstetric events, especially with preeclampsia (p = 0.032). There was no association between IFN signature and number of thrombotic events, laboratory exams, comorbidities, family history of autoimmune diseases, and thrombosis risk scores. Treatment with statins was associated with lower levels of IFN scores (p = 0.026). Conclusion: our result indicates that PAPS patients, without lupus specific antibodies, have an enhanced type I IFN gene signature, not observed in non-immune mediated thrombophilia. We also provide novel data demonstrating that this overexpression of type I IFN-regulated genes is associated with an earlier onset of APS events and preeclampsia. Further studies are necessary to determine if this subgroup of patients will benefit of interventions targeting the type I IFN signalling pathway

O melanoma maligno é uma forma de câncer com alto índice de morte devido, em parte, à falta de tratamentos eficazes e à sua tendência de formar metástases. Nosso grupo tem desenvolvido vetores virais para a transferência gênica de fatores anti-tumorais e, inicialmente, foi construído um vetor adenoviral, AdPG, no qual a expressão do transgene é controlada por p53, um supressor de tumor e fator de transcrição. Sendo que aproximadamente 90% dos casos de melanoma retêm p53 selvagem, foi proposto que isto pudesse ser utilizado como uma ferramenta para dirigir a expressão do transgene codificado pelo vetor AdPG, um mecanismo apoiado por resultados anteriores de nosso grupo. Por exemplo, a transdução de células B16 (melanoma de camundongo, p53-selvagem, deleção de p19Arf) com vetores AdPG portadores de p19Arf ou interferon-<font face=\"Symbol\">b (IFN<font face=\"Symbol\">b) resultou em morte celular maciça enquanto a transferência de apenas um destes fatores isolados não causou o mesmo efeito. O trabalho descrito aqui inclui dois avanços tecnológicos críticos em comparação com trabalhos anteriores do grupo. Primeiramente, os transgenes de interesse (eGFP, p19Arf e IFN<font face=\"Symbol\">b) foram inseridos num vetor adenoviral que apresenta o tripetídeo RGD na sua proteína fibra. Essa modificação no vetor permite a eficiente transdução de um amplo espectro de células alvos sem a dependência do receptor viral do adenovírus selvagem, CAR. Além disso, foi construído um vetor bicistrônico, que contém a combinação de ambos os genes terapêuticos, como forma de garantir a transferência dos dois fatores ao mesmo tempo para as células-alvo. A inclusão de p19Arf, um supressor de tumor e inibidor de MDM2, como um gene terapêutico deve complementar as atividades do p53 celular endógeno e, como consequência, atuar na promoção da expressão a partir do vetor e também na inibição da proliferação das células tumorais. Porém, a transferência de p19Arf sozinho acarretaria efeito somente nas células que foram transduzidas e, então, seu efeito seria limitado. Por este motivo, descreve-se, além do p19Arf, a utilização de IFN<font face=\"Symbol\">b, uma proteína secretada com funções anti-tumorais, incluindo inibição de angiogênese, indução de apoptose e ativação da resposta imunológica. A estratégia do projeto contemplou vários níveis relacionados ao mecanismo do processo de transferência, incluindo a eficiência da transdução, o mecanismo de controle da expressão dos transgenes e as atividades dos transgenes. Assim, foi proposto que a combinação de p19Arf e IFN<font face=\"Symbol\">b pudesse ser uma estratégia interessante para induzir morte no tumor primário e uma resposta imunológica contra as células metastáticas. Com este projeto, foi iniciada a construção destes novos vetores aprimorados para transferência gênica nas células de melanoma. / Malignant melanoma is a type of cancer with high death rates, in part, because of a lack of efficient treatments and its tendency to generate metastases. Our group has developed viral vectors for the gene transfer of anticancer factors and, initially, we constructed an adenoviral vector, AdPG, in which transgene expression is controlled by p53, a tumor suppressor and transcription factor. As 90% of melanoma cases maintain wild-type p53, it was proposed that this could be used as a tool to drive transgene expression encoded by the AdPG vector, as evidenced by previous studies from our group. For example, transduction of B16 cells (mouse melanoma, wild-type p53, p19Arf-null) with vectors encoding p19Arf or interferon-<font face=\"Symbol\">b (IFN<font face=\"Symbol\">b) resulted in massive death cell, while transfer of just one of these factors alone did not cause the same effect. The work described here includes two critical technologic advances in comparison with our previous work. First, transgenes of interest (eGFP, p19Arf and IFN<font face=\"Symbol\">b) were inserted into an adenoviral vector which presents the RGD tripeptide in its fiber. This vector modification allows efficient transduction in a wide range of target cells without dependence on the wild type adenovirus receptor, CAR. In addition, a bicistronic vector was constructed which contains the combination of both therapeutic genes, ensuring the transfer of both factors to the target cells at the same time. Use of p19Arf, a tumor suppressor and MDM2 inhibitor, as a therapeutic gene should complement endogenous p53 activities and, as a consequence, promote expression from the AdPG vector and inhibit tumor cell proliferation. However, p19Arf gene transfer alone should have an effect only in transduced cells and, therefore, its effect would be limited. For this reason, we describe, in addition to p19Arf, the application IFN<font face=\"Symbol\">b, a secreted protein with antitumor functions, including inhibition of angiogenesis, induction of apoptosis and activation of immunologic response. This strategy involves several mechanistic levels related with the gene transfer process, including transduction efficiency, control over transgene expression and transgene activity. Therefore, it was proposed that the combination of p19Arf and IFN<font face=\"Symbol\">b could be an interesting strategy to induce primary tumor death and an immunologic response against metastatic cells. In this project, the construction of new vectors optimized for gene transfer in melanoma cells was initiated.

As células tumorais prosperam como consequência da capacidade de resistir aos mecanismos de morte celular e de evasão da vigilância imunológica. Nós propomos que, em cânceres que possuem o supressor de tumor p53 selvagem, a remediação de ambas dessas defesas pode ser promovida pela transferência genica combinada de vetores adenovirais portadores dos transgenes de p19Arf (proteína supressora de tumor, parceira funcional de p53) e de interferon-beta (IFNbeta, citocina imunomoduladora). De fato, em resultados anteriores, notamos que a transdução combinada (p19Arf/IFNbeta), mas não os tratamentos individuais, em células de melanoma murino B16F10 resulta em aumento massivo de morte celular. Porém a capacidade destas células em processo de morte de desencadear imunidade antitumoral não foi analisada. Nesta tese e em estudos complementares, buscamos investigar os mecanismos moleculares de morte celular envolvidos na resposta imune estimulada por p19Arf/IFNbeta e explorar sua aplicação como imunoterapia do câncer. Inicialmente, em modelo de vacinação profilática, revelamos que o tratamento combinado em células B16F10 promove a expressão de IL-15, ULBP1, dos receptores de morte FAS/APO1 e KILLER/DR5, assim como uma resposta de células natural killer que rejeitam estas células tratadas quando inoculadas em camundongos imunocompetentes singênicos. Após desafio tumoral no flanco oposto, a progressão desses tumores foi fortemente reduzida devido ao engajamento de linfócitos T CD4+ e CD8+, que apresentaram produção aumentada das citocinas IFN-? e TNF-alfa e medeiam proteção antitumoral de longo prazo. Em seguida, explorando um contexto de imunização diferente, a transferência de gênica in situ foi realizada em carcinoma heterotópico de pulmão e exibiu proteção significativa contra um desafio tumoral secundário, apenas quando o tumor primário foi tratado com p19Arf/IFNbeta. Análise de transcriptoma destes tumores indicou uma assinatura quimiotáxica de neutrófilos e linfócitos T CD8+ através das quimiocinas CCL3, CXCL3 e da IL-1beta. Em apoio destas observações, análises mecanicistas in vitro revelaram que células tratadas com p19Arf/IFNbeta ativam programas apoptóticos de p53 e antivirais de IFNbeta, enquanto sucumbem a um processo de morte por necroptose que também libera moléculas de morte celular imunogênica (MCI), calreticulina, ATP e HMGB1. No entanto, procurando potencializar ainda mais o benefício terapêutico dos nossos vetores, exploramos sua associação com o quimioterápico imunogênico doxorrubicina (Dox), que também é indutor de MCI. E nesta associação, percebemos que a Dox aumenta não apenas os níveis de morte celular, mas também a imunogenicidade das células tratadas, proporcionando em um modelo de vacina terapêutica, um controle tumoral superior em camundongos que já portavam antes da vacinação tumores B16F10 ou MCA205. Além disso, a associação in situ destas terapias restaurou a eficácia de uma dose sub-terapêutica de Dox, que em contraste com sua dose terapêutica, não prejudica a função cardíaca. Finalmente, também exploramos a associação com o bloqueio dos pontos de controle imunológicos PD-1 ou CTLA-4, que no modelo de vacina terapêutica, sua associação induziu maior rejeição completa de tumores B16F10. Em conclusão, aqui apresentamos evidências sobre a capacidade da combinação p19Arf/IFNbeta de induzir morte celular e estimulação imunológica. E ressaltamos seu potencial como uma estratégia de imunoterapia do câncer / Cancer cells thrive as a consequence of resisting cell death mechanisms and escaping from immune surveillance. We propose that, in cancers that harbor the wild-type tumor suppressor p53, remediation of both of these defenses can be achieved by harnessing the adenoviral vector mediated gene transfer of p19Arf (tumor suppressor protein, p53 functional partner) together with interferon-beta (IFNbeta, immunomodulatory cytokine). Indeed, in our initial observations, it was noticed that combined-transduction (p19Arf/IFNbeta), but not the individual treatments, of B16F10 mouse melanoma cells results in massive cell death levels. Yet, the capability of these dying cells to unleash antitumor immunity was not investigated. Here in this thesis and in complementary studies, we sought to investigate the molecular mechanisms of cell death involved in the p19Arf/IFNbeta immune stimulation and explore its potential as a mediator of cancer immunotherapy. First, in a prophylactic B16F10 vaccine model, we revealed that the dual treatment led to the up-regulation of IL-15, ULBP1, FAS/APO1 and KILLER/DR5 death receptors, plus a natural killer cell response that completely rejects treated cells when inoculated in syngeneic immunocompetent mice. Whereas, upon a contralateral tumor challenge, progression was strongly reduced by engaging both CD4+ and CD8+ T cells, which displayed augmented production of IFN-? and TNF-alpha cytokines and provided long term antitumor protection. Next, exploring different immunization context, in situ gene transfer in a heterotopic lung carcinoma exhibited significant protection against a secondary tumor challenge only when the primary tumor was treated with p19Arf/IFNbeta. Transcriptome analysis of these treated tumors indicated a chemotaxic signature of neutrophils and CD8+ T cells with the involvement of CCL3, CXCL3 chemokines and IL-1beta. Moreover, in support of this evidence, mechanistic in vitro studies revealed that p19Arf/IFNbeta treated cells reactivate p53 apoptotic and IFNbeta antiviral programs, while succumbing to a necroptosis cell death processes that also releases immunogenic cell death (ICD) molecules, calreticulin, ATP and HMGB1. Yet, aiming to potentiate therapeutic benefit of our vectors, we explored their association with doxorubicin (Dox) immunogenic chemotherapy, which is also an inducer of ICD. And in this setting, this association with Dox enhances not only cell death levels but also immunogenicity of treated cells, providing superior tumor control in a therapeutic vaccine model, where mice were already bearing B16F10 tumors or MCA205 sarcomas before vaccination. Moreover, associated use of these therapies in situ rescued efficacy of a sub-therapeutic dose of Dox, which in contrast to its therapeutic dose, does not impair cardiac function. Finally, we also evaluated the association with PD-1 or CTLA-4 checkpoint blockade immunotherapy, which in the therapeutic vaccine model induced full tumor rejection in a greater number of mice. In sum, here we provide compelling evidence for the ability of the p19Arf/IFNbeta combined gene transfer to promote cell death and immunogenic stimuli and underscored its potential to be applied as a cancer immunotherapy strategy